Name: Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez les mécanismes moléculaires de sécrétion des hormones intestinales et d'absorption des nutriments grâce à l'intestin grêle isolé perfusé de rat. Cette technique physiologique maintient l'intestin in situ pour des études détaillées.

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Ce travail a été soutenu par une subvention sans restriction de Prof. Jens Juul Holst depuis le centre de Novo Nordisk recherche métabolique fondamentale (Novo Nordisk Foundation, Danemark), une subvention distincte de la Novo Nordisk Fondation pour faire les études de perfusion rongeur (subvention no. NNF15OC0016574), une subvention de Prof. Holst de l’European Research Council (Grant no.695069) et l’Union européenne est septième Programme-cadre de recherche, de TechnologicalDevelopment et de démonstration (Grant no 266408), mais aussi un post-doctorant accorder aux Rune E. Kuhre de la fondation de Lundbeck (R264-2017-3492). Nous remercions Jenna E. Hunt et Carolyn F. Deacon pour la relecture attentive.

Toutes les études ont été effectuées avec l’autorisation de l’inspection d’expériences animales danois (2013-15-2934-00833) et le Comité d’éthique local, conformément aux directives de la réglementation danoise concernant l’expérimentation animale (1987) et le National Instituts de la santé (numéro de publication 85-23).
1. des animaux
<ol><li>Obtenir des rats Wistar mâles (250 g) et 2 par cage, avec un accès ad libitum à chow standard et de l’eau, la maison et maintenir dans un 12:12 h cycle lumière-obscurité. Nos installations d’animaux utilise de l’eau non traitée et Alrtromin rongeur chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Danemark). Remarque : Laissez des animaux au moins une semaine d’acclimatation.</li>
</ol>2. préopératoires préparations
<ol><li>Faire le tampon de perfusion : tampon bicarbonate Krebs-Ringer additionné de 0,1 % de BSA (fraction V), le dextran 5 % T-70, 3,5 mmol/L de glucose et de 5 mmol/L pyruvate, fumarate et glutamate (si nécessaire) ; pH de 7,4.</li>
	<li>Préparer une quantité suffisante de tampon de perfusion en filtrant à travers une taille appropriée du filtre et ajuster le pH à ~7.5 par l’addition de goutte à goutte 5 M HCL.</li>
	<li>Ajoutez 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (si nécessaire) directement dans la mémoire tampon sur le jour de l’étude à une concentration finale de 10 µM. Remarque : IBMX est un inhibiteur de la phosphodiestérase qui augmente [cAMP]j’ai et restaure ainsi la sensibilité et la réactivité de l’intestin en sécrétant des hormones à un stimulus sécrétoire.</li>
	<li>Préparer la solution d’essai (s). Préparer des stimuli vasculaires à un 20 x concentration plus élevée que la concentration finale souhaitée dans le tampon de perfusion filtré et pH ajusté. Préparer des stimuli luminaux test dans une solution saline isotonique dans la concentration finale.</li>
	<li>Dissoudre des composés non solubles à 100 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et diluer plus loin dans la mémoire tampon de perfusion ou une solution saline isotonique. Pour des stimuli vasculaires, garder la concentration finale de DMSO à 1 % ou moins, en concentrations ci-dessus cela endommager l’intestin et peut conduire à la sécrétion de l’hormone intestinale non spécifique. Mesurer le pH et ajuster à ~7.5 si nécessaire.</li>
</ol>3. fonctionnement et Perfusion
Remarque : Une illustration d’une installation de perfusion est fournie à la Figure 1.
<ol><li>Anesthésier les rats par utilisation d’un régime d’anesthésique qui peut supporter l’anesthésie chirurgicale et analgésie pendant 30-40 min par Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g de poids corporel, par ml : Hypnorm : fentanyl 0,08 mg, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg Parahydroxybenzoate de méthyle, 0,05 mg Parahydroxybenzoate de propyle, Midazolam : 1,25 mg, matrice Pharmaceuticals, Hellerup, Danemark)</li>
	<li>Vérifier par manque de réflexes (pincement de l’orteil), placez le rat sur la table d’opération chauffée et effectuer une incision de la peau pour exposer l’intestin.</li>
	<li>
Exposer la partie terminale du côlon en déplaçant le petit intestin côté autant que possible. Cravate de fournir la vascularisation du côlon et de l’accise progressivement à partir de la partie terminale du côlon, se déplaçant vers l’intestin grêle.
	<ol>
<li>Si seulement une certaine partie de l’intestin grêle est nécessaire pour la perfusion (la moitié supérieure), exciser les segments non requis après un score nul hors fourniture de système vasculaire. Pour minimiser les lésions tissulaires, hydrater l’intestin avec une solution saline isotonique et utiliser des écouvillons pour enlever les tissus conjonctifs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insérer un tube en plastique (longueur : environ 15 cm, diamètre extérieur : ~0.4 cm) dans la lumière intestinale (dans la partie proximale) et la cravate correctement à l’aide de sutures. Rincer soigneusement avec une solution saline isotonique (température ambiante) pour vider le lumen du chyme.</li>
	<li>Perfuse la lumière avec la solution saline isotonique à un débit de 0,25 mL/min, à l’aide d’une seringue de 10 mL reliée à une pompe à seringue.</li>
	<li>Écarter l’intestin donc l’artère mésentérique supérieure est accessible et enlever le tissu conjonctif et de graisse pour exposer l’artère.</li>
	<li>Placer deux sutures sous l’artère mésentérique à l’aide de pinces à pointe fine ; une des sutures est levée l’artère pour contrôler le saignement une fois que l’artère a été coupée et l’autre pour fixer le cathéter qui doit être placé dans l’artère. Prenez attention de ne pas perforer l’artère.</li>
	<li>Placez deux sutures sous la veine pour fixer le cathéter métallique qui va être placé dans la veine de collecte des effluents de la perfusion.</li>
	<li>Avant de couper le trou dans l’artère mésentérique, veiller à ce que le cathéter qui va en inséré dans l’artère est rempli avec le tampon de perfusion pour empêcher la formation d’embolie air.</li>
	<li>Découper un petit trou dans l’artère mésentérique, à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux et insérer le cathéter en plastique immédiatement après.</li>
	<li>Immédiatement après que le cathéter a été obtenu, ouvrir la perfusion intestinale par le démarrage de la pompe à rouleaux (débit = 7,5 mL/min).</li>
	<li>Confirmer que les vaisseaux sanguins dans le tube digestif pâlissent en quelques secondes, et la veine devient pâle.</li>
	<li>Immédiatement après qu’une perfusion correcte a été établie, découper un trou dans la veine porte, insérer le cathéter métallique et le fixer avec la suture. Remarque : Le cathéter peut être difficile de lieu mais soulevant la veine en tirant prudemment l’aide de suture plus proximal.</li>
	<li>Une fois que les cathéters sont en place et sortie de perfusion est satisfaisante, tuer le rat par perforation de la membrane, en veillant à ne pas arracher les cathéters.</li>
	<li>Récupérer la sortie de perfusion pendant 1 min et mesurer le volume. Commencer aux pression de perfusion acquisition/enregistrements en cliquant sur Exécuter expérience dans le programme d’enregistrement de la pression.</li>
	<li>Couvrir le tube digestif avec un tissu humide pour l’empêcher de se dessécher pendant l’expérience.</li>
	<li>Veiller à ce que l’extrémité distale de l’intestin n’est pas bloquée pour que l’effluent Luminale peut sortir, sinon l’intestin vont gonfler, œdème mettra au point, augmenter la pression de perfusion et sortie de perfusion va baisser.</li>
	<li>Laisser la préparation pendant environ 30 min avant de commencer l’expérience. Remarque : Les sorties de sécrétion d’hormones du tube digestif sont très instables pendant les 15 premières min de perfusion, donc cette étape d’équilibration est nécessaire pour obtenir une ligne de base stable.</li>
</ol>4. expérience
<ol><li>Après environ 30 min de perfusion, lancer le test en recueillant le premier échantillon de référence à l’aide d’un collecteur de fraction. Prélever des échantillons à l’intervalle de temps souhaité (par exemple, toutes les minutes, 6,5 et 7,5 mL sont habituellement perçue) et placez-les sur la glace dans quelques minutes.</li>
	<li>
Inspecter le barboteur régulièrement et si vide, remplissez-le avec le tampon de perfusion.
	<ol>
<li>Recueillir la mémoire tampon par la robinet-vanne à trois voies immédiatement avant d’entrer dans l’orgue et du cathéter inséré dans la veine porte (une fois elle a été perfusée par l’orgue) pour confirmer que l’orgue est métaboliquement active. Prélever des échantillons en début et en fin d’expérience visant à évaluer la viabilité tout au long de l’expérience.</li>
		<li>Mesurer les échantillons rapidement, avec un analyseur automatisé-gaz du sang, contient plus de plastiques ou de seringues ne sont pas parfaitement étanches, donnant lieu à échanger avec l’air atmosphérique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après 10-15 min de collection de base, stimuler avec la première substance d’essai. Administrer les stimulations intra-artérielle avec un pousse-seringue par un robinet à trois voies (débit = 0,350 mL/min).</li>
	<li>Effectuer les stimulations luminales par une injection de bolus initial (2,5 mL/min pendant les 5 premières minutes), en remplacement de la solution saline isotonique qui est déjà dans la lumière, suivie par l’administration de la solution de test un débit plus faible (0,5 mL/min).</li>
	<li>Afin que la lumière est rapidement vidée de substance d’essai, une fois que la période de stimulation Luminale, rincer la lumière intestinale avec une solution saline isotonique en appliquant les mêmes débits comme ci-dessus.</li>
	<li>Prélever des échantillons de référence pendant 15-30 min avant la prochaine substance d’essai est administrée. Selon le protocole, les 2-3 test stimulus peuvent généralement être inclus par expérience. Si le protocole expérimental comprend activation/inhibition d’un site donné moléculaire en même temps que l’administration d’un sécrétagogue donné, toujours pré stimuler avec l’inhibiteur de l’activateur/10-15 min avant l’administration de la sécrétagogue à s’assurer que le site moléculaire est inhibé au tout début de la perfusion sécrétagogue.</li>
	<li>À la fin du protocole, administrer (5-10 min) un témoin positif adapté afin de tester la réactivité de la préparation et de prélever des échantillons de référence de 10-15 min après la période de stimulation. Remarque : Plusieurs test de substances peuvent être utilisés comme témoin positif, par exemple, les stimulants du croissant [cAMP]j’ai (par exemple, foskolin ou IBMX), [Ca2 +]i (p. ex., la bombésine ou neuromédine C), agents de dépolarisation (p. ex., 30-50 mM KCl) ou plus des stimuli physiologiquement pertinents tels que les macronutriments : glucose, acides aminés, peptones, etc.. Toutefois, le choix du contrôle positif dépend des résultats expérimentaux. Le glucose est par exemple un sécrétagogue pauvre cholécystokinine (CCK) considérant que la bombésine n’est pas un sécrétagogue robuste pour insulinotrope glucose-dépendant de la sécrétion du peptide (GIP)30.</li>
	<li>Après la fin de l’expérience, d’accise l’intestin perfusé, peser et mesurer sa longueur. Mettez-le dans la paraformaldéhyde et stocker (4 ° C) pour plus tard histochimique analyse du potentiel de l’intégrité/lésions tissulaires, par exemple par une coloration H & E.</li>
</ol>5. biochimiques
<ol><li>Quantifier les concentrations de peptides sécrétés dans l’effluent veineux par utilisation d’un interne ou disponible dans le commerce des dosages radioimmunologiques (RIA) ou des tests ELISA. Pour les études qui examinent l’absorption intestinale, quantifier la molécule d’intérêt, par exemple, de glucose ou d’acides aminés, dans l’effluent veineux. Remarque : Le perfusat est généralement un bon tampon basale pour la plupart des analyses, y compris les tests qui s’appuie sur les réactions enzymatiques (tels que le dosage du glucose par la méthode de l’oxydase).</li>
</ol>6. analyse de données
<ol><li>Présenter les données de différentes façons, par exemple comme un graphique de temps-concentration illustrant la production réelle de sécrétion (débit x concentration) et en tant que parcelle de colonne représentant le total sécrétrice de sortie pendant les périodes de référence et d’intervention (généralement 10 à 15 points dans le temps).</li>
	<li>Tracer la concentration réelle mesurée des hormones respectifs comme des unités de concentration. (pmol/L), Remarque : Il est préférable d’exprimer plutôt données en sortie (fmol/min) car avec ce modèle, contrairement aux études in vivo, les valeurs obtenues sont la production de sécrétion réelle (en raison de la collection constante de l’effluent de la perfusion).</li>
	<li>Selon le nombre de groupes à analyser statistiquement, usage bilatéral couplé t-test (deux groupes) ou ANOVA à mesures répétées (plus de deux groupes) suivie d’un test post hoc appropriées pour les comparaisons multiples.</li>
</ol>

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<li>Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proglucagon+gene+transcription+by+protein+kinase-A+in+a+novel+mouse+enteroendocrine+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line.</a> Molecular Endocrinology. 8, Baltimore, Md. 1646-1655 (1994).</li>
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</ol>

Les auteurs de ces travaux déclarent sans conflits d’intérêts potentiels pertinents à cet article.

L’intestin grêle de rat perfusée isolé est un outil de recherche performant qui permet la dynamique et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale à étudier en détail. L’étape la plus critique pour le succès de la production de données avec ce modèle est l’opération chirurgicale. Manipulation de l’intestin entraînera inévitablement des dommages à l’intestin et devrait donc être réduite au strict minimum. Plus important encore, la vitesse de fonctionnement est la clé, en particulier ...

L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’absorption des nutriments et de disposition des éléments nutritifs, de croissance intestinale et modulent l’appétit1. Hormones du tube digestif sont, par conséquent, impliqués dans de nombreux processus physiologiques fondamentaux, et de comprendre ces schémas de sécrétion et les détails moléculaires qui contrôlent la sécrétion des hormones respectifs est donc importante pour notre physiologiques de base compréhension et pour traiter des aspects translationnelles des actions de l’hormone intestinale ; Mais comment on peut étudier les mécanismes moléculaires de détection qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale ? En général, la sécrétion de l’hormone peut être étudiée dans les organismes intacts (les humains ou les animaux de laboratoire), de préparations d’intestin isolé ou de cultures de cellules primaires de tube digestif sécrétant des hormones ou immortalisé cell cultures2,3, 4 , 5 , 6. notre modèle préféré est l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, qui est un modèle physiologiquement pertinent qui permet la sécrétion d’hormones du tube digestif à étudier en détail avec une résolution temporelle optimal (sécrétion taux peuvent être déterminés avec n’importe quel moment base à la seconde), et les résultats sont probables transférable à une situation in vivo7. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur la façon d’effectuer cette procédure, mais tout d’abord nous allons discuter d’autres méthodes pour étudier la sécrétion de l’hormone intestinale, y compris les avantages et les limites de ces modèles par rapport à l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.
Si l'on veut établir si un composé spécifique régule la sécrétion de certaines hormones du tube digestif, les études chez l’humain sont le but ultime. Ainsi, si un composé montre des effets considérables sur la sécrétion d’une ou plusieurs hormones intestinale chez les rongeurs (in vivo ou perfusions) ou d’hormones sécrétant des cellules (lignées cellulaires ou cellules primaires), cet effet est uniquement pertinent à la médecine et de physiologie humaine si elle peut être confirmée chez l’homme. Cependant, il y a des limites claires pour le type d’études qui peuvent être effectuées chez l’humain, et des études in vivo sur les animaux de laboratoire sont donc souvent la deuxième-meilleure option pour de telles études. Souris et les rats sont les animaux de laboratoire le plus souvent utilisés sans doute en raison de leur taille pratique, faible coût et la possibilité de modifier génétiquement les gènes soupçonnés d’implication dans les questions de l’étude spécifique (par exemple, frapper hors certains transporteur ou récepteurs). En général, les modèles in vivo gagnerait à être physiologiquement intact, mais aussi présentent plusieurs limites. Surtout, la petite taille des rongeurs, en particulier les souris, est un facteur limitant, comme la plupart dosages pour la quantification d’hormone intestinale nécessitent au moins 20 µL de plasma (et souvent beaucoup plus), ce qui signifie qu’au moins 100 µL de sang doit être retirée pour faire un duplicata quantification. Par conséquent, il n’est possible d’obtenir de très peu d’échantillons correspondant aux échantillons de départ et un ou deux échantillons après stimulation (le volume sanguin total chez une souris de 20 g est ~1.4 mL). Par conséquent, les réponses sécrétrices potentiels (par exemple, rapidement ou réponses tardive survenant) peut donc manquer.
Dans le modèle de la perfusion, ce problème est surmonté, comme échantillon de grand volumes sont obtenues (débit : 7,5 mL/min) et les intervalles de la collection peuvent être ajustés selon les besoins pour s’assurer que les réponses rapides et de courte durée ne sont pas ratés (nous recueillir les échantillons toutes les min)7 . Un autre problème avec études in vivo chez les rongeurs est que la plupart des hormones intestin sont encore plus rapidement éliminé ou métabolisé que chez les humains8,9,10, ce qui peut compliquer l’analyse biochimique qui. Par exemple, nous avons montré que le GLP-1 est métabolisé chez les souris à un rythme encore plus rapide que chez les humains (où T1/2 est 1-2 min11) et, plus important encore, que le clivage du GLP-1 chez les souris implique, outre un clivage N-terminale de dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (qui est l’enzyme dégradant majeur de GLP-1 chez l’homme), plus le clivage par l’enzyme endopeptidase neutre 24.1112. En conséquence, les tests commerciaux actuellement pour la quantification du GLP-1, qui reposent soit sur l’isoforme intact du GLP-1 (7-36amide) ou l’isoforme de la DPP-4 clivé (9-39amide), largement sous-estiment la sécrétion de GLP-1 chez les souris et entraînent trompeuse des résultats 12. dans l’intestin grêle de rat isolé et perfusé, la plupart du métabolisme des hormones sécrétées est éliminé ou sensiblement réduit, puisque la dégradation induite par le plasma est évitée, et extraction de foie/rein/poumon/dégradation est empêchée (parce que perfusat est perçue comme il laisse le tube digestif).
Bien sûr, un aperçu important peut être généré par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, par exemple, sodium-glucose transporteur-1 knockout souris13, mais nécessite une évaluation détaillée des sondes moléculaires impliqués dans la sécrétion souvent examen des sites moléculaires multiples, allant des transporteurs moléculaires de canaux ioniques et des différents récepteurs couplés aux protéines G de protéines intracellulaires. Par exemple, nous avons ciblé l’activité des neuf sites moléculaires différentes lors de démêler les capteurs moléculaires responsables de la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose7. Une enquête similaire ne serait pas possible in vivo, comme certains des composés utilisés imprécise ou effets nocifs/létaux. Par exemple, lorsque vous utilisez l’intestin perfusé, il a été possible d’évaluer le rôle du métabolisme du glucose intra-cellulaire de la sécrétion de GLP-1 et la neurotensine en bloquant la formation d’ATP avec 2-4-dinitrophénol7,14 , mais aussi le rôle de canaux voltage-dépendants de calcium des acides biliaires stimulent de la sécrétion de GLP-1, NT et PYY3. En effet, la tétrodotoxine de bloqueur de canal sodium hautement toxique peut être appliquée avec succès dans les études de perfusion. Enfin, dans le modèle de perfusion il peut être directement évaluée où dans le tube digestif un certain composé stimule la sécrétion d’une hormone de certains, que l’enquêteur peut simplement choisir et préparer la région souhaitée pour perfuse, et en même temps, elle peut être étudiée Si un stimulus provoque la sécrétion par l’activation des capteurs moléculaires du côté luminal ou vasculaire de l’intestin3,15,16.
Les mécanismes de sécrétion sécrétion intestinale sous-jacente peut également être étudiée par utilisent des morceaux de tissu de tube digestif (y compris les tissus humains), hormone de cultures primaires intestinale (habituellement des souris), immortalisés sécrétant des lignées cellulaires (de souris ou d’origine humaine), de l’intestin tissu monté dans des chambres de Ussing ou en organoïdes (à la fois plus souvent des souris)2,3,4,5,6,17,18. Par rapport aux perfusions intestinales, études sur les pièces de l’intestin humain, cultures de cellules primaires et des lignées cellulaires sont techniquement plus faciles à réaliser et sont un moyen plus rapide et moins coûteux de produire des données, mais bien sûr l’étude des morceaux de tube digestif requiert l’accès à l’intestin humain frais spécimens. Toutefois, dans ces modèles la polarisation normale des cellules de l’intestin est intrinsèquement perdue, ce qui signifie que ces modèles ne peuvent servir à évaluer l’activation normale de sondes moléculaires, et processus d’absorption ne peuvent également être étudiés. En outre, ces études utilisent habituellement des incubations statiques (pour jusqu'à plusieurs h) qui est hautement non physiologiques et n’a rien à voir avec dynamique de sécrétion normale LiPo, parce que le produit sécrété n’est pas supprimé et donc vos commentaires peuvent influencer le sécrétion d’hormones. En revanche, dans l’intestin perfusé, molécules sécrétées et absorbés sont efficacement éliminés par la microcirculation muqueuse de car ils sont in vivo, respecter les gradients transmuqueux donc absorption et sécrétion peuvent se produire à un rythme normal. En outre, cultures de cellules peuvent avoir dedifferentiated de leur origine de cellules entéroendocrines native, ce qui signifie qu’ils ne sont plus représentant des cellules natives en termes de contenu de peptide et l’expression des sondes moléculaires, même si elles peuvent encore sécrètent l’hormone en question. Par exemple, c’est le cas pour le GLP-1 sécrétrices cellules lignes19.
C’est, par conséquent, nous estimons que les cultures de cellules primaires ou cellule ligne études sont plus adaptés pour fins de sélection et pour réaliser des expériences de types qui ne peuvent être exécutées en vivo ou dans l’intestin perfusé isolé. Par exemple, une véritable force des cultures de cellules primaires et cultures de cellules de ligne est que secondaire intra-cellulaire messagers (p. ex. Ca2 +, cAMP, NAD(P)H) peut être surveillé en temps réel et signalisation électrique de la cellules qui sécrètent l’hormone peut être étudié le20,21,22. En outre, knockdown de siARN peut être fait, ce qui est particulièrement utile si des inhibiteurs spécifiques ne sont pas disponibles20,21,22,23,24. Tissu d’intestin des souris montés dans des chambres de Ussing a récemment été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents situé sur la sécrétion stimulée acides biliaires de GLP-1, tout en organoïdes intestinale (de souris) et morceaux d’intestin humain ont également été utilisés pour étudier les détails moléculaires du tube digestif sécrétion de l’hormone17,25. Alors que les premières prestations d’être polarisé2 tous ces modèles comportent des incubations statiques. Études sur des bouts de l’intestin humain, cependant, bénéficient de l’utilisation de tissus humains, plutôt que de rongeurs, ce qui est important comme différence des espèces dans l’expression de tissu de 7mc récepteurs et transporteurs moléculaires peuvent entraîner différentes voies moléculaires de détection entre espèces. En fait, la plupart des données dans ce domaine a été générées par des études sur des porcs, de souris ou de rats, et il reste insaisissable, si ces résultats peuvent être transférées aux humains. Toutefois, il est rassurant que les mécanismes de détection moléculaires qui sous-tendent la sécrétion stimulée par le glucose du GLP-1 semblent être comparables entre souris, rat, man, et transcriptomique et peptidomic identification des souris et de L-cellules humaines a révélé fort global similitudes entre les deux espèces7,18,26,27.
L’intestin grêle de rat isolé et perfusé, cependant, a aussi des limites qui devraient être considérés. Plus important encore, il est impossible de déterminer si une réponse sécrétoire donnée résulte d’une activation directe de la substance d’essai des cellules productrices de l’hormone ciblées est ou plutôt causée par un mécanisme indirect. Par exemple, KCl instantanément augmente la sécrétion de GLP-1 de l' intestin perfusé7, mais on ne sait toujours pas si c’est une conséquence de la dépolarisation directe de la L-cellule ou résulte de la dépolarisation des neurones à proximité des L-cellules ou des effets de publié simultanément paracrine stimulateurs/inhibiteurs. Données issues d’études utilisant l’intestin perfusé, qui visent à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion, par conséquent, toujours soient mises en contexte avec les données obtenues à partir d’autres modèles plus spécifiques pour augmenter la capacité d’établir lien de causalité. Par exemple, la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose de la lignée de cellules sécrétrices du GLP-1 GLUTag28,29 et de souris primaire L-cellules dépendent de l’activité des transporteurs de glucose (SGLT1 et GLUT2). Blocage de ces transporteurs dans l’intestin grêle de rat perfusée atténue également la sécrétion20, ce qui signifie qu’il est probable que la sécrétion de GLP-1 stimulée par le glucose est largement médiatisée par les actions directes du glucose sur la cellule de L. Une autre limitation importante de l’intestin isolé perfusé est que certains des lipides sont difficiles à étudier en raison de leur hydrophobicité. Bien qu’il soit possible d’étudier les produits finaux de la digestion des lipides (acides gras, diacyl glycérols, lysophosphatidylglycerols, etc.) et même si la préparation peut être en mesure de re-estérifier les lipides intra- intracellulaires et peut-être les emballer dans les chylomicrons, le transport des chylomicrons hors des cellules et leur adoption ultérieure par les lacteals des villosités est perturbée, puisque la circulation de la lymphe dans l’intestin isolé ne peut pas être sécurisée. Très probablement, par conséquent, absorption des lipides est interrompue une fois que les produits absorbés commencent à s’accumuler dans les cellules. Les systèmes cellulaires in vitro sont encore moins adaptés aux études de lipides en raison de leur manque de polarisation. Évidemment, cette limitation s’applique uniquement des lipides qui sont absorbés et transportés par les lacteals, tandis que ceux absorbé via les vaisseaux sanguins intestinaux sont susceptible d’être traitées normalement.

<table><tbody><tr><td>Produits chimiques pour tampon de perfusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Merck</td><td>1.12018.0500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2 x 2 H2O)</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>Pharmacosmos</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>Sel disodique d’acide fumarique (C44H2Na2O4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9642</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (C6H12O6)</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium hépatahydraté (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>105886</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>potasium (KCl)</td><td>Merck</td><td>104936</td> Dihydrogénophosphate de <td></td></tr><tr><td>potassium (KH2PO4)</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de l’acide pyruvique (C3H3NaO4)</td><td>Merck</td><td>106619</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamate monohydraté (C5H8NNaO4 x H2O)</td><td>Merck</td><td>106445</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>><Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Perfusion equitment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universial perfusion</td><td>system Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732316</tr><tr><td>UNITÉ DE BASE UNIPER UP-100, TYPE 834</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à rouleaux, avec quatre canaux</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732068</tr><tr><td>Circulateur thermostatique, volume de bain 3L, 230V/50Hz</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>730125</tr><tr><td>Table d’opération, chauffée sur trépied, type 873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>733776 Canule avec exposition au soleil, diamètre extérieur = 2,0 mm, diamètre intérieur = 1,0 mm</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733313</tr></tbody></table>

mécanismes sous-jacents gut sécrétion de l’hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de rat

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

L’intestin est le plus grand organe endocrinien du corps, produisant plus de 15 hormones peptidiques différents qui régulent l’appétit et l’alimentation, digestion, absorption des nutriments et distribution et excursions de la glycémie post-prandiale. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la sécrétion de l’hormone intestinale est fondamental pour comprendre et traduire gut hormone physiologie. Traditionnellement, les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale sont bien étudiés in vivo (chez les animaux ou les humains) ou l’utilisation primaire de sécrétant des hormones du tube digestif muqueux cultures de cellules ou lignées de cellules. Ici, nous introduisons un intestin grêle de rat perfusée isolé comme une méthode alternative pour l’étude de la sécrétion de l’hormone intestinale. Les vertus de ce modèle sont qu’il repose sur l’intestin intact, ce qui signifie qu’il récapitule la plupart des paramètres physiologiquement importants responsables de la sécrétion des études in vivo, y compris les muqueuse polarisation, relations paracrine et itinéraires de exposition de perfusion/stimulation. En outre et contrairement aux études in vivo, l’intestin grêle de rat perfusée isolé permet un contrôle expérimental presque complet et une évaluation directe de la sécrétion. Contrairement aux études in vitro, il est possible d’étudier l’ampleur et la dynamique de la sécrétion et à poser des questions importantes, telles que quels stimuli provoquent la sécrétion d’hormones différentes gut, de quel côté du tube digestif (luminal ou vasculaire) est la sécrétion Ils sont stimulés et d’analyser dans les capteurs moléculaires de détail qui sous-tendent la réponse sécrétoire. En outre, la préparation est un modèle puissant pour l’étude de l’absorption intestinale et des détails sur la dynamique de l’absorption intestinale, y compris les transporteurs responsables.

La capacité à déterminer si un stimulus donné provoque la sécrétion de l’hormone de l’intestin d’intérêt s’appuie sur une sécrétion de base stable. En outre, si aucune réponse à la stimulation n’est observé, une réponse sécrétoire robuste au témoin positif doit être évidente pour exclure que l’absence de réponse à la stimulation de test ne reflète pas le manque de réactivité. Figure 2 a et 2 b montre un exemple de données de bonne qualité ; L...

Nous présentons ici un modèle puissant et physiologique pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale et l’absorption intestinale, l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.

Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

La méthode que nous avons développée ici s’est avéré extrêmement utile dans nos travaux, en essayant de découvrir les mécanismes moléculaires de sécrétion d’hormones de l’intestin, mais aussi l’absorption des nutriments, et le couplage entre les deux. Le principal avantage de cette technique hautement physiologique est que l’intestin est laissé in situ, tout en permettant des études détaillées qui ne sont généralement effectuées que dans les modèles in vitro. Placez d’abord le rat sur une table d’opération chauffée, confirmez un manque de réponse au pincement d’onde, et faites une excision de peau et péritonéale pour exposer la cavité abdominale.Déplacez l’intestin grêle sur le côté pour exposer la région terminale du côlon. Et ligate la vascularisation d’approvisionnement au côlon. Extraire graduellement le côlon, à partir de la région terminale, et se déplacer vers l’intestin grêle, hydrater le tissu avec salin isotonique, et en utilisant des cotons-tiges pour enlever le tissu conjonctif si nécessaire.Lorsque tout le côlon a été enlevé, insérez un morceau de 15 centimètres de tube en plastique dans l’extrémité proximale du petit lumen intestinal, et fixez le tube avec des sutures. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres et une pompe à seringues pour rincer soigneusement l’intestin grêle avec une solution saline isotonique à température ambiante à un débit de 25 millilitres par minute. Lorsque le tissu a été vidé de chyme, ajuster les tissus de sorte que l’artère mésentérique supérieure est accessible et enlever le tissu conjonctif et le tissu adipeux pour exposer l’artère.Utilisez des forceps à points fins pour placer deux sutures sous l’artère mésentérique et deux sutures sous la veine du portail. Remplissez un cathéter en plastique de calibre 22 attaché à une pompe à roulement avec tampon de perfusion et utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper un petit trou dans l’artère mésentérique, insérant immédiatement le cathéter dans l’incision. Insérez le cathéter dans les deux minutes suivant la coupe d’un trou dans l’artère, sinon l’intestin souffrira probablement de dommages ischémiques.Dès que le cathéter a été fixé à l’aide d’une suture, démarrez la pompe à rouler pour lancer la perfusion à un débit de 7,5 millilitres par minute. Lorsque les vaisseaux sanguins de l’intestin et de la veine du portail pâlissent, coupez un trou dans la veine du portail. Insérez un cathéter métallique et fixez le cathéter métallique avec une autre suture.Prenez soin lors de l’insertion du cathéter dans la veine du portail, car la veine est mince murée. Cependant, comme le garde est maintenant perfusé, l’insertion rapide n’est pas cruciale. Après avoir recueilli la sortie de perfusion pendant une minute, mesurez le volume et cliquez sur exécuter l’expérience dans le programme d’enregistrement de pression pour lancer les enregistrements d’acquisition de pression de perfusion.Couvrez ensuite l’intestin d’un tissu de laboratoire humidifié pour l’empêcher de sécher, et confirmez que l’extrémité distale de l’intestin n’est pas bloquée, et qu’un haploïde luminal peut sortir. Pour mesurer la pression partielle de l’oxygène et du dioxyde de carbone, recueillir le tampon de perfusion à travers une valve à trois sens stop-coq immédiatement avant qu’il n’entre dans l’organe, après environ trois minutes de perfusion, et à partir du cathéter inséré dans la veine portail. Placez les échantillons sur la glace et utilisez un analyseur automatisé de gaz sanguin pour mesurer les échantillons peu après la collecte.Utilisez un collecteur de fractions pour obtenir les premiers échantillons de base. Après 10 à 15 minutes de collecte de base, utilisez une pompe à seringues pour administrer le premier stimulant d’essai intraartérial par un stop-cock à trois sens à un débit de 35 millilitres par minute. Effectuez des stimulations luminaires par une injection initiale de boas de stimulation administrée à un débit de 2,5 millilitres par minute au cours des cinq premières minutes de la stimulation, suivie de l’administration de la solution d’essai à un débit de 5 millilitres par minute.Dès qu’une période de stimulation luminale est terminée, rincer le lumen avec de la solution saline isotonique à un débit de 2,5 millilitres par minute pendant cinq minutes. Ensuite, prélevez des échantillons de base à 5 millilitres par minute pendant 15 à 30 minutes avant l’administration de la substance d’essai suivante. À la fin de l’expérience, administrer un contrôle approprié et positif pour vérifier la réactivité de la préparation pendant cinq à dix minutes, la collecte et 10 à 15 minutes supplémentaires d’échantillons de base à la fin de la période de stimulation positive.Voici un exemple de données de bonne qualité, démontrant glucagon-like peptide-1 ou GLP-1, sécrétion d’un intestin grêle perfusé isolé de rat recueilli à intervalles d’une minute. Dans des conditions basales, la sécrétion était stable tandis qu’avant et après l’administration du stimulus d’essai et du contrôle positif, une réponse sécrétaire robuste était évidente. Ces données de sécrétion de GLP-1 obtenues à partir d’un intestin grêle perfusé isolé de rat sont de mauvaise qualité avec une sécrétion instable mesurée à des conditions basales qui ont dérivé vers le haut tout au long de l’essai d’une manière qui semblait n’avoir aucun rapport avec les administrations de substance d’essai ou au contrôle positif.Il est donc impossible de conclure si la sécrétion accrue de GLP-1 observée à la fin de la stimulation vasculaire de fructose était une réponse médiatisée de fructose. Tout en essayant cette procédure de soins pour fixer les cathéters correctement et de nettoyer soigneusement l’équipement de perfusion que le tampon de perfusion fournit un excellent moyen pour la croissance bactérienne. Après cette procédure, d’autres méthodes comme les études in vitro sur les lignées cellulaires sécrétant des hormones des cultures cellulaires intestinales primaires, peuvent être effectuées pour étudier directement la production intracellulaire d’AMP cyclique ou de calcium intracellulaire.Nous avons donc déjà utilisé la méthode maintenant pour l’élucidation d’un certain nombre de processus derrière l’absorption des nutriments et le mécanisme de sécrétion des hormones et il s’est avéré être extrêmement utile. N’oubliez pas que travailler avec des bloqueurs ou des activateurs de sites moléculaires peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que l’utilisation d’un manteau de laboratoire, gants et lunettes de sécurité, une hotte de fumée doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

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Médecine

Ce protocole décrit l’utilisation de préparations de tissus intestinaux excisés ou « sacs intestinaux » comme modèle ex vivo de la fonction de la barrière intestinale. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale et de la couche de gel muqueux à des sites intestinaux spécifiques dans des modèles animaux de maladies digestives.

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Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

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Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

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Nous présentons une méthode pour isoler des tubes intestinaux de rat et évaluer l’impact des médicaments sur leur tension, leur fréquence et leur amplitude in vitro. Cette méthode offre une approche précieuse pour les chercheurs qui étudient les tubes intestinaux.

Utilisation d’un système de perfusion tissulaire in vitro pour détecter en temps réel les activités fonctionnelles de tubes intestinaux isolés

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Ici, nous fournissons des détails sur la réalisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact comme technique supplémentaire pour évaluer la fonction pancréatique endocrine avec réduction des facteurs de confusion possibles.

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact

Découvrez les mécanismes moléculaires de sécrétion des hormones intestinales et d'absorption des nutriments grâce à l'intestin grêle isolé perfusé de rat. Cette technique physiologique maintient l'intestin in situ pour des études détaillées.

Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat

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