Détection du monoxyde d’azote dans le sang en mesurant Phosphorylation VASP plaquettaire

Ce protocole traite de l’utilisation potentielle de plaquettes comme capteur d’oxyde nitrique hautement sensible à la fois in vitro et in vivo dans le sang. L’augmentation de la phosphoprotéine stimulée par vasodilatateur phosphorateur ou de la sérine P-VASP 239 dans les plaquettes oxyde nitrique présente certains avantages, y compris la capacité de détecter la présence d’oxyde nitrique dans les lignées nanomolaires. Dans les deux heures suivant la collecte de 30 à 50 millilitres de sang entier auprès d’un donneur sain, ajouter cinq millilitres aliquots du sang dans le nombre approprié de tubes coniques de 15 millilitres pour la centrifugation.

Utilisez une pipette de transfert en plastique pour recueillir soigneusement le plasma riche en plaquettes de la partie supérieure des supernatants. Pelleter les plaquettes riches en plasma avec une deuxième centrifugation et laver délicatement les granulés en cinq millilitres de tampon CGS. Centrifugeuse à 400 g pendant 10 minutes à température ambiante.

À la fin de la centrifugation, resuspendez les granulés en trois millilitres de tampon Tyrode modifié. Utilisez un hémocytomètre pour compter et ajuster la densité des suspensions plaquettaires à trois fois 10 à la huitième cellule par millilitre dans le tampon tyrode frais. Puis incuber les suspensions plaquettes pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Pendant ce temps, recueillir les globules rouges à partir des couches plasmatiques sans plaques des échantillons de sang entier par centrifugation suivie de quatre lavages en cinq millilitres de PBS par lavage. Après le dernier lavage, jetez les supernatants et mélangez les globules rouges avec un millilitre des plaquettes riches en plasma à l’hématocrit expérimental approprié dans des bouteilles de polypropylène fermées avec des bouchons en caoutchouc. Insérez une aiguille reliée à un réservoir d’essence d’hélium dans chaque septa et insérez des aiguilles de calibre 26 pour faire des prises de gaz.

Puis faites tourbillonner lentement les bouteilles à température ambiante et utilisez un oxymètre pour mesurer la pression partielle d’oxygène pour la surveillance du processus de désoxygénation. Le taux de diminution de l’oxygène dépend du débit d’hélium et de la vitesse d’agitation. Par conséquent, l’heure de l’oxygénation doit être optimisée avant de commencer une expérience car cela dépend fortement de la géométrie de la configuration expérimentale.

Pour réduire le nitrite des globules rouges, utilisez une microsyringe pour injecter du nitrite à travers le septum dans les échantillons désoxygénés de PRP et de RBCs afin d’atteindre une concentration finale de 10 micromolaires. Incuber les échantillons pendant au moins 10 minutes à 37 degrés Celsius et transférer un millilitre de chaque échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour centrifugation. Transférer 300 microlitres de suspension plaquettaires de la partie supérieure des supernatants dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse et ajouter du dextrose de citrate acide à chaque tube à un rapport d’un à neuf.

Centrifugez à nouveau les plaquettes et resuspendez les granulés dans 80 microlitres de tampon de lyse glacée contenant un cocktail inhibiteur de la protéase de trois à chaque tube. Ensuite, chargez 15 microgrammes de protéines de chaque échantillon à deux gels distincts de 10% SDS-PAGE. Faire fonctionner les gels à 120 volts pendant 1,3 heure.

À la fin de la course, transférer les gels dans les membranes individuelles de cellulose nitreux et bloquer toute liaison non spécifique avec un volume approprié de 5% de lait sec non gras. Incuber les membranes avec les anticorps primaires appropriés pendant la nuit à quatre degrés Celsius, suivie de l’étiquetage avec un anticorps approprié de radis de cheval secondaire peroxidase pendant 45 minutes à température ambiante. Exposez ensuite les membranes avec un imageur pour quantifier la densité de la bande avec un programme d’analyse d’image approprié.

Les échantillons de sang veineux sains ont des valeurs partielles de pression d’oxygène entre 50 et 80 millimètres de mercure. La désoxygénation par hélium diminue rapidement la pression partielle de l’oxygène à 25 millimètres de mercure dans les 10 minutes. D’autres diminutions de la pression partielle d’oxygène peuvent être réalisées avec un temps accru de désoxygénation.

La désoxygénation accrue mène aux niveaux accrus d’hémolyse comme indiqué par le plasma de couleur de plus en plus rouge. Il s’agit d’un effet de désoxygénation et n’est pas causé par l’agitation elle-même comme indiqué par le manque d’hémolyse dans les échantillons agités sans hélium. Les niveaux d’expression Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein ou VASP et Phosphorylated-VASP dans les plaquettes ont diminué avec l’hématocrit croissant dans les échantillons désoxygénés tels que détectés par la tache occidentale.

Le traitement avec un donneur d’oxyde nitrique de courte durée augmente l’expression phosphorylatée de phosphoprotéine vasodilatateur-stimulée dans les plaquettes dans les 10 secondes du traitement. De plus, les niveaux de phosphorylated-VASP ou de P-VASP sont demeurés stables jusqu’à 10 minutes après l’incubation du donneur NO avec plasma riche en plaquettes, ce qui indique qu’il y a suffisamment de temps pour séparer les CFC des plaquettes sans affecter les niveaux existants de P-VASP. Nitrite augmente également les niveaux de P-VASP du plaquette en présence de RBCs désoxygénés.

Ici, le rapport P-VASP au VASP total dépend du niveau d’hématocrit. Vasp est fortement exprimé dans le plaquette et il est rapidement phosphorylated en présence d’oxyde nitrique. Par conséquent, ce protocole fournit une méthode pour étudier l’induction de l’oxyde nitrique par divers stimuli physiologiques.

Avec cette méthode, nous avons employé avec succès le P-VASP accru dans le plaquette comme marqueur de stimulation d’oxyde nitrique par nitrite inhalé in vivo. N’oubliez pas que le travail avec plaquette avec un spécimen biologique doit toujours être effectué à l’aide de l’équipement de protection personnelle approprié.