Name: Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez la technique E plus E pour enrichir et élargir simultanément les cellules T antigène-spécifiques rares à l'aide de nanoparticules magnétiques. Cette méthode avance la recherche en immunothérapie personnalisée.

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J.W.H. remercie le centre de formation de la nanotechnologie de Cancer NIH au Johns Hopkins Institute nanobiotechnologie, la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures (DGE-1232825) et la Fondation d’ARCS de soutien de la bourse. Ce travail a été financé par le soutien de la National Institutes of Health (P01-AI072677, CA108835-R01, R21-CA185819), Initiative Innovation TEDCO/Maryland et la Fondation Coulter (JPS).

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<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572(2014).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433(2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : en vertu d’un accord de licence entre NexImmune et l’Université Johns Hopkins, Jonathan Schneck a droit à une part des redevances reçues par l’Université sur les ventes de produits décrits dans ce article. Il a également été des fondateurs de NexImmune et possède l’équité dans la société. Il est membre de la du NexImmune Conseil d’administration et Conseil scientifique. Aux termes de ces arrangements ont été examinés et approuvés par l’Université Johns Hopkins, conformément à sa politique de conflit d’intérêts.

Nous avons créé une technologie d’isolement des lymphocytes de T antigène-spécifiques nouveaux issue des nanoparticules artificiel (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Vamp de nanoparticules ont peptide-chargés MHC sur la surface qui permet la liaison spécifique de l’antigène des lymphocytes T et activation aux côtés de costimulation activation. Vamp est également paramagnétique et donc peut être utilisé pour enrichir les rares cellules de T antigène-spécifiques en utilisant un champ magnétique. Nous avons opt...

Avec la montée des immunothérapies beaucoup, il y a un besoin d’être en mesure de caractériser et de contrôler les réponses immunitaires. En particulier, la réponse immunitaire adaptative est intéressant en raison de la spécificité et la longévité des cellules. Récemment, les thérapies de récepteurs chimériques-antigène des lymphocytes T ont été approuvés pour le traitement du cancer ; Cependant, les récepteurs d’antigènes sont basées hors de la cellule surface antigène commun CD19, au lieu des antigènes spécifiques du cancer1. Au-delà de la spécificité, immunothérapies peuvent aussi souffrent du manque de contrôle et limitée à comprendre la réponse immunitaire dynamique au sein du cancer ou d’auto-immunité.
Un des défis de l’étude des réponses spécifiques à l’antigène est leur fréquence extrêmement basse, par exemple., lymphocytes T antigène-spécifiques sont : 1 de chaque 104 106 T cellules2,3. Ainsi, afin d’étudier quel T, les cellules sont présentes ou en réponse, les cellules doivent soit être enrichi et élargi, ou besoin de leur signal à amplifier. C’est cher et difficile à maintenir les cellules nourricières en utilisant les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’expansion des cellules antigène-spécifiques. Les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’amplification du signal de T antigène-spécifiques des cellules, comme le dosage de l’enzyme-linked immunospot (ELISPOT), limiter la réutilisation de ces cellules T4. Enfin, en raison de la faible sensibilité, souvent ces deux techniques doivent être combinés pour le dénombrement de l’antigène-spécifiques.
Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé l’antigène artificiel à base de nanoparticules magnétiques présentant cellulaire (VAMP)5,6,7,8. La VAMP peut être fonctionnalisée avec un complexe antigène-spécifiques-peptide signal chargé majeur d’histocompatibilité (pMHC) et les molécules de costimulation -e.g., un anticorps anti-CD28-à la fois enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et puis par la suite stimuler leur expansion (Figure 1). Les particules peuvent ainsi être un produit sur étagère rentable qui peut être aussi bien personnalisé pour répondre aux stimulations de l’antigène-spécifiques encore standardisé à travers des expériences et des patients. L’enrichissement et l’expansion traiter les résultats dans des centaines de milliers-pli expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène et peut entraîner des fréquences jusqu'à 60 pour cent après seulement une semaine, ce qui permet la caractérisation ou l’utilisation thérapeutique des grandes nombre de cellules. Dans les présentes, nous expliquent comment faire des nanoparticules Vamp, quelques considérations de conception critiques dans le choix des propriétés de nanoparticules et démontrer certains résultats typiques de l’utilisation de ces particules à isoler et à développer des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène rares.

<table><tbody><tr><td>DimerX I : Protéine de fusion humaine soluble recombinante HLA-A2 :Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I : Souris dimérique soluble recombinante H-2D[b] :Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I : Souris dimérique soluble recombinante H-2K[b] :Ig Protéine de fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932362</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>Bêta humaine purifiée 2 Microglobuline</td><td>Bio-Rad</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticules</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS Perles activées, 0,2 & micro ; m</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SN0200&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotine</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC Réticulant&nbsp ;</td><td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de 2-iminothiolane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque 96 Well Half-Area, polystyrène noir</td><td>Corning</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ig, &lambda ; 1, &lambda ; 2, & &lambda ; 3 Chaîne légère&nbsp ; Cloner &nbsp ; R26-46 ; &nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC souris anti-hamster arménien et syrien IgG&nbsp ; Cloner &nbsp ; G192-1</td><td>BD Biosciences</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6. souris Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgénique) souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005023</td><td></td></tr> souris <tr><td>C57BL/6J (B6 de type sauvage)</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+ T Cell Isolation Kit, souris</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-Phycoérythrine, SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>N52 disques magnétiques de 0,75 pouce.</td><td>K& J Magnetics</td><td>DX8C-N52</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorps anti-souris CD8a, clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration verte à cellules mortes vertes, pour une excitation de 488 nm&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichir et élargir les cellules rares t antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Nous avons développé un outil pour enrichir et développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Cela peut être utile dans des cas tels que A) détecter l’existence de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, B) sonde la dynamique des réactions antigène-spécifiques, C) comprendre les réactions antigène-spécifiques influencent l’état de la maladie telles que l’auto-immunité, D) démystifier hétérogènes réponses spécifiques de l’antigène des cellules T, ou E) utilisent des cellules antigène-spécifiques pour la thérapie. L’outil est basé sur une particule magnétique que nous avons conjugué antigène-spécifiques et les signaux de costimulation des lymphocytes T, et que nous appelons comme artificiels (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Par conséquent, étant donné que la technologie est simple à réaliser, il pourra facilement être adopté par d’autres laboratoires ; ainsi, notre but ici est de décrire en détail la fabrication et l’utilisation subséquente de la vamp. Nous expliquons comment attacher les signaux de costimulation et antigène-spécifiques à la VAMP, comment les utiliser pour enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et comment développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Par ailleurs, nous mettrons en évidence de conception technique, les considérations liées à l’information expérimentale et biologique de notre expérience avec la caractérisation des cellules T spécifiques de l’antigène.

Pour compléter un enrichissement réussie et l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène, le peptide-chargé MHC-Ig et les molécules de costimulation doivent être fixés avec succès à la particule de vamp. Basé sur les 3 méthodes de fixation de la particule, nous fournir des données représentatives pour un résultat de procédure conjugaison réussie (Figure 5 a). En effet, si la densité de ligand est trop faible, alors il sera pas une stimulation efficace...

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Ainsi, le principal avantage de notre nouvelle technique, nous l’avons appelé E plus E, qui signifie enrichissement plus expansion, est que nous pouvons enrichir et étendre ces cellules, cellules rares spécifiques aux antigènes, simultanément. Cela nous permet de développer un nombre suffisant de cellules que nous allons être en mesure d’utiliser pour étudier leur rôle dans différents contextes et dans différents contextes cliniques ou même nous permet de développer maintenant un grand nombre de cellules que nous pouvons utiliser pour l’immunothérapie d’une manière que nous ne pouvions pas avant. La méthode que nous avons développée, ce E plus E, peut aider à répondre à des questions clés en immunologie de base sur la présence de néoepitopes.Qu’est-ce que les néoepitopes? Ce sont les épitopes personnalisés que nous savons sont maintenant très importants en termes d’immunothérapie du cancer et aussi la dynamique spécifique aux antigènes et comment ces facteurs affectent les états de la maladie et pour une thérapie cellulaire efficace. Les implications de cette technique s’étendent vers l’immunothérapie, car la cellule artificielle d’antigène-présentation de nanoparticule pourrait êt

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Nous décrivons ici une méthode pour l'activation et l'expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l'antigène artificielles (VAMP). L'utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt...

Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

Cette vidéo décrit l’enrichissement en lymphocytes T de la rate d’une souris par sélection négative à l’aide d’un séparateur magnétique. La technique consiste à cibler les autres cellules de l’échantillon pour la déplétion à l’aide d’anticorps ou de ligands dirigés contre des antigènes de surface cellulaire spécifiques.

Enrichissement des lymphocytes T : une technique pour isoler les lymphocytes T d’une population cellulaire mixte par séparation magnétique

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’isoler des lymphocytes T CD8+ spécifiques à des antigènes rares à l’aide de cellules présentatrices d’antigènes artificielles (aAPCs) à base de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées avec des Ig-CMH chargées de peptides antigéniques et des anticorps anti-CD28. L’interaction des aAPCs avec les lymphocytes T CD8+ exprimant spécifiquement les récepteurs des lymphocytes T ciblant les peptides antigéniques, suivie de leur expansion in vitro, entraîne...

Enrichissement et expansion à base de nanoparticules de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène

Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse de nanoparticules de magnéto-plasmonique avec un moment magnétique fort et un (NIR) absorbance dans le proche infrarouge. Le protocole comprend également anticorps conjugaison à des nanoparticules à travers la partie Fc pour diverses applications biomédicales qui nécessitent un ciblage spécifique moléculaire.

Synthèse des Immunotargeted magnéto-plasmonique NANOAGRÉGATS

Nous présentons ici un protocole adapté qui peut être utilisé pour générer un grand nombre de lymphocytes T tueurs naturels invariants murins à partir de la rate de souris. Le protocole décrit une approche par laquelle les cellules spléniques iNKT peuvent être enrichies, isolées et développées in vitro à l’aide d’un nombre limité d’animaux et de réactifs.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

Un protocole pour la synthèse et la cationisation de la magnétoferritine dopée au cobalt est présenté, ainsi qu’une méthode pour magnétiser rapidement des cellules souches avec de la magnétoferritine cationisée.

Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Découvrez la technique E plus E pour enrichir et élargir simultanément les cellules T antigène-spécifiques rares à l'aide de nanoparticules magnétiques. Cette méthode avance la recherche en immunothérapie personnalisée.

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

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