Name: Analyse de la dynamique de lactomyosine à léchelle locale cellulaire et tissulaire à laide de films time-lapse de chambres doeufs drosophila cultivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez l'analyse de l'actomyosine dans les cellules épithéliales et les tissus courbes de Drosophila avec Fiji. Cette méthode accessible sans programmation permet d'étudier la morphogenèse tissulaire.

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Les auteurs sont très reconnaissants à Miriam Osterfield pour partager ses conseils sur l'imagerie de la vie in vitro des chambres d'oeufs en utilisant une approche adoptée par le laboratoire Celeste Berg4. Nous remercions également Sebastian Tosi pour le script Fidji qui permet la segmentation cellulaire.

<ol><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li>
<li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li>
<li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers%3A+A+History+and+Adaptable+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%2C+Volume+1%22">The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li>
<li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511(2014).</li>
<li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li>
<li>Haase, R. Surface manager. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018).</li>
<li>Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018).</li>
<li>Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li>
<li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li>
<li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cartography%3A+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li>
<li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Étapes critiques et dépannage pour la dissection et la culture des chambres d'oeufs
Si trop de mouches sont placées dans une petite fiole, la nourriture de mouche peut devenir boueuse après 2-3 jours en raison des quantités étendues de larves d'alimentation et les mouches adultes se coincer dans la nourriture de mouche. Dans un tel cas, retournez le reste de ces mouches dans une nouvelle fiole avec des aliments frais et réduire leur nombre. En particulier, exclure les femelles...

Le développement continu de nouvelles technologies d'imagerie et de logiciels avec des applications dans les sciences de la vie a eu un impact énorme sur la compréhension des principes de base de la vie. L'un des principaux défis est la visualisation fiable des processus de développement en combinaison avec leur imagerie en direct dans divers tissus. Les tissus font partie des organes et des corps et, en tant que tels, la majorité d'entre eux ne sont pas facilement accessibles pour l'imagerie. Par conséquent, des protocoles qui permettent leur dissection et la culture in vitro ont été développés afin de visualiser des événements biologiques qui reflètent suffisamment la situation in vivo au sein d'un corps vivant.
Au cours des dernières décennies, la culture et l'imagerie vivante des chambres d'œufs Drosophila, des structures semblables à des acinars ressemblant à des organes primitifs, ont énormément contribué à la compréhension des principes de base du développement des organes primitifs1 , 2 (en) , 3. Actuellement, il existe plusieurs protocoles de culture, et leur utilisation dépend du temps d'acquisition, du type de cellule à imager et de leur accessibilité (p. ex., lignée germinale interne par rapport à la ligne somatique extérieure)4.
Une caractéristique commune dans tous ces protocoles de culture est la nécessité de l'immobilisation des chambres d'oeufs analysées qui montrent une activité contractile élevée dans les médias liquides. L'activité contractile des chambres d'oeufs est causée principalement par la feuille de muscle qui couvre une longue chaîne de chambres d'oeufs connectés5,6,7. Par conséquent, pour parvenir à l'immobilisation appropriée des chambres d'oeufs jeunes, diverses approches ont été développées, impliquant la couverture des chambres d'oeufs avec des couvertures6,8,9 ou des couvertures flexibles4, 10 ou les intégrer dans l'agarose à faible point de fusion3,11. Ces approches sont populaires car elles permettent également l'imagerie d'un plan visuel plus grand en raison de l'aplatissement subtil de la surface circonférence des chambres d'oeufs.
Cependant, récemment, il a été démontré que les jeunes chambres d'oeufs (stade 1-8) tournent autour de leur axe antérieur-postérieur6 et que ce mouvement de tissu est actionné par un réseau fin d'actomyosine près de la surface circonférence de ces jeunes chambres d'oeufs 12. Par conséquent, l'altération artificielle de la surface cellulaire provoquée par un aplatissement subtil de ce tissu peut avoir un impact négatif sur le comportement de la machinerie d'actomyosine génératrice de force. Le contrepoint est que si le tissu de la chambre d'oeuf s'est aplati, l'imagerie microscopique des protéines à la surface circonférence des chambres d'oeufs devient encore plus limitée par la taille diminuée du plan d'acquisition.
Par conséquent, nous avons combiné des protocoles de Prasad et coll.9 et du laboratoire de Celeste Berg4,10 et nous les avons modifiés de façon à ce qu'aucune couverture/couverture flexible/agarose ne soit utilisée dans la méthode développée. Les chambres d'oeufs drosophiles sont librement cultivées dans les médias et le protocole présenté ici ne s'applique qu'à la microscopie inversée. Il y a deux parties au protocole. La première partie est axée sur l'analyse des signaux d'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules) dans les chambres d'oeufs. Dans la deuxième partie, nous nous concentrons sur le dépassement des limites associées à un petit plan d'acquisition causé par la culture libre des chambres d'oeufs. À cet égard, nous avons développé une nouvelle méthode de calcul basée sur Fidji avec une interface utilisateur graphique semi-interactive qui extrait sélectivement et déploie des couches définies d'une surface tissulaire circonférence. Ceci est suivi d'un protocole qui décrit comment analyser l'actomyosine à l'échelle tissulaire (c.-à-d., les cellules de 50). Comme l'extraction sélective d'une fine couche définie de tissus épithélials incurvés n'a pas été facilement possible à l'aide d'une projection classique de z-stack (Figure 1), cette méthode facile à utiliser sert de condition préalable importante pour comprendre comportement d'un mince réseau d'actomyosine à l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs de Drosophila.
En outre, pour faciliter le protocole, nous fournissons des exemples de films en time-lapse (TLMs) et des fichiers d'exemples de comportement myosin II non musclé fluorescent (voir Dossier supplémentaire 3). Myosin II est une protéine motrice et représente la partie contractile active de la machinerie actomyosine. Afin d'imageMyosin II, nous utilisons des lignes transgéniques Drosophila qui contiennent une chaîne de lumière réglementaire modifiée de Myosin II appelé MRLC::GFP (voir tableau des matériaux pour plus de détails)12,13. Afin de visualiser les membranes cellulaires, le protocole est basé sur des colorants commerciaux (voir Tableau des matériaux). Ce protocole convient non seulement à l'analyse de petits signaux subcellulaires MRLC::GFP12, mais aussi pour toutes les particules subcellulaires de taille similaire autour de 300 m, telles que celles observées avec Life-Act::GFP12,14.
Bien que ces deux protocoles soient présentés à l'aide de chambres d'œufs drosophila de culture in vitro, l'acquisition de signaux d'actomyosine peut également être effectuée à l'aide d'autres tissus lors de l'optimisation des supports de culture et en fonction de la disponibilité des protéines étiquetées fluorescentes avec des colorants commerciaux correspondants ou, par exemple, des microinjections d'ARNm pour obtenir des profils transitoires d'expression génique. De même, le protocole basé aux Fidji pour l'extraction d'une couche mince à partir d'une surface circonférence peut être appliqué plus généralement sur les tissus ellipsoïdes et organiques.

<table><tbody><tr><td>Schneider Medium</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>[+]-Glutamine</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp ;[ +] 10.000 unités/mL de pénicilline [+] 10.000 & micro ; g/mL de streptomycine</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; F135</td><td>Solution</td></tr><tr><td>d’insuline</td> inactivée par la chaleur <td>Human Sigma</td><td>&nbsp ; I9278</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes Falcon</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV033NS</td><td>33 mm</td></tr><tr><td>Fond en verre Plats à micropuits</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Boîte de Pétri de 35 mm, 14 mm Micropuits, n° 1,5 Verre de couverture</td></tr><tr><td>Pince</td><td>A. Dumont & Fils</td><td></td><td>&nbsp ;#55</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red (colorant pour membrane cellulaire)</td><td>Invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 (colorant pour membrane cellulaire)</td><td>ThermoFisher/Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Lame de dissection de dépression</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-560B</td><td></td></tr><tr><td>Équipement microscopique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>par exemple Zeiss</td><td></td><td>Stemi SV 6</td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé</td>, <td>par exemple Zeiss/Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à disque rotatif</td>, <td>par exemple Zeiss/Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre microscopique/verre de protection,</td><td>par exemple Thermo Scientific/Menzel Glas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cactus tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wironit porte-aiguille</td><td>Hammacher</td><td>9160020</td><td></td></tr><tr><td>Épine de cactus</td><td>Echinocactus grusonii/cactus baril<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Drosophila stocks utilisés dans le manuscrit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFP</td><td></td><td></td><td>Pour plus de détails, voir Rauzi et al. : Les flux contractiles d’actomyosine polarisés planaires contrôlent le remodelage de la jonction épithéliale. Nature 2010, vol. 468, p. 1110-1115.</td></tr><tr><td>AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFP/sqh-MRLC ::GFP ; fat258D/fat2103C</td><td></td><td></td><td>Pour plus de détails, voir Viktorinova et al. : La rotation épithéliale est précédée d’une brisure de symétrie planaire de l’actomyosine et protège le tissu épithélial des déformations cellulaires. PLoS Genetics 2017, vol. 13, numéro 11, p. e1007107.</td></tr></tbody></table>

analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Les œufs immatures de Drosophila sont appelés chambres d'oeufs, et leur structure ressemble aux organes primitifs qui subissent des changements morphologiques d'un rond à une forme ellipsoïde pendant le développement. Ce processus de développement est appelé oogenesis et est crucial pour générer des œufs matures fonctionnels pour sécuriser la prochaine génération de mouches. Pour ces raisons, les chambres à œufs ont servi de modèle idéal et pertinent pour comprendre le développement des organes animaux.
Plusieurs protocoles de culture in vitro ont été développés, mais il y a plusieurs inconvénients à ces protocoles. L'une consiste à appliquer diverses couvertures qui exercent une pression artificielle sur les chambres d'œufs imageafin de les immobiliser et d'augmenter le plan d'acquisition imagede de la surface circonférence des chambres d'oeufs analysées. Une telle approche peut influencer négativement le comportement de la machinerie actomyosine mince qui génère la puissance de faire pivoter les chambres d'oeufs autour de leur axe plus long.
Ainsi, pour surmonter cette limitation, nous culture Drosophila chambres d'oeufs librement dans les médias afin d'analyser de façon fiable machines actomyosin le long de la circonférence des chambres d'oeufs. Dans la première partie du protocole, nous fournissons un manuel détaillant comment analyser la machinerie d'actomyosine dans un plan d'acquisition limité à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules). Dans la deuxième partie du protocole, nous fournissons aux utilisateurs un nouveau plugin basé à Fidji qui permet l'extraction simple d'une mince couche définie de la surface circonférence des chambres d'oeufs. Le protocole suivant décrit ensuite comment analyser les signaux d'actomyosine à l'échelle des tissus (cellules de 50). Enfin, nous repérons les limites de ces approches à la fois à l'échelle cellulaire et tissulaire locale et discutons de son développement futur potentiel et des applications possibles.

Ce protocole permet aux scientifiques d'étudier le comportement des réseaux d'actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n'est possible que lorsqu'une analyse détaillée du comportement de l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (quelques cellules) est combinée à une analyse similaire à l'échelle tissulaire (de nombreuses cellules). Cependant, les tissus épithélialsont sont souvent courbés et l'extraction d'une mince couche de ces tissus n'était pas possible auparavant, comme le mo...

Ce protocole fournit une méthodologie basée sur les Fidji, conviviale avec des instructions simples expliquant comment analyser de façon fiable le comportement de l'actomyosine dans les cellules individuelles et les tissus épithéliales courbés. Aucune compétence en programmation n'est requise pour suivre le tutoriel; toutes les étapes sont effectuées de manière semi-interactive à l'aide de l'interface utilisateur graphique de Fidji et des plugins associés.

Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Notre protocole aide les scientifiques à analyser le réseau d’actomyosine subcellulaire dans les cellules épithéliales individuelles et leur permet également d’effectuer une analyse similaire à l’échelle multicellulaire dans les tissus épithéliales incurvés. Notre protocole est un bel exemple d’une application fidjienne. Il dispose d’une interface utilisateur graphique intuitive, et il ne nécessite aucune connaissance du script.Par conséquent, il est très approprié aussi pour les utilisateurs novices dans le domaine. Bien que notre méthode ait été développée pour les chambres d’oeufs de Drosophila, elle est également applicable en dehors de l’épithélie de Drosophila. Nous encourageons les scientifiques à tester notre protocole dans leurs systèmes modèles.Utilisez les fichiers de test accompagnés pour vous familiariser avec ce protocole. Il vous aidera à décider quelle partie de ce protocole convient à votre question de recherche individuelle. Cette partie du protocole permet aux utilisateurs de segmenter les cellules épithéliales dans des films en accéléré et d’analyser par la suite les impulsions d’actomyosine dans les cellules individuelles au fil du temps à l’aide du Gestionnaire de surface.Pour commencer, ouvrez Fidji et importez la macro TissueCellSegmentMovie. ijm tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, ouvrez un fichier TIFF corrigé à l’eau de Javel, et divisez les canaux du fichier corrigé à l’eau de Javel en allant à la barre de menu, en sélectionnant l’image, suivie de la couleur, et en sélectionnant les canaux fractionnants.Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du film sélectionné time-lapse en appuyant sur l’icône Exécuter dans le script ouvert. Afin d’obtenir un masque cellulaire agréable, réglez le flou gaussien à 2.500 et la sensibilité de détection cellulaire à moins un, et cliquez sur OK. Ensuite, réglez la tolérance au bruit estimée entre 10 et 20 pour les films time-lapse acquis avec l’objectif 63x, et cliquez sur OK. Un masque cellulaire généré apparaît dans le film time-lapse analysé, une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack apparaît, et une petite fenêtre appelée Action Required apparaît également. À partir du masque cellulaire sur le film time-lapse, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre, et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du film time-lapse.Lorsque les cellules sélectionnées au centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer ParticleStack comme un fichier TIFF. Ouvrez le fichier ParticleStack TIFF correspondant aux Fidji. Avec le plugin Surface Manager installé aux Fidji, ouvrez le plugin.Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton d’image Lire le contour et réglez l’index Jaccard à 60%Le chargement des contours peut prendre plusieurs minutes en fonction du nombre de cellules. Une fois chargée, chaque cellule se voit attribuer un numéro S et apparaît dans la partie gauche de la fenêtre Surface Manager. Cliquez sur le numéro S sélectionné afin que la cellule importée contour de ParticleStack1.tiff apparaît sur le film time-lapse. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours cellulaires tout au long du film, et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour supprimer une cellule indésirable, mettez en surbrillance le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.Utilisez l’outil Brosse pour corriger les contours des cellules. Une fois terminé, enregistrer les cellules corrigées comme un RoiSet. fichier zip.Pour identifier si les impulsions d’actomyosine sont présentes dans le tissu analysé et pour comprendre le comportement détaillé, aussi bien que la directionnalité des signaux d’actomyosin, commencez par ouvrir Fidji. Ouvrez un film en accéléré, chargez le ParticleStack1 enregistré. masque de cellule tiff et le film time-lapse corrigé à l’eau de Javel, puis charger le plugin Surface Manager et la région d’intérêt correspondante de la RoiSet.fichier zip. Ensuite, dans Surface Manager, activez un canal avec des signaux d’intérêt. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Tranche de valeur grise moyenne par tranche.Les intensités moyennes et médianes des signaux d’actomyosine seront affichées au fil du temps dans des unités arbitraires, ainsi que d’autres paramètres liés à la zone et à la forme de la cellule. Enregistrez les valeurs en tant que fichier de feuille de calcul en vous rendant à la fenêtre Statistiques, en cliquant sur Fichier et en sélectionnant Save As.Similarly, générez un masque cellulaire et chargez-le dans Surface Manager afin d’analyser les impulsions d’actomyosine à l’échelle des tissus. Cette partie du protocole permet aux utilisateurs d’extraire sélectivement une fine couche d’actomyosine dans le tissu épithélial incurvé au fil du temps.Ces étapes sont conviviales et basées sur une interface graphique intuitive. Ouvrez Fidji et assurez-vous que le plugin Ellipsoid Surface Projection est installé. Ensuite, ouvrez un film en accéléré et exportez-le sous la forme d’un fichier XML/HDF5 en cliquant sur Plugins, en allant à BigDataViewer et en sélectionnant l’image actuelle d’exportation sous forme de fichier XML/HDF5.Ensuite, ouvrez le fichier exporté dans Ellipsoid Surface Projection en allant à Plugins, en cliquant sur BigDataViewer, suivi par Ellipsoid Surface Projection, et en sélectionnant le fichier XML. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec des vues sagittales de la chambre d’oeufs, et un dialogue pour guider l’utilisateur à travers le traitement apparaîtra. La fenêtre de dialogue, appelée Ovaries Projection, a plusieurs onglets.Dans le premier onglet de dialogue, appelé boîte bondissante, définissez les bordures x et y d’une chambre d’oeufs dans le film time-lapse avec la largeur z de la boîte de dingage, et appuyez sur ensemble. Les parties sélectionnées de la chambre d’oeufs sont mises en surbrillance en rose. Ensuite, définissez la taille des blobs de signal dans l’onglet de dialogue appelé trouver des blobs dans la fenêtre de projection ovaries.Définissez le sigma et la valeur maximale minimale. Ensuite, appuyez sur calculer pour identifier les signaux actomyosin, qui apparaîtra comme des blobs verts. Réessayez cette étape avec différents paramètres jusqu’à ce qu’environ 100 taches soient trouvées.L’identification des signaux d’actomyosine est une étape cruciale. Cela dépend de la qualité du signal et de la taille correcte des blobs détectés. S’il n’y a pas de taches vertes visibles dans l’image, alors l’étape suivante ne fonctionnera pas.Pour concevoir l’ellipsoide, continuer avec l’onglet appelé ellipsoid ajustement. Réglez des échantillons aléatoires à 10 000, la distance de coupure entre l’extérieur et l’intérieur à un à 10, puis cliquez sur calculer. Après cela, l’onglet appelé projection s’ouvrira automatiquement et permet la définition de l’extraction de surface.Dans l’onglet projection, configurer une distance de projection minimale et maximale comme largeur de l’ellipsoide désiré. La distance de projection minimale et maximale doit s’adapter de sorte que la région ellipsoide définie rose inclut la couche extérieure entière de la chambre d’oeuf. Ensuite, définissez la distance de tranche comme une seule.Assurez-vous que la région rose de l’ellipsoide avec le défini avec sur la chambre d’oeuf est visible avant de presser calculer. Il aide à évaluer la qualité d’un nouvel ajustement ellipsoid. Ensuite, réglez une largeur de sortie de l’ellipsoide à plus ou égale à 800 et une hauteur qui est supérieure ou égale à 400.Ensuite, définissez la durée de l’extraction de surface et choisissez soit une projection sphérique, soit une projection cylindrique. Si nécessaire, retournez Z et alignez le calcul Y.Press pour obtenir une extraction de surface pour les deux canaux dans de nouvelles fenêtres appelées image. Ajustez la luminosité et le contraste des fenêtres d’image obtenues pour pouvoir voir les signaux d’actomyosine projetés en cliquant sur l’image, en allant ajuster et en sélectionnant luminosité/contraste.Si l’extraction de surface semble bonne, enregistrez les deux canaux séparément sous forme de fichiers TIFF. En outre, enregistrez le fichier fenêtre Log pour référence future quant à la façon dont la surface de cette chambre d’oeufs particulière a été extraite. Ensuite, fusionnez les canaux avec un code couleur préféré aux Fidji, et enregistrez les résultats sous forme de fichiers TIFF.Ce protocole permet aux scientifiques d’étudier le comportement des réseaux d’actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n’est possible que lorsqu’une analyse détaillée du comportement de l’actomyosine à l’échelle cellulaire locale est combinée avec une analyse similaire à l’échelle des tissus. On y voit des exemples représentatifs du comportement dynamique de la myosine II à l’échelle cellulaire locale et à l’échelle des tissus pour le contrôle et la graisse2 mutantes chambres d’oeufs Drosophila.Sur le plan basal unique, la chaîne de lumière réglementaire verte modifiée des signaux myosine II se déplace perpendiculairement à l’axe antérieur-postérieur des chambres d’oeufs de contrôle. Cette polarité est perdue dans les chambres d’oeufs mutantes fat2 et conduit à des impulsions anisotropiques de myosine II, oscillations Au niveau des tissus, la chaîne de lumière réglementaire verte modifiée de la myosine II dans l’échantillon de contrôle génère la force synchronisée nécessaire pour promouvoir la rotation épithéliale. En revanche, l’épithélium follicule d’une impulsion de chambre d’oeuf mutante fat2 fortement sur le côté basal et ne parvient pas à générer la force synchronisée nécessaire pour favoriser la rotation épithéliale.Dans une région apical mince de la chambre d’oeuf de Drosophila, le mutant fat2 présente également avec le comportement dynamique modifié de la chaîne de lumière réglementaire modifiée verte de myosin II.After regardant cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’analyser un réseau d’actomyosine à l’échelle locale et tissulaire dans les chambres d’oeufs de Drosophila utilisant Fidji. Pour plus de conseils pratiques et de dépannage, s’il vous plaît voir la partie discussion après le protocole. Si vous avez des questions liées aux Fidji ou à nos plugins, consultez les pages Web respectives ou contactez-nous.

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