Test d’absorption LDL cholestérol analyse avec cellule d’imagerie de cellules vivantes surveillance sanitaire
17 novembre 2018
Ce protocole prévoit une approche efficace pour mesurer l’absorption de cholestérol LDL avec des taux de flux en temps réel à l’aide d’un système dans divers types de cellules d’imagerie de cellules vivantes. Cette technique fournit une plate-forme pour l’activité pharmacologique de composés affectant les afflux de LDL tout en surveillant pour la morphologie cellulaire et cytotoxicité donc potentielle de l’écran.
Nous présentons une méthode pour l’analyse d’image vivante de l’absorption de cholestérol de LDL dans divers types humains de cellules. Cela permet de dépister les composés, qui modifient le transport du cholestérol LDL. Le principal avantage de l’utilisation de l’imagerie cellulaire vivante pour la quantification de l’afflux de LDL, c’est qu’elle permet de surveiller la morphologie cellulaire tout au long de la durée de l’analyse, de sorte que potentiellement les composés toxiques peuvent être détectés.
Pour commencer, aspirez les médias des cellules précédemment préparées, et lavez les cellules avec 5 millilitres de saline tamponnée de phosphate de Dulbecco. Aspirez le DPDS. À côté de détacher les cellules du plat de 100 millimètres, ajouter 1,5 millilitres de 0,25%Trypsine-EDTA pour les cellules HepG2, et ajouter 1,5 millilitres de 0,05%Trypsine-EDTA solution pour les cellules HK2, ou les HCAECs.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes. Neutralisez ensuite la trypsine en ajoutant 3 millilitres de supports complets pour les cellules HepG2 et HCAEC. Utilisez 3 millilitres de la solution neutralisante trypsine, compromettre le DPDS avec 5% sérum bovin fœtal ou FBS pour les cellules HK2.
Transférer les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres, puis centrifuger les tubes à 250g pendant cinq minutes. Après le spin, aspirer les médias, et résusquer la pastille cellulaire dans les médias complets. Filtrer délicatement la suspension des cellules à travers une passoire en maille de 40 microns pour briser les touffes cellulaires.
Comptez les cellules et plaquez-les dans une densité optimisée dans une plaque de 24 puits. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de se fixer. Le lendemain, changer les médias cellulaires pour les médias de base sans FBS pour la ligne cellulaire, plus 5% de sérum déficient en lipoprotéine, ou 2%FBS médias.
Utilisez 500 microlitres de supports totaux par puits dans une assiette de 24 puits. Ensuite, continuer l’incubation pendant 24 heures pour affamer les cellules. Avec l’étape de famine ou le jour suivant, les cellules peuvent être traitées avec les composés désirés et les contrôles appropriés.
24 heures après la famine, ajouter 5 microlitres de LDL rouge pHrodo étiquetés à chaque puits contenant 500 microlitres de médias pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Retirez soigneusement les bulles des puits. Immédiatement après l’ajout du LDL étiqueté, placez la plaque dans l’incubateur du système d’analyse cellulaire vivante et laissez la plaque s’équilibrer pendant 15 minutes pour réduire la condensation dans la plaque.
Pendant que les cellules couvent, ouvrez le logiciel et planifiez l’analyse en ajoutant le récipient tenant la plaque. Image 16 images par puits, ajouter des intervalles d’une heure à 10x grossissement pendant quatre heures en utilisant les canaux rouges et de phase. Créez ensuite une carte des plaques à utiliser pour le traitement des données, sélectionnez l’onglet propriétés et choisissez la carte des plaques.
Entrez le type de cellule dans l’onglet cellules et les traitements dans le robinet composé. Cliquez ensuite sur l’onglet régions, sélectionnez chaque ensemble de répliques et assignez des régions. Une fois qu’une course expérimentale est terminée, créez une image définie dans le logiciel pour former l’ordinateur à quantifier chaque paramètre inclus dans l’ensemble de comptage.
Dans le logiciel, ouvrez la vue plaque, puis dans la boîte d’analyse des utilitaires de travail, choisissez de créer ou d’ajouter à la collection d’images. Sélectionnez la nouvelle collection d’images, tapez un nom pour la collection d’images et choisissez les canaux rouges et de phase en cochant les cases à côté des canaux. Sélectionnez cinq autres images à partir de différents puits et points de temps et ajoutez-les à la collection d’images en ajoutant à la collection d’images actuelle.
Dans la boîte d’analyse des services publics d’emploi, choisissez une nouvelle définition de traitement, sélectionnez la collection d’images dans le menu drop-down, entrez les paramètres pour le type de cellules. Dans la boîte d’aperçu, utilisez le menu drop-down pour sélectionner l’aperçu de tous. Dans la boîte de masque d’analyse, cochez le masque de confluence et les boîtes de masque d’objet rouge pour afficher la zone incluse dans l’analyse de la définition de traitement.
Faites défiler la collection d’images pour vous assurer que les cellules et le LDL sont inclus dans le masque. Sélectionnez le fichier et enregistrez la définition de traitement. Ensuite, ouvrez la vue de plaque d’expérimentation pour analyser l’ensemble des images de la course expérimentale.
Dans la boîte de services publics d’analyse, choisissez de lancer un nouvel emploi d’analyse et sélectionnez la définition de traitement enregistrée. Nommez le travail d’analyse, choisissez la plage de temps pour l’analyse et mettez en évidence les puits expérimentaux à analyser. Sélectionnez le bouton de lancement.
Une fois le travail d’analyse terminé, exportez les données, sélectionnez l’analyse terminée et la vue presse. Dans le menu des services publics, choisissez l’exportation graphique métrique. Dans le menu régions, choisissez tous les puits et dans le menu de groupe, pour obtenir la valeur moyenne pour chaque ensemble de puits en tant que groupe, choisissez des répliques.
Et pour exporter les valeurs individuelles pour chaque puits, ne choisissez aucune. Dans le menu métrique objet rouge, choisissez l’intensité intégrée totale de l’objet rouge. Sélectionnez le bouton d’exportation de données.
Vérifiez décomposer les données en images individuelles. Les données sont automatiquement copiées sur un presse-papiers et peuvent être passées à un nouveau fichier de feuille de calcul. Dans le menu métrique de l’objet de phase, choisissez la confluence, puis cliquez sur le bouton d’exportation de données.
Dans l’onglet invite, vérifiez décomposer les données en images individuelles. Les données sont automatiquement copiées sur un presse-papiers et peuvent être passées au fichier de feuille de calcul contenant des données d’intensité intégrées à l’objet rouge total. Maintenant, les données exportées peuvent être normalisées, selon les étapes 4.1.7 et 4.1.8 du protocole, pour obtenir une valeur finale d’absorption de LDL.
Après traitement par Dynasore ou PCSK9 recombinant, les trois lignées cellulaires humaines testées ont montré des réductions significatives de l’afflux de LDL sur un cours de quatre heures. Les afflux de LDL réduits dans le carcinome hépatique humain ou les cellules d’HepG2, avec le traitement de Dynasore au cours du temps, comparé aux cellules traitées avec DMSO comme contrôle. L’imagerie cellulaire vivante de l’afflux de LDL dans les cellules HepG2 à différents moments a montré une augmentation du marché de l’absorption de LDL après traitement avec Simvastatin soutenant la sensibilité de cette méthode pour détecter des changements significatifs dans l’afflux de LDL.
Les images en temps réel étudiées au point de temps initial et au point final, confirment la morphologie normale des cellules suivant le traitement de Dynasore, indiquant l’efficacité et l’innocuité de ce composé. Après avoir ajouté d’autres LDL étiquetés rouges aux cellules pour préserver son activité fluorescente, il est important de protéger la plaque de la lumière jusqu’à ce qu’elle soit placée dans l’incubateur du système d’imagerie cellulaire vivante. Les cellules de différents organes peuvent réagir différemment aux traitements, c’est-à-dire dans des directions opposées, ou elles peuvent réagir dans les mêmes directions, mais présentent des taux différents de changement dans l’absorption du cholestérol.
Ce n’est qu’avec l’imagerie cellulaire vivante que de telles différences peuvent être détectées et quantifiées avec précision.
Aperçu
Cette étude présente une méthode d'imagerie de cellules vivantes pour la capture du cholestérol LDL dans divers types cellulaires humains. La technique permet le criblage de composés influençant le transport du LDL tout en autorisant la surveillance de la morphologie cellulaire afin de détecter une cytotoxicité potentielle.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Métabolisme du cholestérol
- Écrantage pharmacologique
Contexte
- Le rôle du cholestérol LDL dans les processus cellulaires
- L'importance de la surveillance de la santé cellulaire pendant les expériences
- L'application de l'imagerie de cellules vivantes en recherche biologique
Méthodes utilisées
- Système d'imagerie de cellules vivantes
- Lignées cellulaires humaines, y compris HepG2, HK2 et HCAEC
- Quantification de l'influx de LDL
Résultats principaux
- Réductions significatives de l'entrée de LDL observées avec le traitement à la Dynasore
- Augmentation de la captation de LDL dans les cellules HepG2 après traitement à la Simvastatine
- Morphologie cellulaire normale confirmée malgré les traitements par composés
Conclusions
- La méthode mesure efficacement la prise en charge des LDL et surveille la cytotoxicité
- Permet des investigations supplémentaires dans le métabolisme du cholestérol et le développement de médicaments
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthode permet la quantification simultanée de l'entrée de cholestérol LDL et le suivi en temps réel de la santé cellulaire, comblant ainsi un manque critique dans le criblage pharmacologique des cibles métaboliques et cardiovasculaires. En intégrant des mesures de cytotoxicité à des tests fonctionnels d'absorption, elle améliore la fiabilité prédictive dans l'identification de candidats thérapeutiques et réduit l'élimination en phase avancée due à une toxicité hors cible. La plateforme prend en charge un criblage allant du débit moyen à élevé sur divers types cellulaires humains pertinents, renforçant ainsi la pertinence translationnelle dans les processus de validation de cibles.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'endocytose médiée par le LDLR comme cible thérapeutique dans les troubles métaboliques, les maladies cardiovasculaires et les maladies rénales.
- Valeur opérationnelle : Offre une évaluation simultanée des effets d'un composé sur la capture des LDL et sur la morphologie cellulaire, facilitant la détection précoce de toxicités cellulaires.
- Valeur prédictive : Permet une détection mécanistique des risques en reliant la modulation pharmacologique de l'entrée des LDL aux résultats sur la santé cellulaire.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives et résolues dans le temps de l'entrée de LDL à l'aide de LDL marqué au pHrodo rouge et d'observations en cellules vivantes.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les formats standards de plaques à 24 puits et adaptable à divers systèmes d'imagerie, permettant la standardisation et la reproductibilité des tests.
- Extensibilité : Permet des mesures sérielles sur des périodes de quatre heures avec des intervalles horaires, permettant l'analyse cinétique des effets des composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Testé sur trois lignées cellulaires humaines (hépatiques, épithéliales tubulaires rénales, endothéliales de l'artère coronaire), reflétant des systèmes pertinents pour l'analyse des réponses croisées entre tissus.
- Compréhension mécanistique : Détecte des réponses différentielles à des composés tels que le Dynasore, la PCSK9 et la Simvastatine, soutenant la validation ciblée spécifique aux voies.
- Prise de décision ajustée au risque : Permet la normalisation des données d'absorption du LDL par rapport à la confluence cellulaire, améliorant ainsi la précision des données et la fiabilité des relations structure-activité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité de la découverte, de la validation de la cible à l'identification de l'élément précurseur, en fournissant des lectures fonctionnelles qui orientent la progression du « hit » au « lead » et la priorisation préclinique.
- Biologie du Développement : Soutient la vérification d'hypothèses sur les voies de régulation des LDL et l'interaction avec les cibles dans des cellules humaines présentant une pertinence physiologique.
- Criblage : Permet un format de test prêt à l'emploi, avec des protocoles standardisés de coloration, d'incubation et d'acquisition d'images pour le criblage de bibliothèques de composés.
- Analytique : Génère des métriques intégrées d'intensité et de confluence pouvant être normalisées afin d'obtenir des valeurs précises de captation des LDL par puits.
- Recherche Translationnelle : Utilise des lignées cellulaires dérivées de l'homme pour améliorer la valeur prédictive des modèles précliniques et l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en Milieu Professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour le criblage de modulateurs du métabolisme du cholestérol dans plusieurs domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation de la cible en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à la modulation de la voie des LDL.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à l'analyse automatisée des images et à des définitions standardisées du traitement.
- Valeur stratégique : Renforce la prise de décision « aller/ne pas aller » en associant des mesures d'efficacité à un criblage de la cytotoxicité dans un seul et même test.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur un équilibre entre efficacité vis-à-vis des LDL et profils de sécurité cellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en systèmes d'imagerie de cellules vivantes, en manipulation de sondes fluorescentes et en logiciels d'analyse basés sur l'image.
- Dépend de l'accès à des incubateurs à contrôle environnemental, à des objectifs 10x et à des capacités d'imagerie bicanales (rouge/phase).
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des cellules, de densité de semis et de jeûne pour des résultats reproductibles.
- Doit tenir compte des conditions de trypsination et de neutralisation spécifiques à chaque type cellulaire (par exemple, HepG2 par rapport à HK2 par rapport à HCAECs).
- Est limité par les risques de photodégradation si les plaques ne sont pas protégées de la lumière après marquage avec le LDL pHrodo rouge.
