Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' In Vitro

Cette méthode a le potentiel d’améliorer la différenciation des cellules souches neurales in vitro et de contribuer au traitement des maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson. Les principaux avantages de cette technique sont que les plasmas atmosphériques froids peuvent être appliqués en une seule étape pour la différenciation dirigée sûre des cellules souches neurales pour la transplantation de tissus. Le plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des cellules souches neurales dans un court laps de temps de traitement.

Et avec besoin plus de dommages aux cellules, fournissant les cellules désirées pour la transplantation. Commencez par ensemencer environ cinq fois dix à la cinquième cellule souche neurale murine dans un flacon carré de 25 centimètres. Contenant cinq millilitres de DMEM complet pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Lorsque les cellules atteignent 85 pour cent de confluence, laver la culture avec un millilitre de PBS. Avant le traitement, avec un millilitre de trypsine de 25 pour cent pendant une minute. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec un millilitre de milieu de culture.

Et pipette plusieurs fois pour générer une suspension à cellule unique. Après comptage, diluer les cellules à deux fois dix à la quatrième cellule par concentration millilitre. Ensemencer un millilitre de cellules souches sur un glissement de couverture recouvert de poly-D-lysine par puits dans neuf puits d’une plaque de culture de 12 cellules.

Vérifiez la densité cellulaire au microscope. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant 12 heures. Lorsque les cellules se sont attachées, laver le couvercle glisse deux fois avec un millilitre de PBS par lavage, et traiter les cellules avec un milieu de différenciation pendant 48 heures.

Pour l’acquisition du jet, connectez d’abord le fil de sortie de l’alimentation électrique à l’appareil à réaction plasma. Et la pointe de la sonde à haute tension avec le fil de sortie pour détecter la tension. Connectez ensuite l’autre extrémité de la sonde à haute tension à l’oscilloscope pour enregistrer les informations de la tension de sortie.

Vérifiez l’ensemble du circuit pour vous assurer que l’alimentation électrique, l’oscilloscope et la sonde à haute tension sont tous cloués au sol. Et vérifiez la conduite de gaz pour vous assurer que le tube à gaz est connecté à l’appareil à réaction plasma. Ensuite, ouvrez les valves de gaz d’hélium et d’oxygène et réglez le flux de gaz à un rapport d’un litre à 01 litres par minute d’hélium à l’oxygène.

Vérifiez à nouveau le circuit et appuyez sur le bouton de sortie pour créer un jet plasma. Pour traiter plasma les cellules souches neurales, réglez la distance entre la buse de seringue et le premier puits de cellules à 15 millimètres. Remplacez les supernatants dans les cultures de cellules souches neurales par 800 microlitres de milieu de différenciation frais.

Et placez la plaque sous les jets de plasma. S’assurer que la buse de seringue est fixée au-dessus du centre de chaque puits. Créer trois puits avec plasma pendant 60 secondes par traitement, et trois puits avec un pour cent d’hélium et de gaz d’oxygène pendant 60 secondes par traitement.

Laissant trois puits non traités, comme contrôles. Remplacez ensuite les supernatants par un millilitre de milieu de différenciation frais. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant six jours.

Vérifiez quotidiennement l’état de différenciation des différents groupes, sous un microscope à contraste de phase inversé. Après le traitement, laissez les cellules s’équilibrer complètement dans le milieu de la condition pendant environ une heure avant de remplacer le supernatant par un milieu de différenciation frais. Pour l’analyse de l’immunofluorescence, fixer les cultures avec 500 microlitres de quatre pour cent de paraformaldéhyde par puits pendant 20 minutes à température ambiante.

Suivi de trois rinçages doux de cinq minutes, avec un millilitre de PBS par lavage. Ensuite, perméabilize les échantillons fixes avec 2 pour cent Triton X-100 en PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Suivi d’un rinçage doux comme démontré.

Après le dernier lavage, bloquer toute liaison non spécifique avec un millilitre de sérum de chèvre de 10 pour cent dans PBS par échantillon pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étiqueter les cellules de chaque puits avec 300 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Suivi de trois lavages dans PBS comme démontré.

Après le dernier lavage, étiquetez les cellules avec 300 microlitres des anticorps secondaires appropriés. Incuber pendant deux heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. Rincez ensuite doucement les cellules avec un millilitre de PBS par puits pendant dix minutes à température ambiante.

Imagez les cellules sur un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés. Les cellules souches neurales traitées au plasma présentent un taux de différenciation accéléré et un rapport de différenciation plus élevé par rapport au contrôle non traité, et le flux de gaz a traité les cellules souches. Après le traitement plasmatique, Nestin diminue.

Beta-Tubulin III augmente considérablement. Et o4 augmente légèrement, par rapport au contrôle traité et le flux de gaz traités cellules souches. En outre, après 60 secondes de traitement de plasma, une expression robuste du neurone mûr, du neurone cholinergique, et des marqueurs de neurone moteur est observée.

Avec très peu de neurones GABAergic et sérotonergiques, et aucun neurone dopaminergique détecté. Tout en essayant ces procédures, il est important de se rappeler, traiter les cellules avec le dosage approprié de plasma, parce qu’une longue et intense période de traitement de plasma incitera l’apoptose cellulaire ou la nécrose. N’oubliez pas également de pré-tester la viabilité de la cellule avant l’application en aval.