Purification de H3 et H4 histones et la Quantification des histones acétylées marques dans les cellules et les tissus cérébraux

Cette méthode permet une quantification précise des histones de base H3 et H4 et de leurs modifications post-translationnelles à partir d’extraits cellulaires et tissulaires conduisant ainsi à la génération de résultats reproductibles de haute qualité. La technique présentée présente trois avantages principaux. Tout d’abord, il préserve les modifications post-translationnelles natives des histones.

Deuxièmement, il contourne les méthodes coûteuses à faible débit. Enfin, il est entièrement compatible avec les applications à débit moyen en aval. Karolina Janczura, une étudiante diplômée talentueuse de mon laboratoire, a pleinement optimisé ce protocole et utilisé cette technique pour répondre à d’importantes questions concernant la régulation épigénétique de la maladie d’Alzheimer.

Pour commencer plaque les cellules dans des plats de culture tissulaire de 10 centimètres avec les médias appropriés de culture cellulaire selon le protocole de texte. Laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 90% de confluence. Après que les cellules ont atteint la confluence désirée aspirent doucement le média de culture et lavent les cellules deux fois avec le corps sérique préchauffé-libre.

Après cela, retirez le média sans sérum des cellules et placez les plats de 10 centimètres sur la glace. Ajouter un millilitre de tampon d’extraction glacée à chaque plat. À l’aide d’un grattoir à cellules en plastique, recueillir les cellules dans le tampon d’extraction et les transférer dans un tube étiqueté de 1,5 millilitre.

Ensuite, placez les tubes sur la glace. Si des tissus congelés sont utilisés, placez le tissu dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et décongelez-le brièvement sur la glace. Ensuite homogénéiser le tissu cérébral avec un homogénéisateur portatif en utilisant la quantité recommandée de tampon d’extraction et le nombre d’accidents vasculaires cérébraux.

L’homogénéisation est complète lorsqu’il n’y a pas de fragments de tissus visibles et que la solution prend une apparence laiteuse. Après cela, utilisez une pipette à un seul canal de 1 000 microlitres pour transférer l’homogénéité dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et placer les tubes sur la glace. Placez le tube contenant les lysates cellulaires et les tissus cérébraux homogénéisés sur une plate-forme rotative tournant à 15 RPM à quatre degrés Celsius.

Après cela, centrifuger le tube à la vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et jetez la pastille. Ensuite, neutralisez les histones avec un volume de 1/4 de tampon de neutralisation, et mélangez en pipetting de haut en bas.

Utilisez des bandes de pH pour vérifier le pH du mélange, et ajustez davantage le pH avec tampon de neutralisation si nécessaire. Si les histones acides ne sont pas neutralisées au cours de cette étape, elles ne se lient pas correctement à la membrane de la colonne, la traversent et seront détectées dans le flow-through. Ajouter 37,5 microlitres de l’échantillon à 12,5 microlitres de tampon échantillonné.

Après une brève centrifugation denature le mélange à 99 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, placez les tubes sur la glace et faites-les tourner brièvement pour recueillir le condensat. Chargez l’échantillon sur un gel SDS-PAGE et exécutez le gel à 100 volts pendant une heure.

Puis tacher le gel pendant la nuit. Et le détenir pendant trois lavages consécutifs. Ajoutez d’abord 500 microlitres de tampon d’équilibration à chaque colonne de spin.

Centrifuger la colonne pendant trois minutes. Jetez le flow-through et répétez la centrifugation une fois de plus. Après cela ajouter 500 microlitres de l’échantillon à la colonne.

Centrifuger la colonne pendant trois minutes et de recueillir le flux à travers. Analysez ensuite le flux de la colonne tel qu’il a été décrit précédemment. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage à la colonne.

Centrifuger la colonne pendant trois minutes et de recueillir le flux à travers. Transférez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté. Ajouter 50 microlitres de tampon d’élitution histone à la colonne.

Après avoir centrifugé la colonne enregistrer le flow-through contenant des protéines histone. Sous une hotte chimique ajouter de l’acide perchlorique aux histones purifiées pour atteindre une concentration finale d’acide perchlorique de 4%. Pipette de haut en bas six fois pour mélanger.

Si les histones de l’échantillon sont très concentrées, la solution deviendra trouble après l’ajout d’acide perchlorique. Après cela, incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Si les précipitations d’histone pendant la nuit sont réussies, une petite pastille blanche sera visible sur le fond du flacon après l’étape de centrifugation.

Lorsque vous lavez la pastille dans les étapes consécutives, assurez-vous que la pastille n’est pas dérangée car elle peut facilement se détacher du fond du flacon. Le lendemain, centrifuger les échantillons pendant 75 minutes dans des tubes de microcentrifugeuse pré-réfrigérés. Aspirez soigneusement le supernatant et ajoutez 500 microlitres d’acide perchlorique glacé à l’échantillon granulé.

Après avoir centrifugé l’échantillon pendant 10 minutes à la vitesse maximale, aspirer le surnatant. Ajouter 500 microlitres d’acétone glacée à l’échantillon en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ensuite, retirez le surnatant et laissez sécher les tubes non plafonnés sur la glace pendant 30 minutes.

Retirez ensuite les tubes de la glace et laissez sécher l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois que la pastille est sèche, réutilisez-la dans 30 microlitres d’eau stérile. Caper les tubes et laisser les histones se reconstituer sur la glace pendant 30 à 50 minutes.

Après avoir vérifié que la pastille est résuspendée, récapitulez les tubes et retirez-les de la glace. Dans ce protocole histones des cellules microgliales humaines de BV-2 ont été purifiées et la composition d’extrait a été analysée. Le gel taché démontre que les temps d’extraction entre 15 minutes et 24 heures n’ont pas affecté la composition globale des extraits bruts d’histone.

L’efficacité de la liaison histone à la matrice de la colonne a été analysée par coloration du gel. L’efficacité de la colonne était d’environ 100 %, comme en témoigne l’absence de protéines histones détectables dans le flow-through de la colonne. Quelle que soit la durée de l’extraction, c’est-à-dire

15 minutes, 2 heures ou 24 heures. le lavage de première colonne élimine la plus grande quantité de protéines non-histone de l’extrait. Les fractions purifiées de protéine d’histone du groupe d’extraction de 24 heures ont contenu plus d’histones de H3 et de H4 par rapport aux temps d’extraction de 15 minutes et de deux heures.

L’élitution de la première colonne était environ 100% efficace comme en témoigne le manque de protéines d’histone dans la seconde élucidation. Des histones brutes ont ensuite été extraites du cerveau entier de souris et des modifications post-translationnelles ont été mesurées. En réponse à l’inhibiteur de l’HADC à action large, tributyrine, h4K12 acetylation a augmenté dans l’extrait.

Cependant, la spécificité de l’anticorps a diminué en raison de la présence d’impuretés dans l’extrait brut. Le protocole de purification d’histone a été complété avec le cortex préfrontal des souris a/d transgéniques triples traitées avec l’inhibiteur de HDAC de classe I et d’IIb, M344, et la fraction pure simple d’histone de noyau a été évaluée pour des changements dans l’acétylation de H4K12. Des histones totales ont été détectées et une augmentation significative de l’acétylation H4K12 a été observée en réponse au M344.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les différents points de contrôle décrits dans le protocole pour valider la purification réussie de l’histone tout au long du processus. Suite à cette procédure, d’autres questions concernant la phosphorylation de l’histone et l’état de méthylation peuvent être abordées. Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs de notre laboratoire pour analyser les mécanismes génétiques impliqués dans la maladie d’Alzheimer.

Cependant, il peut être utilisé dans une variété de modèles de la maladie où la modification de la chromatine est supposée jouer un rôle important.