Name: Un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez le clonage STAgR pour la multiplexation d'ARN guides CRISPR/Cas9. Cette méthode simplifiée utilise l'assemblage de Gibson et la PCR pour générer des vecteurs d'expression multiples de manière rapide, efficace et économique.

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Les auteurs tiennent à remercier le Prof. Dr. Stephan Beck et Prof. Dr. Jovica Ninkovic pour leur contribution, d’aide et de support dans l’élaboration de la méthode STAgR. Tobias Klötzer, Anna Köferle et Valentin Baumann des commentaires utiles. Le travail a été soutenu par la DFG (STR 1385/1-1).

1. conception de STAgR stratégie de clonage
<ol><li>Décider sur combien gRNA cassettes seront inclus dans le vecteur d’une expression et dans quel ordre. Déterminer les promoteurs et les gRNA échafaudages doivent servir à chacun du gRNAs. Concevoir le gRNAs en utilisant n’importe quel outil en ligne (p. ex., www.benchling.com).</li>
</ol>2. conception de STAgR clonage des amorces avec porte-à-faux
Remarque : La séquence de protospacer sens de la dernière gRNA et l’anti-sens de la première gRNA sont respectivement ajoutés pour les amorces PCR utilisées pour l’amplification de l’épine dorsale du vecteur (Figure 1). Les séquences restantes sont amplifiées des cordes, attachant ainsi le sens et antisens gRNAs dans l’ordre souhaité. La première chaîne morceau est amplifié avec un primer avant contenant la première gRNA N20 séquence sous un surplomb et un apprêt inverse avec la deuxième gRNA N20 séquence (complément inverse) sous un surplomb. Toutes les pièces suivantes sont générées en conséquence.
<ol><li>Ajouter des séquences gRNA N20 pour les amorces avant amplification pour chaîne d’ADN de STAgR que surplombe (tableau 1). Ajouter sens gRNA des séquences 5' à l’apprêt avant « EFC-FP » (pour les échafauds classiques) ou « sam-FP » (pour les échafauds contenant MS2). Des amorces FP recuisent à la partie de l’échafaudage/MS2 de la chaîne de STAgR respectif (Figure 1).</li>
	<li>Ajouter le complément inverse N20 gRNA séquence aux séquences d’amorce de marche arrière. Le choix des amorces RP selon les promoteurs spécifiques et les cordes utilisées (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. génération de clonage de Fragments de STAgR
<ol><li>Pour générer les fragments individuels de clonage pour Assemblée de Gibson, effectuer PCRs en mettant en place 10 µL de tampon de haute fidélité (HF), 1 µL de 10 mM dNTPs, 0,25 µL de surplomb-primer (100 µM), 10 ng de la polymérase ADN modèle (chaîne ou vecteur), 0,5 µL HF , 1,5 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajouter H2O pour faire un volume final de 50 µL. Remarque : Utilisez le plasmide « STAgR_Neo » comme modèle pour la colonne vertébrale PCR d’incorporer l’échafaud gRNA à la dernière gRNA, si l'on choisit le Scaffold SAM, utilisez « STAgR_SAM ». Pour un plasmide STAgR avec gRNA six cassettes par exemple, six RFT est nécessaires, que cinq avec l’ADN des chaînes comme modèles et l’autre avec l’épine dorsale du vecteur comme modèle.</li>
	<li>Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 98 ° C pendant 1 min 30 s ; 38 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 59 ° C (pour échafaudage gRNA) / 68 ° C (pour la boucle de SAM) pendant 10 s, 72 ° C pendant 30 s (pour les insertions) / 1 min 30 s (des vecteurs) ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Enlever 5.5 µL de la réaction PCR, ajoutez le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charge une échelle d’ADN appropriée pour dimensionnement (100 bp échelle/1 kb DNA échelle d’ADN) et exécuter le gel dans une gestion appropriée de gel tampon (par exemple, buffer TLE) à 120 V pendant 30 min.</li>
	<li>Lorsque le gel est en marche, ajouter 5 µL de la mémoire tampon fournie avec l’enzyme de restriction et de 0,5 µL DpnI (10 unités) de la réaction de PCR 44,5 µL restante et laisser incuber 30 min à 1 h à 37 ° C.</li>
	<li>Effectuer la purification de l’ADN à l’aide de billes magnétiques.<ol>
<li>Ajouter 1,8 billes magnétiques µL par 1 µL du produit PCR et mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Séparer les perles et les fragments d’ADN de liquide résiduel avec un aimant. Laver les perles deux fois avec l’éthanol à 70 % en rinçant le culot sans resuspendant complètement.</li>
		<li>Retirer tout l’éthanol avec une pipette et laissez le pellet air sec.</li>
		<li>Dissoudre le culot dans 15 à 20 µL H2O de pipetage de haut en bas et séparer les perles du liquide à l’aide d’un aimant. Transférer le liquide clair surnageant dans un nouveau tube. Remarque : Par ailleurs, kits de nettoyage basée sur les colonnes de réaction peuvent être utilisés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer les concentrations d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit ailleurs29.</li>
</ol>4. Gibson Assemblée réaction et Transformation bactérienne
Remarque : Les étapes suivantes sont adaptées de Gibson et al. 30.
<ol><li>Préparer une maison Gibson réaction mélanger ou utiliser un kit clonage commercial de Gibson.<ol>
<li>Mélanger 3 mL de 1 M Tris (Tris (hydroxyméthyl) aminométhane)-HCl pH 7.5, 300 µL de 60 µL de (dCTP) 100 mM, 60 µL de dATP 100 mM (adénosine triphosphate), 1 M MgCl, 60 µL de dTTP 100 mM (désoxythymidine triphosphate), 60 µL de 100 mM dGTP (désoxyguanosine triphosphate) désoxycytidine triphosphate), 300 µL de 1 M DTT (dithiothréitol), 1,5 g de PEG-8000 (polyéthylène glycol), 300 µL de 100 mM NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) et ajouter H2O pour obtenir 6 mL de tampon de réaction isotherme × 5. Remarque : Aliquoté tampon peut être stocké à-20 ° C pendant au moins 12 mois.</li>
		<li>Pour le maître de l’Assemblée de Gibson mélanger, combiner 320 µL de tampon de réaction isotherme 5 x 697 µL d’H2O et ajouter 3 µL de 10 U/µL T5 exonucléase, 20 µL de 2 U/µL ADN polymérase et 160 µL de 40 U/µL Taq DNA ligase. Remarque : Ce mélange peut être aliquotés et congelés à-20 ° C pendant au moins 12 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez 7,5 µL du mélange maître Assemblée avec 2,5 µL d’insertion et de vecteur. Pour une réaction x STAgR 2 utilisez un vecteur molaire pour insérer le ratio de 1:1 mais pas plus de 0,2 pmol d’ADN au total. Pour plus de 2 cassettes d’expression gRNA, utilise un vecteur d’insérer le rapport de 1:3, mais ne dépassent pas un montant total de l’ADN de 0,5 pmol. Remarque : Toutes les cassettes d’expression amplifié gRNA doivent être utilisés en quantités équimoléculaires. Inclure un contrôle plasmidique avec la somme identique de vecteur mais aucune insertions au contrôle pour non digérés template vecteur (ou individu-ligature).</li>
	<li>Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 45 à 60 min. des échantillons de magasin sur la glace ou à-20 ° C pour transformation ultérieure. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Directement la moitié du mélange de transformer les bactéries compétentes chimiquement.<ol>
<li>Décongeler les bactéries TOP10 Escherichia coli chimiquement compétents sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 5 µL du mélange Gibson à 50 µL de bactéries compétentes. Mélanger doucement en effleurant le fond du tube. Incuber sur glace pendant 30 min.</li>
		<li>Effectuer un choc thermique en plaçant le tube dans un bain d’eau de 42 ° C ou un bloc chauffant pour 45 s.</li>
		<li>Remettez les tubes sur glace. Ajouter 250 µL de milieu SOC pour les bactéries et les laisser récupérer à 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 30 à 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la restauration, de la plaque les bactéries transformées sur 1,5 % lysogénie bouillon (LB) boîtes de gélose contenant l’ampicilline (100 µg / mL) et incuber une nuit à 37 ° C.</li>
</ol>5. sélection des Clones de STAgR par PCR sur colonie bactérienne
<ol><li>Préparer au moins deux séries de 200 tubes de réaction PCR µL (entre 3 et 24) pour chaque construction, qui sont étiquetés de manière identique.</li>
	<li>Remplir un ensemble de 100 µL de milieu LB contenant 100µg / ampicilline mL.</li>
	<li>Utiliser un embout de la pipette stérile à gratter de la matière biologique d’une colonie bactérienne et l’étaler au fond du tube de réaction de PCR 100 µL vide. Transférer immédiatement la pointe dans le deuxième tube de réaction correspondante contenant le milieu LB.</li>
	<li>Agiter doucement la pointe autour d’assurer certaines des bactéries sont transférés aux médias LB et incuber à 37 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Mettre en place un mélange maître PCR (10 µL par réaction).<ol>
<li>10 réactions, combinez 10 µL de tampon Taq , 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL d’apprêt (100 µM), 0,5 µL de la Taq polymérase et ajouter 100 µL de H2O.</li>
		<li>Utiliser les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd2 : ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev : TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 10 µL du mélange maître PCR dans les tubes de réaction PCR marqués sans les médias LB.</li>
	<li>Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 38 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min. NOTE : Temps d’élongation (72 ° C étape) devrait être augmenté avec le nombre de cassettes d’expression gRNA. Calculer la taille théorique d’insertions à l’aide du tableau 2 et utilisez 1 min par 1 kb à 72 ° C.</li>
	<li>Ajouter le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charger une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement (1Ko échelle d’ADN) et exécutez le gel approprié en exécutant tampon (par exemple, Buffer TLE) à 120 V pendant 30 min.</li>
	<li>Calculez la taille théorique de l’amplicon avec l’aide du tableau 2 en additionnant les montants individuels des promoteurs usagés, gRNA échafaudages et nombre de séquences de la N20. Les résultats de la PCR sur colonie, identifier les clones bactériens basées sur la taille de la bande de fréquences correcte et s’ils sont susceptibles de port corrects vecteurs.</li>
	<li>Ensemencer une 2,5 mL nuit LB (avec 100 ampicilline µg/mL) avec la culture correspondante de 100 µL, mises en place plus tôt. Incuber à 37 ° C pendant 12 h.</li>
	<li>Extraire l’ADN de plasmide utilisant un kit de mini plasmide commerciale et d’instructions du fabricant31.</li>
	<li>Séquencer les plasmides en utilisant les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) et StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) par séquençage Sanger.</li>
</ol>

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<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4, 5400(2014).</li>
<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour STAgR ce qui permet la génération simple et rapide des plasmides d’expression gRNA de différentes tailles. Ce protocole peut être utilisé pour la production d’une étape de plasmides gRNA avec cassettes d’expression gRNA 2 – 8 (avec ou sans deux ARN MS2 Aptamères) dans le vecteur d’expression gRNA STAgR_Neo et l’utilisation de U6 humain, souris U6, 7sK humaine et humains H1 promoteurs28 ,32,33. Si vous désirez plus de quatre cassettes, il est recommandé d’utiliser au moins deux types différents de promoteur/échafaudage pour accroître l’efficacité. Autres vecteurs, promoteurs et combinaisons du promoteur ainsi que plus de 8 cassettes gRNA pourraient être possibles aussi bien ; Toutefois, cela n’a pas été testé. Bien que dans notre expérience, que la méthode fonctionne de façon fiable et reproductible, nous avons déterminé les étapes critiques et stratégies de dépannage le résultat attendu pas immédiatement en cas de. Dans notre expérience certaines étapes jouent un rôle essentiel pour la réussite de la démarche : tout d’abord, il est important d’utiliser les rapports molaires correctes des inserts à l’épine dorsale de vecteur à l’étape d’assemblage Gibson (3:1). Cependant, nous avons remarqué que pour certains ensembles gRNA un ratio de 1:1 d’inserts à vector est bénéfique, même lorsque le nombre de cassette gRNA ne dépasse pas deux. Deuxièmement, la période de la réaction de l’Assemblée de Gibson devrait être suffisamment longue (au moins 45 min recommandé).
STAgR peut être utilisé avec un grand nombre de modifications. Ciblage des séquences, gRNA numéros et les échafaudages, les promoteurs et les backbones vecteur peuvent être personnalisés et librement combinées. Toutefois, chaque combinaison peut-être avoir des exigences légèrement différentes. Dans notre expérience, si moyen ou élevé nombre de cassettes gRNA (> 4) sont désiré mais pas obtenu immédiatement, généralement le meilleur moyen de surmonter ce problème est de changer l’ordre des cassettes gRNA individuels dans le vecteur. De même, combinant gRNA différents promoteurs et échafaudages améliore l’efficacité (et donc diminue le nombre requis de colonie PCRs qui doivent être marqués) quand plusieurs cassettes gRNA sont clonés. Nous avons constaté que des clones incorrectes sont habituellement générés par la conjonction spontanée de séquences répétées lors de l’assemblage de Gibson. Même si cela peut réduire l’efficacité de la méthode, cela se traduit également par la production simultanée de vecteurs avec de sous-ensembles fonctionnels gRNA28.
Génération du multiplexage gRNA vecteurs contenant plus d’une cassette d’expression gRNA a signalé un certain nombre de différentes méthodes21,22,23,24,25, 26,27. Tandis que certains emploient simultanée ou séquentielle de clonage de gRNA paires22,34, d’autres dépendent de Golden Gate Assemblée et plusieurs séquentielle clonage étapes25,35. Une approche particulière a été utilisée par Xie et al., en employant le système traitement tRNA endogène cellulaire pour couper plusieurs gRNAs sur un unique ancêtre transcription36. L’advangetage de cette méthode est l’exigence d’un seul promoteur ; l’inconvénient est la nécessité de fragments d’ADN nouvellement synthétisées pour chaque combinaison de gRNA. Chaque gRNA multiplexage méthode a ses avantages et inconvénients ; STAgR alliant simplicité et efficacité, un nombre élevé de cassettes gRNA possible à faible coût.
STAgR (et autres systèmes de multiplexage) sera probablement joué un rôle important en permettant aux perturbations efficace (et simultanée) de gènes multiples in vivo, comme un pionnier dans le poisson-zèbre cerveaux28. Une autre application future des vecteurs de multiplexage gRNA est la promesse pour la manipulation des programmes complets de transcriptional contrairement à l’induction ou la répression d’un simple gène. Probablement, ces approches permettra de transformer des cellules et des organes à vont à un degré beaucoup plus élevé qu’il est possible aujourd'hui.

Chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR) est une méthode permettant la génération de nuit efficace des vecteurs d’expression contenant plusieurs gRNA expression cassettes dans un clonage unique étape. Le protocole de STAgR ne dépend pas de compétences spécialisées ou matériaux et offre plusieurs options pour la personnalisation.
La protéine bactérienne de CRISPR Cas9 a une capacité unique. Il est capable de trouver et de lier sélectivement seulement ces séquences d’ADN encodés en crRNAs naturelle ou ingénierie gRNAs1. Son utilisation comme outil moléculaire a permis à un grand nombre d’approches qui ont été impossible, irréalisable ou seulement limité à certains modèles cellulaires, jusqu'à une date récente. Il s’agit de mutations de gène ciblé2, génie de génome3, épigénome édition4,5,6, activation de la transcription et gene silencing7,8. Car autant que nous sachions que Crispr est universellement déployable, comme les rapports d’application existe pour un large éventail de sites cibles, des espèces et des types de cellules. Cependant, beaucoup d’applications CRISPR dépendre directement ou indirectement sur la livraison de gRNAs multiples, y compris une série de manipulations génomiques (translocations9,10, moyen11 et altérations génomique à grande échelle 12 , ( 13), génie de génome (utilisation de Cas9 nickases14), génération d’allèles conditionnelle11,15 ou16de la série de mutations et de suivi des stratégies17. En outre, d’autres approches (transcription ingénierie18, épigénome ingénierie19,20) plusieurs sites de ciblage ne sont pas strictement obligatoire, cependant qu’ils atteignent leur maximum d’effet souvent uniquement en vertu du présent condition.
Plusieurs méthodes utiles ont été décrites pour générer des vecteurs gRNA contenant plus d’un gRNA expression cassette21,22,23,24,25,26, 27. Nous présentons ici un protocole pour STAgR, chaîne Assemblée gRNA clonage, qui est remarquable dans sa combinaison de simplicité et de vitesse (pendant la nuit qu’une seule étape de clonage est requise), faible coût (comme modèles d’ADN peuvent être réutilisés plusieurs fois), personnalisation (pour gRNA différents systèmes et promoteurs) et de l’efficacité (il permet la génération des vecteurs contenant un nombre élevé de cassettes gRNA)28.
STAgR peut, en principe, être utilisé pour générer des vecteurs d’expression avec quelques (1 – 2 gRNAs), plusieurs (3 à 5 gRNAs) et certains du plus grand nombre de cassettes d’expression signalé jusqu’ici (6 – 8 gRNAs)28. De même, STAgR est applicable pour toute séquence gRNA, la colonne vertébrale ou le promoteur. Depuis cependant, STAgR repose principalement sur les réactions en chaîne par polymérase (PCR) et l’Assemblée Gibson, gRNAs avec des similitudes de séquences haute doit être généré à l’aide d’une méthode alternative.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymérase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Polymérase pour Gibson Master Mix ainsi que pour toutes les PCR</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>dNTP pour toutes les PCR</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTP pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTP pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTP pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTP pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>pour nettoyage de l’ADN</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Exonucléase</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 1 kb Plus</td> Mini kit de plasmide <td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr>Séquences <td></td><td></td> de<td>plasmide et d’amorce</td> Thermo Scientific K0503 <td>Toutes les séquences sont disponibles sur Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>pour tampon TLE</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>pour Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10 bactéries chimiquement compétentes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>pour bouillon lysogénique (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>pour bouillon lysogénique (LB Media)</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>pour bouillon lysogénique (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>pour bouillon lysogénique (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole personnalisable pour chaîne assemblée grna clonage (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

Le système CRISPR/Cas9 bactérien a considérablement augmenté les options méthodologiques pour les scientifiques de la vie. En raison de son utilisation, génie génétique et génomique est devenue applicable à un large éventail de systèmes. En outre, bon nombre de transcriptional et épigénomique approches techniques sont maintenant généralement réalisables pour la première fois. Une des raisons pour l’applicabilité large de CRISPR tient à sa nature bipartite. Petits gRNAs déterminer les cibles génomiques du complexe et variantes de la protéine Cas9 les conséquences moléculaires les. Cependant, beaucoup d’approches CRISPR dépendre de l’exécution simultanée de multiples gRNAs dans des cellules individuelles. Ici, nous présentons un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR), une méthode qui permet la génération simple, rapide et efficace de gRNA multiplexé des vecteurs d’expression dans un clonage unique étape. STAgR est rentable, étant donné que (dans le présent protocole) les séquences individuelles de ciblage sont introduites par des amorces de porte-à-faux courts tandis que les modèles d’ADN longs les gRNA des cassettes d’expression peuvent être réutilisés plusieurs fois. De plus, STAgR permet d’incorporation seule étape d’un grand nombre de gRNAs, ainsi que des combinaisons de gRNA différentes variantes, les vecteurs et les promoteurs.

Suivant le protocole en question fait la génération personnalisée multiplexage gRNA vecteurs possibles (Figure 1). Les résultats représentatifs des approches STAgR à l’aide de six différents gRNA cassettes sont représentés dans la Figure 2. Figure 2 A montre un résultat typique des PCR permet d’obtenir les pièces de STAgR (protocole de 3.1 à 3.3). Les six amplicons (BB, S1-S5) représentent des morceaux de l’ADN linéaire contenant les séquences individuelles gRNA N20 sur leurs extrémités. Le squelette plasmidique (BB) est maintenant étendu avec des séquences ciblage de gRNA1 et gRNA6 et possède donc les chevauchements nécessaires aux deux autres PCRs (S1 et S5) pour l’assemblage de Gibson (Figure 2A, tableau 3). Après purification, un rendement d’ADN d’au moins 1 microgramme de vecteurs et d’inserts est possible.
Après le montage de Gibson, transformation bactérienne devrait se traduire par des colonies bactériennes de 100 à 700. Figure 2 B montre une analyse représentative de 10 colonies bactériennes par colonie PCR, suite à un protocole de STAgR avec six gRNA cassettes. Électrophorèse sur gel indique que les trois clones la taille attendue amplicon pour montage complet (tableau 2). Autres clones probablement reçu STAgR vecteurs contenant d’un à cinq gRNA cassettes, considérant qu’un clone (Figure 2B, n ° 18) est vide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la conception d’amorce STAgR. Premier nombre gRNA ainsi que les échafaudages sont choisis, puis gRNA ordre et promoteur et en dernier, quel type de vecteur doit être utilisé. Pour chaque gRNA, une amorce spécifique vers l’avant avec la gRNA ciblant la séquence en orientation de sens et de la partie commune de « EFC-FP » ou « sam-FP » a été conçue. De même, pour générer l’abécédaire individuel inverse la séquence correspondante (RP) est fusionnée avec le complément inverse de la séquence de la N20 de la prochaine gRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs des approches STAgR à l’aide de six cassettes différentes gRNA. (A) exemple représentatif d’une PCR de cinq insertions ainsi que le vecteur STAgR_Tomato. (B) les PCR de colonie d’un 6 x réaction STAgR à l’aide de promoteurs hU6 et mU6 et gRNA canonique ainsi que les échafaudages de SAM. 22 colonies bactériennes ont été analysées, dont 7 ont montré la bande attendue indiquant l’ensemble complet. Échelle : 1 Ko de plus, nombre de paires de bases (pb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Transmettre l’apprêt pour chaîne et vecteur</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inverser l’amorce pour la chaîne et le vecteur</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Séquences d’amorces pour les échafaudages gRNA et promoteurs.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tailles des promoteurs et des échafaudages.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA échafaudage</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA d’échafaudage</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Taille théorique de chaque cassette d’expression pour calculer les résultats PCR de colonie.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Grandeurs de promoteurs et d’échafaudages.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+ 74 bp</td>
			<td>+ 67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Dimensions calculées de STAgR pièces après PCR.

Nous présentons ici la chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR), une méthode pour multiplexer facilement gRNA vecteurs pour les approches de CRISPR/Cas9. STAgR rend gRNA multiplexage simple, efficace et personnalisable.

Un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Le système bactérien CRISPR-Cas9 a considérablement augmenté les options expérimentales pour les scientifiques de la vie. Cependant, plusieurs approches CRISPR dépendent de la livraison simultanée de multiples ARN guides dans les cellules individuelles. Le clonage de gRNA d’assemblage de cordes permet la génération simple et rapide de vecteurs d’expression de multiplex gRNA en une seule étape de clonage.Mais STAgR n’est pas seulement simple, il est également efficace, bon marché et facile à personnaliser. Pour commencer, ajoutez les séquences de N20 gRNA aux amorces d’amplification avant pour la chaîne d’ADN STAgR sous forme de surplombs. Ajoutez des séquences de gRNA de sens cinq premiers à l’amorce avant, amorce avant d’échafaudage, pour un échafaudage conventionnel, ou à l’amorce avant de SAM pour un échafaudage MS2-contenant.Ensuite, ajoutez le complément inverse des séquences N20 gRNA aux séquences d’amorce inversée, en choisissant des amorces RP, en fonction des promoteurs et des chaînes spécifiques utilisés. Pour commencer à générer les fragments de clonage individuels pour Gibson Assembly, transférez 10 microlitres du tampon haute fidélité à un tube. Ajouter un microlitre de 10 dNT Milimolar et 0,25 microlitres des deux amorces de surplomb de 100 micromolaires.Ajouter 10 nanogrammes de la chaîne de modèle d’ADN, ou vecteur, et 1,5 microlitres de DMSO. Ajouter suffisamment d’eau pour porter le volume final à 49,5 microlitres, puis ajouter 0,5 microlitres de polymése HF. Incuber les réactions sur un thermocycleur, tel que décrit dans le protocole de texte.Après cela, prendre un aliquot de 5,5 microlitres de la réaction PCR. Ajouter le colorant de chargement à tous les aliquots, et le charger sur un gel de 1% agarose. Chargez une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement, et exécutez le gel dans un tampon approprié de gel-exécution à 120 volts pendant 30 minutes.Pendant que le gel est en cours d’exécution, ajouter cinq microlitres du tampon fourni avec l’enzyme de restriction, et 0,5 microlitres DpnI aux 44,5 microlitres restants de la réaction vectorielle PCR pour éliminer le modèle plasmide résiduel utilisé pendant le PCR. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Vérifiez que les amplicons sont de la bonne taille.Pour commencer la purification de l’ADN, ajouter 1,8 microlitres de perles magnétiques par microlitre de produit PCR, et mélanger par pipetting de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant deux minutes. À l’aide d’un aimant, séparer les perles dans les fragments d’ADN du liquide résiduel.Rincer la pastille avec 70% d’éthanol sans la réutiliser complètement, pour laver les perles. Répétez ce lavage une fois de plus. À l’aide d’une pipette, retirer tout l’éthanol et laisser sécher l’air granulé.Ajouter ensuite 15 à 20 microlitres d’eau, et pipette de haut en bas pour mélanger et dissoudre la pastille. Utilisez un aimant pour séparer les perles du liquide. Transférer le supernatant clair dans un nouveau tube.Après cela, utilisez un spectrophotomètre pour déterminer les concentrations d’ADN. Tout d’abord, préparez le tampon de réaction isothermal 5x tel que détaillé dans le protocole de texte. Pour le Gibson Assembly Master Mix, combinez 320 microlitres du tampon de réaction isothermale 5x avec 697 microlitres d’eau.Ajouter 3 microlitres d’exonucléase T5, 20 microlitres de polymésase d’ADN, et 160 mciroliters de ligase d’ADN de Taq. Transférer 7,5 microlitres du Mix Maître d’Assemblage dans un tube frais. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’insertion dans le vecteur, comme indiqué dans le protocole texte.Incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. Après cela, entreposer des échantillons sur de la glace, ou à 20 degrés Celsius, pour une transformation ultérieure. Lorsqu’elles sont prêtes à transformer la bactérie, décongelez les bactéries TOP10 E.Coli chimiquement compétentes sur la glace.Ensuite, ajoutez cinq microlitres du Gibson Mix à 50 microlitres de bactéries compétentes, et mélangez en feuilletant doucement le fond du tube. Incuber sur la glace pendant 30 minutes. Placez le tube dans un bain d’eau ou un bloc de chaleur de 42 degrés Celsius pendant 45 secondes pour choquer la bactérie.Ensuite, remettre les tubes sur la glace. Ajouter 250 microlitres de SOC moyen à la bactérie, et les laisser récupérer à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant pendant 30 à 45 minutes. Une fois que les bactéries se sont rétablies, plaquez-les sur des plaques d’agar de 1,5 % LB qui contiennent 100 microgrammes par ampicilline millilitre.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour commencer, préparez au moins deux ensembles de 200 tubes de réaction PCR de microlitres pour chaque construction. Remplissez l’un des ensembles de tubes de réaction avec 100 microlitres LB moyens, contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.À l’aide d’une pointe stérile de pipette, grattez le matériel biologique d’une colonie bactérienne et étalez-le au fond d’un tube de réaction PCR vide de 200 microlitres. Transférez immédiatement la pointe pipette vers le deuxième tube de réaction correspondant qui contient du milieu LB. Faites tourbillonner la pointe pour vous assurer que certaines des bactéries sont transférées aux médias LB.Incuber à 37 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, préparez 10 microlitres de PCR Master Mix par tube de réaction, tel que décrit dans le protocole texte. Ajoutez 10 microlitres du MIX PCR Master aux tubes de réaction PCR étiquetés, sans les supports LB.À l’aide d’un thermocycleur, incuber les réactions décrites dans le protocole textuel. Après cela, ajouter le colorant de chargement aux fragments amplifiés, et les charger sur un gel de 1% agarose. Chargez une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement, et exécutez le gel dans un tampon approprié de gel-exécution à 120 volts pendant 30 minutes.Calculez la taille théorique de l’amplicon en additionnant les tailles individuelles des promoteurs utilisés, les échafaudages gRNA et le nombre de séquences N20. À partir des résultats de la colonie PCR, identifier les clones bactériens, en fonction de la taille correcte de la bande, et si elles sont susceptibles d’abriter des vecteurs corrects. En utilisant la culture correspondante de 100 microlitres, inoculer une culture LB de 2,5 millilitres pendant la nuit contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Ensuite, utilisez un mini-kit plasmide commercial pour extraire l’ADN plasmide, selon les instructions du fabricant. Dans cette procédure, le clonage de gRNA d’assemblage de chaîne est employé pour générer rapidement des plasmides d’expression de gRNA.Un résultat typique des RPC utilisés pour obtenir les pièces STAgR est vu ici. Les six amplicons représentent des morceaux d’ADN linéaires, chacun contenant les séquences individuelles de gRNA N20 à leurs extrémités. L’épine dorsale plasmide est étendue avec les séquences de ciblage de gRNA1 et gRNA6, et possède donc les chevauchements requis à deux autres PCR pour Gibson Assembly.Après purification, un rendement d’ADN d’au moins un microgramme pour les vecteurs et les inserts peut être atteint. Après gibson assembly, la transformation bactérienne se traduit par 100 à 700 colonies bactériennes. L’analyse représentative de 22 colonies bactériennes, par l’intermédiaire du PCR de colonie suivant un protocole de STAgR avec six cassettes de gRNA, indique que sept clones montrent la taille amplicon prévue pour l’assemblage complet.Les autres clones ont probablement reçu des vecteurs STAgR, contenant une à cinq cassettes gRNA, alors qu’un clone est complètement vide. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en quelques heures. Bien exécuté, il permet la génération d’une multitude de vecteurs d’expression de multiplex gRNA en moins d’une semaine de travail.Tout en essayant cette procédure, il est important de prêter attention à l’attribution correcte et la combinaison d’amorces en surplomb N20. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension sur la façon de créer votre propre guide multiplexe vecteurs d’expression arn.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

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Assemblage rapide de constructions multigéniques à l’aide du clonage modulaire golden gate

Un module adaptable de clonage moléculaire Gibson Assembly a été utilisé dans le cadre d’un programme d’expérience de recherche de premier cycle (CURE) pour les étudiants du cours de biologie moléculaire. L’évaluation des résultats d’apprentissage des élèves a montré une meilleure compréhension et une meilleure confiance dans le clonage moléculaire après l’achèvement de l’étude CURE, et de nouveaux plasmides ont été clonés pour la recherche sur la biosynthèse des produits naturels.

Améliorer les résultats des étudiants grâce à une expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours adaptable de clonage moléculaire

Cet article présente un protocole étape par étape démontrant comment le clonage modulaire (MoClo) peut être adapté au clonage d’opérons polycistroniques.

Assemblage modulaire standardisé d’opérons polycistroniques avec clonage modulaire (MoClo) à l’aide de la boîte à outils In-Cloning

Découvrez le clonage STAgR pour la multiplexation d'ARN guides CRISPR/Cas9. Cette méthode simplifiée utilise l'assemblage de Gibson et la PCR pour générer des vecteurs d'expression multiples de manière rapide, efficace et économique.

Un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR)

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