Name: qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez le typage semi-automatisé quantitatif des gènes KIR (qKAT) pour l'immunogénétique. Cette méthode à haut débit permet d'analyser près de 1 000 échantillons par série et fournit le nombre de copies géniques avec fiabilité.

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Le projet a reçu des fonds du Medical Research Council (MRC), le Conseil européen de la recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (subvention, contrat n° 695551) et le National Institute of Health (NIH) de Cambridge Biomedical Research Centre et NIH recherche sang et Transplant Research Unit (NIHR BTRU) dans le don et la Transplantation de l’Université de Cambridge et en partenariat avec le sang de la NHS et transplantation (NHSBT). Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement celles de la NHS, le NIHR, le ministère de la santé ou le NHSBT.

1. préparation et électrodéposition d’ADN
<ol><li>Quantifier précisément la concentration de génomique à l’aide d’un instrument spectrophotométrique ou fluorimétrique.</li>
	<li>Diluer l’ADN à 4 ng/µL sur une plaque de 96 puits puits profonds. Inclure au moins un échantillon d’Adng de contrôle avec un nombre de copies connues et un contrôle sans modèle.</li>
	<li>Centrifuger les plaques 96 puits à 450 x g pendant 2 min.</li>
	<li>À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, répartir chaque échantillon en quatre exemplaires sur plaques 384 puits qPCR afin que chaque cupule a 10 ng d’ADN (2,5 µL/puits). Préparer au moins dix plaques 384 puits, un pour chaque réaction de qKAT.</li>
	<li>Si Adng est actuellement distribué depuis plus d’une plaque à 96 puits, effectuer un lavage de volume complet avec 2 % eau de Javel et eau ultrapure pour nettoyer les aiguilles du liquide système entre chaque plaque à 96 puits d’échantillons Adng de manutention.</li>
	<li>Sécher à l’air l’ADN en incubant les plaques 384 puits dans un endroit propre à température ambiante pendant au moins 24 h.</li>
</ol>2. préparation des amorces et des sondes
Remarque : qKAT se compose de dix réactions multiplexes. Chaque réaction comprend trois paires d’amorces et de trois sondes marquées fluorescence qui amplifient spécifiquement deux gènes KIR et gène une seule référence. Les sondes qui ont été publiés dans Jiang et al.,27 ont été modifiés afin que les oligonucléotides sont maintenant marqués avec ATTO colorants car ils offrent photostabilité améliorée et longues durées de vie. Pré-aliquotés d’amorces sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
<ol><li>Préparer des paires d’amorces pour chaque réaction selon les dilutions indiquées au tableau 1.</li>
	<li>Préparer les combinaisons de sonde pour chaque réaction conformément au tableau 1. Chaque sonde individuel avant de faire la combinaison de contrôle.</li>
</ol>3. préparation du Mix Master
NOTE Les volumes mentionnés ci-dessous sont pour effectuer une réaction de qKAT sur un ensemble de plaques de 10 x 384 puits.
<ol><li>S’assurer que les échantillons d’Adng plaqués sur les plaques 384 puits soient complètement secs. Procéder à toutes les étapes sur la glace et garder les réactifs couverts contre l’exposition à la lumière autant que possible, puisque les sondes marquées fluorescence sont photosensibles et thermo.</li>
	<li>Décongeler le tampon de qPCR, apprêt et sonde aliquotes à 4 ° C.</li>
	<li>Sur la glace, préparer un mélange maître pour plaques de 10 x 384 puits en ajoutant 18,86 mL d’eau ultrapure, 20 mL de tampon de qPCR et 1 000 µL de combinaison d’amorces des 180 µL de combinaison des sonde (tableau 2).</li>
	<li>Répartir le mélange maître à travers une plaque de profondeur 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, pipetage 415 µL à chaque puits. Garder cette plaque dans une glacière couverte de la lumière.</li>
	<li>À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, distribuer 9,5 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque 384 puits avec Adng séchée. Sceller la plaque avec une feuille et le placer immédiatement à 4 ° C. Répétez ce processus pour les plaques restantes, veiller à ce que les aiguilles du liquide système de manutention sont lavés avec de l’eau entre chaque plaque.</li>
	<li>Centrifuger les plaques 384 puits à 450 x g pendant 3 min et les incuber à 4 ° C durant la nuit ou entre 6 à 12 h pour remettre en suspension l’ADN et à dissiper les bulles d’air.</li>
</ol>4. qPCR Assay
<ol><li>Après l’incubation durant la nuit, centrifuger à 450 g pendant 3 min dissiper les bulles d’air restantes.</li>
	<li>Aux fins de l’automatisation, brancher la machine de qPCR (p. ex., LightCycler 480) à un gestionnaire de la microplaque (voir Table des matières). Programme gestionnaire microplaque afin de placer les plaques dans la machine de qPCR partir d’un quai de stockage refroidi abri de la lumière. NOTE les essais devraient, en théorie, travailler sur d’autres machines de qPCR avec paramètres optiques compatibles.</li>
	<li>Utiliser les conditions suivantes de cyclisme : 95 ° C pendant 5 min, suivi de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 66 ° C pendant 50 s, avec la collecte de données à 66 ° C.</li>
	<li>Une fois que la série est terminée, avoir le robot recueillir la plaque de la machine de qPCR et placez-le dans le dock de défausse.</li>
</ol>5. après l’exécution de l’analyse
<ol><li>Après amplification, calculer les valeurs de cycle (Cq) quantification à l’aide de la méthode maximale dérivée seconde ou la méthode des Points de lissage avec le logiciel de la machine de qPCR (voir Table des matières), suivant les étapes ci-dessous.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de qPCR et, dans l’onglet navigateur , ouvrez le fichier d’expérience de réaction enregistrée pour une plaque.</li>
	<li>
Pour l’analyse en utilisant la méthode maximale dérivée seconde, sélectionnez l’onglet analyse et de créer une nouvelle analyse à l’aide de la méthode Abs Quant/Second dérivé du Max.
	<ol>
<li>Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Second dérivé du Max, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : Rx-MPO (où x est le nombre de réaction).</li>
		<li>Sélectionnez Filtre peigne et choisissez VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Cela garantit que les données recueillies pour STAT6 sont sélectionnées.</li>
		<li>Sélectionnez couleur Compensation pour VIC/HEX/Yellow555(533-580). Cliquez sur calculer. Répétez cette opération pour Fam (465-510) et Cy5/Cy5.5(618-660). Cliquez sur enregistrer le fichier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour l’analyse à l’aide de la méthode d’ajustement Points, sélectionnez Abs Quant/Fit Points dans l’onglet analyse.
	<ol>
<li>Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Fit Points, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : RxF-MPO (où x est le nombre de réaction).</li>
		<li>Sélectionnez les filtres corrects et les compensations de couleur pour STAT6 et chacun des gènes KIR (Fam/Cy5). Dans l’onglet Noiseband , sélectionner la bande de bruit d’exclure le bruit de fond.</li>
		<li>Dans l’onglet analyse , la valeur des points de lissage 3 et sélectionnez que show points de lissage. Cliquez sur calculer. Cliquez sur enregistrer le fichier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. l’exportation des résultats
<ol><li>Dans le logiciel de qPCR, ouvrez le navigateur onglet sélectionnez Résultats Batch Export.</li>
	<li>Ouvrez le dossier dans lequel les fichiers de l’expérience sont enregistrés et transférer les fichiers dans la section droite de la fenêtre. Cliquez sur suivant. Sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier d’exportation.</li>
	<li>Sélectionnez le type d’analyse méthode Abs Quant/Second dérivé du Max ou Abs Quant/Fit Points. Cliquez sur suivant. Vérifiez que le nom du fichier, le dossier d’exportation et le type d’analyse sont correct et cliquez sur suivant pour démarrer le processus d’exportation.</li>
	<li>Attendez que l' État d’exportation est Ok. L’écran passera automatiquement à l’étape suivante. Vérifiez que tous les fichiers sélectionnés ont été exportés avec succès pour que le nombre de fichiers a échoué = 0. Cliquez sur terminé.</li>
	<li>Utiliser les scripts split_file.pl et roche2sds.pl pour couper les plaques exportés en réactions individuelles pour chaque plaque. NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub.</li>
</ol>7. copiez le numéro de calculs
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse numéro copie (par exemple, CopyCaller). Sélectionnez importer fichier de résultats de PCR en temps réel et charger des fichiers texte créés par roche2sds.pl.</li>
	<li>Sélectionnez analyser et procéder à l’analyse de chaque sélection échantillon étalon avec nombre de copie connue ou en sélectionnant le numéro de copie plus fréquent. Voir tableau 5 pour le nombre de copies plus fréquent des gènes KIR généralement observées dans les populations d’origine européenne.</li>
</ol>8. qualité des données vérifie
<ol><li>Utilisez le script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R de combiner des données de numéros de copie de toutes les plaques dans un tableur. NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub.</li>
	<li>Revérifier les données brutes sur le logiciel d’analyse numéro de copie pour les échantillons qui ne respectent pas le déséquilibre de liaison connue (LD) pour KIR gènes (tableau 6).</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
<li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+%28HLA%29+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+%28KIR%29+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+%28KIR%29+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li>
<li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-4-44">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li>
<li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A%2A11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li>
<li>Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li>
<li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li>
<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
<li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li>
<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
<li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+locus+polymorphisms%3A+genotyping+and+disease+association+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li>
<li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+%28KIR%29+gene+sequence+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li>
<li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li>
<li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection%3A+Evidence+for+discrete+immunological+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li>
<li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2DL1%2C+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qKAT%3A+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit une nouvelle méthode semi-automatisée haut-débit, appelée qKAT, ce qui facilite la copie numéro typage des gènes KIR . La méthode est une amélioration par rapport aux méthodes conventionnelles comme fournisseur de services partagés-PCR, qui sont de faible débit et peut seulement indiquer la présence ou l’absence de ces gènes très polymorphes.
L’exactitude des données numéros copie obtenues dépend de multiples facteurs, y compris la qualité et la concentration-homogénéité des échantillons Adng et la qualité des réactifs. La qualité et la précision des échantillons Adng à travers une plaque sont extrêmement importantes car les variations de concentration à travers la plaque peuvent entraîner des erreurs dans le calcul du nombre de copie. Étant donné que les tests ont été validés à l’aide des ensembles d’échantillons origine européenne, données de cohortes provenant d’autres parties du monde exigent des vérifications plus approfondies. Il s’agit de faire en sorte que les instances de décrochage de l’allèle ou liaison non-spécifique apprêt/sonde ne sont pas interprété à tort comme variation numéro de copie.
Alors que les tests ont été conçus et optimisés pour exécuter en tant que haut-débit, ils peuvent être modifiés pour exécuter moins d’échantillons. La métrique de confiance dans le logiciel d’analyse numéro de copie est affectée lors de l’analyse des échantillons de moins, mais cela peut être améliorée si les échantillons d’ADN génomiques contrôle avec un nombre connu de la copie du gène KIR figurent sur la plaque et répétitions d’échantillonnage supplémentaires sont inclus.
Pour les laboratoires sans liquide/plaque-manutention robots, mélange principal peut être dispensée à l’aide de pipettes multicanaux et plaques peuvent être chargés manuellement dans l’instrument de qPCR.
L’objectif principal derrière le développement de qKAT devait créer une méthode simple, de haut débit, haute résolution et rentable au génotype KIRs pour maladie études d’association. Ceci a été réalisé avec succès puisque qKAT a été employé dans l’enquête sur le rôle de KIR dans plusieurs études d’association de grandes maladies, y compris une gamme de maladies infectieuses, maladies auto-immunes et grossesse troubles4, 24 , 25 , 26.

Chez l’homme, le tueur récepteur immunoglobuline-like(KIR) locus est localisé sur le bras long du chromosome 19 dans le complexe de récepteur de leucocyte (LRC). Ce locus est d’environ 150 Ko de long et comprend 15 KIR gènes disposées tête à queue. Les locus KIR qui sont actuellement connues sont KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, et deux pseudogènes, KIR2DP1 et KIR3DP1. KIR gènes codent pour deux dimensions (2D) et tridimensionnels (3D) domaine d’immunoglobuline-like récepteurs avec short (S ; activation) ou long (L ; inhibitrice) pastilles cytoplasmique, qui sont exprimés par les cellules tueuses naturelles (NK) et de sous-ensembles de T cellules. Copie variation numéro exposé dans les formes de locus KIR différents haplotypes avec gène variable contenu1. Recombinaison homologue non-alléliques (NAHR), facilitée par un arrangement de gène de tête-à-queue étroite et haute-homologie, est le mécanisme proposé d’être responsable pour la variabilité haplotypique. Plus de 100 différents haplotypes ont été signalés dans les populations dans le monde1,2,3,4. Tous ces haplotypes pourrait être divisées en deux grands groupes : les haplotypes A et B. L’haplotype A contient 7 gènes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1et KIR3DL2, qui sont des gènes inhibiteurs de KIR et l’activation KIR gène KIR2DS4. Cependant, jusqu'à 70 % de personnes d’origine européenne qui sont homozygotes pour KIR haplotype A exclusivement effectuer une forme non fonctionnelle « suppression » de KIR2DS45,6. Toutes les autres combinaisons de gènes KIR forment d’haplotypes du groupe B, dont au moins un des gènes spécifiques KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, et KIR2DL5et comprennent généralement deux ou plusieurs gènes KIR activant.
Molécules HLA classe I ont été identifiés comme les ligands pour certains récepteurs inhibiteurs (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3et KIR3DL1), activant les récepteurs (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5et KIR3DS1), et pour KIR2DL4, qui est un unique KIR qui contient un long cytoplasmique queues comme autres récepteurs inhibiteurs de KIR, mais dispose également d’un résidu chargé positivement près le domaine extracellulaire qui est un commun fonction d’autres récepteurs KIR activant. La combinaison des variantes dans les gènes KIR et les gènes HLA influence interaction ligand du récepteur cette réactivité de cellules NK potentielle de formes au niveau individuel7,8. Preuves provenant d’études de liaison génétique a indiqué que le KIR joue un rôle dans la résistance virale (par exemple., le virus d’immunodéficience humaine [VIH]9 et l’hépatite C [VHC]10), le succès de la greffe 11, le risque de troubles de la grossesse et le succès reproducteur12,13, la protection contre les rechutes après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) la transplantation14,15, 16et le risque de cancers17.
La combinaison d’homologie de séquence haute et alléliques et haplotypiques diversité présente défis dans la tâche de façon précise les gènes KIR génotypage. Les méthodes conventionnelles de type KIR gènes comprennent amorce séquence-spécifique (SSP) polymerase chain reaction (PCR)18,19,20, séquence spécifique oligonucléotide sonde PCR (SSOP)21, et laser assistée matrice desorption ionisation et l’heure de vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS)22. Les inconvénients de ces techniques sont qu’ils fournissent seulement partiel aperçu le génotype d’un individu tout en étant aussi laborieux à effectuer. Récemment le séquençage de prochaine génération (NGS) a été appliqué pour taper le locus KIR spécifiquement. Alors que cette méthode est très puissante, il peut être coûteux à exécuter, et c’est beaucoup de temps mener des contrôles approfondis de données et d’analyse.
qKAT est une méthode PCR quantitative de haut débit. Alors que les méthodes conventionnelles sont laborieux et fastidieux, cette méthode permet d’exécuter presque 1 000 échantillons d’ADN (génomique) génomiques en cinq jours et donne le génotype KIR , ainsi que le nombre de copies du gène. qKAT se compose de dix réactions multiplexes, dont chacun vise deux loci KIR et un gène de référence d’un nombre de copie fixée dans le génome (STAT6) utilisé pour la quantification relative du gène KIR copier le numéro23. Ce test a été utilisé avec succès dans les études portant sur les panneaux de la grande population et cohortes de la maladie sur les maladies infectieuses comme le VHC, des maladies auto-immunes comme le diabète de type 1 et des troubles de la grossesse comme la pré-éclampsie, ainsi que fournir une génétique base à des études visant à comprendre les NK cell function1,4,24,25,26.

<table><tbody><tr><td><RÉACTIFS>FORTS</OLIGONU>CLÉOTIDES</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FORTS Sigma</td><td>Ordre personnalisé</td><td>SÉQUENCES : Répertorié dans le Tableau 4</td></tr><tr><td>Sondes étiquetées avec les colorants ATTO</td><td>Sigma</td><td>Ordre personnalisé</td><td>SÉQUENCES : Répertorié dans le Tableau 3</td></tr><tr><td>Sonde SensiFAST Kit No-ROX</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&minus ;</td></tr><tr><td>MilliQ eau</td><td>&moins ;</td><td>&minus ;</td><td>&minus ;</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse avec rotor à godets oscillants</td><td>Eppendorf(ou équivalent)</td><td>Eppendorf 5810R ou système</td><td></td>équivalent</tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit Fluoromètre</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II Instrument 384 puits</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II Microplate Handler avec M&eacute ; Empileur de plaques thermique Cour (M&eacute ; Cour)</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes monocanaux (plage de volume : 0,5 &ndash ; 10 et micro ; L, 2&ndash ; 20 et micro ; L, 20&ndash ; 200 et micro ; L, 200&ndash ; 1 000 et micro ; L; 1-10 mL)</td><td>Gilson(ou équivalent)</td><td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td><td></td></tr><tr><td>pointes de pipette sans RNase et DNase filtrées (10 & micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1 000 et micro ; L, 10 mL)</td><td>Starlab (ou équivalent)</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs StarTub PS, 55 mL</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 50 mL</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>Plaque pour puits profonds à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384 Plaques multipuits</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’étanchéité LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr><tr><td>l’identifiant</td><td></td><td></td><td>d’haplotype</td> KIR http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</tr></tbody></table>

qkat : quantitatif semi-automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Récepteurs de cellules tueuses immunoglobuline-like (RIC) sont un ensemble de récepteurs immunitaires inhibitrices et activation, tueuses naturelles (NK) et de lymphocytes T, codées par un cluster polymorphe des gènes sur le chromosome 19. Leurs ligands mieux caractérisés sont les molécules d’antigen (HLA) de leucocytes humains qui sont codés dans le locus (MHC) complexe majeur d’histocompatibilité sur le chromosome 6. Il y a des preuves substantielles qu’ils jouent un rôle important dans l’immunité, la reproduction et la transplantation, rend crucial d’avoir des techniques qui peuvent précisément génotype eux. Cependant, haute-homologie, aussi bien qu’allélique et variation numéro de copie, rendent difficile de génotype et efficacement les méthodes de conception qui peuvent avec précision tous les gènes KIR . Les méthodes traditionnelles sont généralement limitées dans la résolution des données obtenues, débit, la rentabilité et le temps nécessaire à la mise en place et d’exploiter les expériences. Les auteurs décrivent une méthode appelée quantitative KIR saisie semi-automatique (qKAT), qui est une méthode de PCR multiplex Real-Time polymerase haut débit qui permet de déterminer le nombre de copies du gène pour tous les gènes dans le locus KIR . qKAT est une méthode simple de haut débit qui peut fournir des données à haute résolution KIR copie numéros, qui permet plus d’en déduire les variations dans les haplotypes structurellement polymorphes qui englobent les. Ces données de nombre et haplotype de copie peuvent être bénéfiques pour les études sur les associations de maladies à grande échelle, la génétique des populations, ainsi que les enquêtes sur l’expression et les interactions fonctionnelles entre KIR et HLA.

Quantitative des cellules tueuses récepteur immunoglobuline-like (KIR) saisie semi-automatique (qKAT) est une méthode simple, haut-débit et rentable pour copier le numéros gènes de type KIR pour leur application dans les études d’association de la population et de la maladie.

qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés sur la génétique des récepteurs cellulaires NK telles que la diversité des haplotypes et comment cela se rapporte à la maladie. La démonstration visuelle de cette méthode aidera à définir le protocole dans votre laboratoire, y compris le processus d’automatisation et l’analyse des données. Les principaux avantages de cette technique sont que, contrairement aux méthodes conventionnelles, qKAT, qui signifie dactylographie automatisée quantitative KIR, est à haut débit et il fournit le numéro de copie génétique.qKAT peut fournir un aperçu de l’association de la maladie. Les implications de cette technique peuvent être utiles pour le traitement des infections virales comme le VIH et l’hépatite C, dans le cancer, dans la transplantation de cellules souches et les troubles de la grossesse. qKAT peut également être appliqué dans l’étude de la génétique des populations ainsi que dans l’exploration de l’expression et des interactions fonctionnelles entre les molécules KIR et HLA.qKAT se compose de 10 réactions multiplexes qui ciblent spécifiquement les exons des deux gènes KIR et d’un gène de référence. Dans ce protocole, des amorces spécifiques sont conçues pour détecter les allèles du gène donné et pcr se traduit par de courts amplicons. Après cela, des sondes d’hydrolyse spécifiques à double étiquetage sont utilisées pour surveiller l’amplification PCR en temps réel.L’analyse du nombre de copies utilise la quantification relative des gènes KIR cibles à un gène de référence. qKAT est conçu et mis en place pour être une technique à haut débit. Par conséquent, chaque réaction peut être effectuée sur un peu moins de 1000 échantillons.Les étapes suivantes montrent les étapes impliquées dans la préparation et le placage de chaque plaque d’ADN de 96 puits. Pour commencer, après la quantification de l’ADN, diluer l’ADN dans une plaque de puits profonds de 96 puits. Inclure au moins un échantillon de contrôle avec un numéro de copie connu et un contrôle non-modèle.Centrifuger la plaque à 450 gs pendant deux minutes. Ensuite, distribuez chaque échantillon en quadruplicate en plaques qPCR de 384 puits. Après cela, séchez l’ADN dans une zone propre à température ambiante pendant 24 heures.Pour configurer une réaction qKAT pour 10 plaques de puits de 384 puits, d’abord, décongeler le tampon qPCR, l’amorce et la sonde aliquots à quatre degrés Celsius. Préparer le master mix sur glace selon le protocole du texte. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour répartir le mélange principal uniformément sur une plaque de puits profonds de 96 puits.Distribuez 9,5 microlitres du mélange principal dans chaque puits de la plaque avec les échantillons séchés d’ADN. Après cela, sceller la plaque avec du papier d’aluminium et la conserver immédiatement à quatre degrés Celsius. N’oubliez pas d’effectuer un court lavage à l’eau pour nettoyer les aiguilles du système de manipulation liquide si vous distribuez le mélange principal sur plus d’une plaque d’ADN de 384 puits.Centrifuger la plaque avec les échantillons de gDNA à 450 gs pendant trois minutes. Ensuite, incubez la plaque à 4 degrés Celsius pour résusquer l’ADN et dissiper les bulles d’air. Après avoir incubé la plaque pendant la nuit, répétez la centrifugation pour dissiper les bulles d’air.Ensuite, placez la plaque dans le quai de rangement refroidi. Connectez la machine qPCR à un gestionnaire de microplaque. Ensuite, programmez le gestionnaire de microplaque selon le protocole de texte.Une fois la course terminée, demande au robot de récupérer la plaque de la machine qPCR et de la placer dans le quai de défausse. Après avoir terminé l’amplification, ouvrez le logiciel qPCR. Sous l’onglet Navigator, ouvrez le fichier d’expérience de réaction enregistré pour une plaque.Ensuite, ouvrez la fenêtre Créer une nouvelle analyse et sélectionnez les paramètres appropriés pour la 2ème méthode Derivative Max. Sélectionnez ensuite Filter Comb et assurez-vous que les données collectées pour STAT6 sont sélectionnées. Sélectionnez la compensation de couleur appropriée.Cliquez sur Calculer, puis cliquez sur enregistrer le fichier. Pour analyser les données avec la méthode Fit Points, ouvrez la nouvelle fenêtre d’analyse Créer et sélectionnez les paramètres appropriés pour la méthode Fit Points. Ensuite, sélectionnez les filtres corrects et les compensations de couleur pour STAT6.Réglez la bande de bruit pour exclure le bruit de fond. Après cela, ouvrez l’onglet Analyse et réglez les points d’ajustement à trois, et sélectionnez Afficher les points d’ajustement. Enregistrez les modifications et répétez les étapes avec les paramètres appropriés pour Fit Point et la 2ème analyse dérivée pour les gènes KIR.Ouvrez l’onglet Navigator dans le logiciel qPCR et sélectionnez Results Batch Export. Ensuite, ouvrez le dossier contenant les fichiers d’expérience et transférez-les sur le côté droit de la fenêtre. Cliquez ensuite et sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier d’exportation.Après cela, sélectionnez le type d’analyse d’intérêt et cliquez sur Suivant. Assurez-vous que le nom du fichier, le dossier d’exportation et le type d’analyse sont corrects avant de cliquer sur Suivant pour démarrer le processus d’exportation. Lorsque l’état d’exportation passe à OK, l’écran passe automatiquement à l’étape suivante.Assurez-vous que tous les fichiers sélectionnés ont été exportés avec succès et cliquez sur Done. Ensuite, utilisez les scripts dans le protocole texte pour diviser les plaques exportées en réactions individuelles et pour convertir les fichiers en un logiciel lisible par un logiciel d’analyse de numéro de copie. Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse des nombres de copies et sélectionnez le fichier de résultats PCR en temps réel d’Importation pour charger les fichiers texte créés par les scripts.Enfin, sélectionnez Analyser et effectuez l’analyse en sélectionnant le numéro de copie de l’échantillon le plus fréquent. Dans ce protocole, la dactylographie semi-automatisée, ou qKAT, a été utilisée pour copier des gènes KIR de type nombre. Le numéro de copie le plus fréquent pour KIR2DL4 était deux copies tandis que le numéro de copie le plus fréquent pour KIR3DS1 était zéro.Tout en essayant cette procédure, il est extrêmement important de s’assurer que l’ADN est quantifié avec précision, de procéder à toutes les étapes sur la glace, et de s’assurer que les réhésifs sont couverts de lumière. Il est également important d’effectuer des vérifications approfondies des données brutes pour les échantillons qui ne sont pas conformes aux règles connues de LD pour les gènes KIR. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, par exemple, la présence de gènes de fusion, ou l’identification de nouveaux allèles.Après son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunogénétique pour explorer le rôle de kir dans la biologie cellulaire de NK, la résistance aux maladies, et la reproduction humaine.

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