Name: Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez l'évaluation des effets pro et anti-inflammatoires des protéines de signalisation dans un modèle de souris IBD induit par DSS. Cette méthode permet d'étudier l'influence génétique sur l'inflammation intestinale.

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Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation de Sciences naturelles nationales de la Chine (81671016, 31471008 et 31661143030) et le National Institutes of Health (DC010012, DC015819) et par la Fondation d’éléments.

Toutes les expériences portant sur des souris ont été examinées et approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités de l’Université de Zhejiang. Il est conseillé de porter des équipements de protection individuelle appropriés avant d’effectuer ce protocole.
1. préparation des souris et DSS
<ol><li>Garder la souris (α-gustducin- / -) et âge, sexe et témoins de type sauvage de même poids de corps (α-gustducin+ / +) souris C57BL/6 individuellement dans des cages propres. Remarque : Les souris génétiquement déficientes ont été rétrocroisés avec souris C57BL/6 depuis plus de 20 générations et ont un presque 100 % C57BL/6 fond génétique.</li>
	<li>Dissoudre 30 g de dextran sulfate de sodium (DSS) en poudre dans 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave. Mélanger jusqu'à ce que la solution devienne claire pour s’assurer que la concentration finale de travail est de 3 % (p/v). Remarque : La solution DSS peut être stockée à température ambiante pendant 1 semaine ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>2. induction et évaluation de colite DSS chez la souris
<ol><li>Pesez et consignez le poids corporel initial de chaque souris. Placez les souris individuellement dans des cages en plastique standards et étiqueter les cages.</li>
	<li>Remplacez régulièrement l’eau potable par solution DSS 3 % pour un total de 7 jours, à laquelle les deux groupes de souris ont accès ad libitum.</li>
	<li>Mesurer le poids du corps de la souris, enregistrer la consommation de solution DSS et recueillir et examiner les selles de chaque souris tous les jours pendant l’administration de DSS. Observez la gravité de la diarrhée et des saignements rectaux et convertir cette maladie induite par le DSS indice12.</li>
	<li>Pendant l’expérience, le pourcentage de perte de poids par rapport au poids initial et l’index de la maladie sont calculées afin d’évaluer les symptômes de la colite. NOTE : L’indice de la maladie est obtenu en combinant les observations des diarrhées et des saignements rectaux et sont définis comme suit : 0 (selles normales, pas de sang), 1 (selles molles, pas de sang), 2 (selles molles, peu de sang), 3 (selles très molles, saignement modeste) et 4 (selles liquides, saignements importants)12. L’indice de la maladie est analysée chaque jour pour chaque souris.</li>
	<li>La fin du traitement de 7 jours DSS, sacrifier les souris par dislocation cervicale et aller de l’avant avec les autres expériences.</li>
</ol>3. préparation des échantillons de tissu
<ol><li>Placez votre souris en décubitus dorsal et nettoyer la peau de l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Faire une incision de 3 cm de long médiane de l’abdomen avec une paire de petits ciseaux pour exposer la cavité abdominale.</li>
	<li>Utilisez une paire de pinces pour séparer la rate des autres tissus, puis retirez délicatement la rate et mesurer sa taille.</li>
	<li>Identifier et lever le côlon avec une pince et séparer le mésentère environnant. Retirer le côlon entier jusqu'à ce que le caecum et le rectum sont visibles.</li>
	<li>Isoler le côlon en sectionnant il à la marge de colonocecal et profondément dans le bassin pour libérer le côlon proximal et distal, respectivement. Ensuite, mesurer et enregistrer la longueur du côlon isolé. Veillez à ne pas endommager les tissus du côlon au cours de la procédure de dissection.</li>
	<li>Rincer le côlon avec 10 mL de glacee solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une seringue de 10 mL équipée d’une aiguille de gavage pour enlever les excréments et le sang, jusqu'à ce que l’éluat soit complètement claire.</li>
	<li>Pour l’identification histologique, divisent également les échantillons de tissus en trois parties : proximale, moyen et distal. Puis, fixer le tissu avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Pour l’analyse de l’expression de cytokines, geler tout le côlon rapidement avec de l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>4. histologique évaluation de la gravité de la colite induite par le DSS
<ol><li>L’hématoxyline et éosine (H & E) coloration<ol>
<li>Après fixation, plonger le tissu dans une solution de sucrose à 30 % dans du PBS 1 x du jour au lendemain dans un tube de 15 mL à cryoprotect les échantillons.</li>
		<li>Incorporer le tissu dans la température de coupe optimale (OCT) composée et placez-le à-20 ° C jusqu'à ce que l’outil OPO durcisse.</li>
		<li>Transférer le bloc OCT contenant le tissu à un cryostat, régler la molette de l’épaisseur dans le cryostat à 12 µm et tranche et recueillir 12 coupes congelées µm d’épaisseur.</li>
		<li>Faire chauffer les sections de tissus prélevés depuis un cryostat à 65 ° C pendant 20 min sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Laver les sections brièvement dans l’eau distillée. Leur coloration à l’hématoxyline coloration solution pendant 5 min et ensuite rincer à l’eau courante pendant 5 min.</li>
		<li>Différencier les sections avec 0,5 % d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 30 s et les rincer en course tap eau pendant 1 minute. Ensuite, effectuer le lavage dans du PBS 1 x pendant 1 min et ensuite rincer à l’eau courante pendant 5 min.</li>
		<li>Effectuer lavage des sections tissulaires en alcool 70 %, 75 %, 80 % et 95 %, chacun pour 10 s. contre-colorant dans éosine coloration solution pendant 2 min.</li>
		<li>Déshydratation par 95 % d’alcool et 2 changements d’alcool absolu s’exécuter pendant 5 min chaque fois. Clairement dans les 2 changements de xylène pendant 5 min.</li>
		<li>Marquer des lésions tissulaires du côlon proximal, moyenne et distale de chaque souris le Knock-out du gène et des classes de type sauvage issus des résultats de la ci-dessus coloration H & E. NOTE : L’indice de la maladie est une note combinée de lésions épithéliales et l’inflammation dans les régions de la muqueuse, sous-muqueuse, musculeuse et la séreuse, qui est définie comme suit : 0 (pas de lésions tissulaires et inflammation), 1 (lésions tissulaires focal et l’inflammation), 2 (en talles des lésions tissulaires et l’inflammation) et 3 (lésions tissulaires diffuses et inflammation)12,13. Trois scores par souris pour les pièces, milieu, proximales et distales du côlon sont ensuite additionnés pour obtenir une note totale pour chaque animal. Les scores moyens pour chaque groupe sont ensuite calculées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunohistochemistry14<ol>
<li>Faire chauffer les sections de tissus prélevés depuis un cryostat à 65 ° C pendant 20 min sur une plaque chauffante. Laver les sections dans 1 x PBS 3 fois, pendant 10 min chaque. Incuber les coupes de tissus en peroxyde d’hydrogène 3 % pendant 10 min éliminer la peroxydase endogène. Laver les sections 3 fois plus. Bloquer les tissus avec blocage tampon (3 % de BSA, 0,3 % de détergent non ionique, sérum de chèvre de 2 %, 0,1 % d’azide de sodium dans du PBS 1 x) à température ambiante pendant 1 h ou plus.</li>
		<li>Remplacer le tampon de blocage avec une solution contenant les anticorps primaires de suivant des cellules immunitaires spécifiques au type : CD45 pour les leucocytes, CD3 pour les lymphocytes T, B220 pour les lymphocytes B, CD11b pour les macrophages et Ly6G pour les neutrophiles. Incuber une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Retirez les anticorps primaires de coupes de tissus par aspiration. Laver les sections avec 1 x PBS 3 fois, pendant 10 min chaque. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire biotinylé suivie d’incubation avec le complexe streptavidine-HRP à température ambiante.</li>
		<li>Incuber les sections 3, 3'-diaminobenziding (DAB) solution pour développer une couleur brun-clair ou foncé et visualiser les cellules immunoréactives.</li>
		<li>Contre-coloration les sections à l’hématoxyline et 0,3 % (v/v) dilué ammoniaque. Prendre des images de champ lumineux à un grossissement de X 10 sous un microscope.</li>
		<li>Utiliser un programme de traitement d’image pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées dans l’épithélium et de la lamina propria (en dessous de l’épithélium) en définissant des 2 masques : utilisez le premier masque la couleur cube-fonction pour régler une détection de couleur seuil et mesurer les surfaces des DAB-réactif colorés ; le second masque permet de déterminer les superficies totales de l’épithélium et propria laminaire dans la section examinée. Exprimer la population de cellules immunoréactives en proportion de la zone de coloration des cellules infiltrés à la superficie totale des tissus examinés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gene Expression évaluation de colite induite par le DSS
<ol><li>Récupérer les tissus du côlon du knock-out du gène DSS imprégnées d’insecticide et les souris de type sauvage d’un congélateur à-80 ° C et ajouter 0,6 mL de tampon de lyse à 25 mg de tissu, puis homogénéiser dans un homogénéisateur.</li>
	<li>Suivre le protocole du kit RNA extraction pour extraire l’ARN total et la DNase I est utilisée pour éliminer toute contamination de l’ADN génomique.</li>
	<li>Exécuter un gel d’agarose pour vérifier la qualité de l’ARN extrait. Si sa bande de RNA 28 s est plus brillant que celui de la bande de 18 ans, il est utilisable. Prendre 1 µL de l’échantillon de RNA pour déterminer la concentration d’ARN sur un microspectrophotomètre.</li>
	<li>Mélanger 1 µg d’ARN total avec 2,5 µL de 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 amorces et 1 µL de la leucémie murine Moloney virus (MMLV) de la transcriptase inverse. Incuber à 42 ° C pendant 60 min préparer l’ADNc.</li>
	<li>Mettre en place des réactions de PCR en temps réel en mélangeant 1 µl du cDNA avec 0,5 µL d’amorces de qPCR et inverses pour TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 et β-actine sous forme de contrôle en plus 2 x colorant vert fluorescent.</li>
	<li>Exécutez le qPCR avec les paramètres suivants : 95 ° C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 50 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 20 s.</li>
	<li>Calculer la quantification relative de l’expression génique en utilisant la méthode deΔΔCt 2–15. D’analyser comparativement les niveaux d’expression de gène dans l' élimination directe vs. souris de type sauvage.</li>
</ol>

<ol><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li>
<li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li>
<li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li>
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<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+%CE%B1-gustducin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system%3A+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).</li>
<li>Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+Effects+in+CD4%2B-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis%3A+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement déterminer l’effet de mutations des gènes gustatives spécifiques sur l’inflammation dans un modèle murin d’EIA induite par le DSS. Pour tirer pleinement parti, induction optimale des MICI est une étape clé. Le développement de la colite est affecté par plusieurs facteurs, dont la souche de souris, habitat, la microflore intestinale, ainsi que les gènes d’intérêt. Il est recommandé d’effectuer une expérience pilote avec un petit nombre de souris pour tester différents...

Les deux principales formes de la maladie intestinale inflammatoire (MII), maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) sont caractérisés par rémittentes ou progressives inflammatoires chroniques de l’intestin avec étiologie multifactorielle1,2 . Le développement des MICI dépend de la génétiques ainsi que certains facteurs environnementaux comme l’alimentation, l’utilisation des antibiotiques et surtout, les infections pathogènes. Toutefois, l’étiologie et la réglementation mécanismes moléculaires de l’IBD sont encore peu claires. Par conséquent, nombreux modèles animaux induites chimiquement de DCI ont été construits et appliquées pour délimiter la pathogenèse et les mécanismes de régulation et d’évaluer l’efficacité de la thérapeutique humaine3.
Récepteurs gustatifs sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sont classées dans deux grands types : type I (T1Rs), et type II (T2Rs) qui détectent les composés amers, sucrée et umami. Cascades de signalisation de goût sont initiées par tastant T1Rs ou T2Rs, activant la heterotrimeric G protéines liantes consistant α-gustducin et un dimère Gβγ et conduisant à la libération des sous-unités Gβγ. La portion Gβγ stimule à son tour l’effecteur enzyme phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activés puis hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate en deux messagers secondaires intracellulaires [l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et le diacylglycérol] et IP3 se lie à et ouvrir son canal-récepteur IP3 R3, libérant des ions de calcium du réticulum endoplasmique. Cela conduit finalement à l’ouverture du canal ionique potentiel de récepteur transitoire Trpm5 et la libération de l’ATP de neurotransmetteur sur les nerfs gustatifs4,5,6,7. Pourtant, les voies de signalisation de goût aigre et salé sont différentes et indépendantes du sucré, umami et amertume8. En outre, les composants du goût RCPG et aval protéines existent dans divers tissus extra-orale. Des études récentes ont indiqué que α-gustducin, la principale composante de la signalisation de goût, se trouve à s’exprimer dans la muqueuse intestinale. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les fonctions de ces goût signalisation composants en tissus extra-orale9,10.
La méthode décrite ici est utilisée pour caractériser les fonctions des protéines signalisation gustatives exprimées dans les tissus extra-orale. Nous combinons une lignée de souris transgéniques développée pour délimiter des cascades de signalisation dans les papilles avec le modèle de colite induite chimiquement. En grande partie en raison de sa simplicité procédurale et similitudes pathologiques à la colite ulcéreuse humaine, le dextran sulfate de sodium (DSS)-induite DCI modèle a été utilisé plus largement parmi les divers colite induite chimiquement modèles11. Dans cette étude, nous avons utilisé des α-gustducin-deficient mice comme une lignée de souris représentant pour révéler les nouvelles fonctions des α-gustducin en immunité mucosale intestinale et l’inflammation en 1) analysant les changements morphologiques dans les tissus et 2) analyse les différences dans l’expression de cytokines liées à l’inflammation du côlon. Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement et qualitativement déterminer la contribution des protéines de signalisation gustatifs (et autres protéines exprimées dans le tube digestif) à des lésions tissulaires et de l’inflammation intestinale, quand les lignes pour les gènes de souris génétiquement modifiée intérêt sont disponibles. Avantages de cette méthode permettent aux utilisateurs d’obtenir des données intégrées résultant d’actions de la DSS chimique et la déficience du gène d’intérêt. Cette méthode peut encore être améliorée pour augmenter sa sensibilité et de révéler des changements subtils intestinaux au niveau cellulaire et moléculaire.

<table><tbody><tr><td><Anticorps >fort</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>BD Biosciences</td><td>550286</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550282</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BD Biosciences</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>< fort>réactif</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr>sulfate de <tr><td>dextran sel de sodium (DSS)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>complexe streptavidine-HRP</td><td>BD Pharmingen</td><td>551011</td><td></td></tr><tr><td>H& Kit de coloration</td><td>BBI Life Sciences</td><td>E607318</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Saline (PBS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548117</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td><td>Roche</td><td>4913850001</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Reverse Transcriptase, GPR</td><td>Clontech, TaKaRa</td><td>639574</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa MiniBEST Kit universel d’extraction d’ARN&nbsp ;</td><td>TaKaRa</td><td>9767</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringue 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Instruments et équipements</</td>ciseaux><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>balance forte&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>pince</tr><tr><td>centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>machine de coloration des bocaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imag-Pro Plus&nbsp ;</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

Maladies inflammatoires de l’intestin (MII) est l’un des troubles gastro-intestinaux liées, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, qui affecte la qualité de vie de millions de personnes dans le monde. Les symptômes de l’IBD comprennent des douleurs abdominales, la diarrhée et des saignements rectaux, pouvant résulter de l’interaction entre microbiote intestinal, des composants alimentaires, les cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Il est particulièrement important d’évaluer comment chaque gène clé exprimé dans les cellules épithéliales et immunitaires intestinales affecte l’inflammation du côlon. Les récepteurs de goût couplés aux protéines G, y compris G protéine sous-unité α-gustducin et autres protéines de signalisation, ont été trouvés dans les intestins. Ici, nous utilisons des α-gustducin en tant que représentant et décrire un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induite par le modèle DCI pour évaluer l’effet des mutations du gène gustatif sur immunité mucosale intestinale et l’inflammation. Cette méthode combine la technologie génique knockout avec le modèle DCI induit chimiquement et ainsi peut être appliquée pour évaluer le résultat de l’annulation par le gène gustatif, mais aussi les autres gènes qui peuvent exuberate ou humidifier la réponse immunitaire induite par le DSS dans le côlon. Des souris mutantes sont administrés avec DSS pendant une certaine période au cours de laquelle leur poids corporel, selles et saignements rectaux sont surveillés et enregistrés. À différents intervalles au cours de l’administration, certaines souris sont euthanasiés, puis les dimensions et le poids de leurs spleens et deux-points sont mesurés et les tissus de l’intestin sont collectées et traitées pour histologique et analyses d’expression génique. Les données montrent que les résultats de knockout α-gustducin en perte de poids excessive, diarrhée, hémorragies intestinales, des lésions tissulaires et inflammation vs sauvage souris. Puisque la gravité de l’inflammation induite est affectée par les souches de souris, habitat et l’alimentation, l’optimisation de la durée de concentration et de l’administration DSS dans une expérience pilote est particulièrement importante. En réglant ces facteurs, cette méthode peut être appliquée afin d’évaluer les effets anti - et pro-inflammatoires.

Une procédure IBD induite par le DSS a été créée par administrer 3 % DSS dans l’eau potable à le α-gustducin-knockout (KO) et les souris de type sauvage (WT). Par rapport aux souris WT, les souris génétiquement déficientes exposé plus des colites avec perte de poids excessive, diarrhée et des saignements intestinaux (Figure 1). Après une administration de DSS de 7 jours, les différences dans l’intégrité des tissus ont été analysés en utilisant la coloration H...

Nous présentons ici un protocole pour étudier l’effet de l’invalidation des gènes reliés à la gustation sur les réponses immunitaires dans un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induit le modèle de souris de maladie inflammatoire de l’intestin.

Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine inflammatoire de la biodisease au sujet de la colite ulcéreuse et de la maladie de Crohn. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour évaluer les premiers effets anti et proinfammatoires des protéines de signalisation. L’implication de cette technique prolonge l’étude du gaz dans de nouvelles avancées et l’inflammation.Bien que cette méthode peut fournir un aperçu de l’effet génétique sur l’inflammation intestinale. Il peut également être appliqué à d’autres facteurs tels que les régimes alimentaires et le microbiome. En général, les personnes nouvelles à ce semestre auront du mal parce que le traitement des tissus cicatriciels de la maladie est délicat.La démonstration visuelle de cette méthode est critique car la dissection et les étapes de préparation de tissu sont difficiles à apprendre parce que mystalia et les structures de tissu cellulaire peuvent être modifiées. Pour induire le sodium de sulfate de dextran, ou colite de DDS, remplacez l’eau potable régulière par la solution de 3%DSS, ajoutez le libidium pendant sept jours. Mesurer le poids corporel de chaque souris, la co

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Des modèles expérimentaux de maladies inflammatoires de l'intestin nous ont permis d'examiner le complexe innée et adaptative des réponses immunitaires associées à la pathogenèse. Utiliser score histologique, la quantification des cytokines pro-inflammatoires et de l'activité myéloperoxydase, on peut commencer à évaluer ces réponses observée dans la maladie intestinale inflammatoire.

Enquêter inflammation intestinale induite par DSS modèle des MICI

Cette vidéo présente une technique permettant de générer un modèle murin de colite induit par des produits chimiques, une maladie inflammatoire de l’intestin. La souris est autorisée à consommer une solution de sulfate de sodium de dextran (DSS) pendant une durée adéquate. Lors de la consommation, le DSS endommage la barrière de mucus et de la couche épithéliale dans le côlon, permettant aux microbes intestinaux de pénétrer dans les tissus sous-jacents - où ils sont détectés par les cellules...

Technique pour générer un modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sodique

Cette vidéo démontre l’évaluation de la colite induite par des produits chimiques par coloration immunohistochimique du tissu du côlon de souris. Dans une coupe de tissu coloré, la présence d’un grand nombre de cellules immunitaires dans le tissu endommagé représente l’infiltration de cellules immunitaires pendant la colite.

Évaluation de la colite induite par des produits chimiques par l’analyse immunohistochimique de coupes de tissu du côlon

DNBS / TNBS colite induite propose une méthode alternative et peu coûteuse pour étudier la pathobiologie de la maladie inflammatoire de l'intestin. Le protocole décrit dans ce document décrit l'application réussie de DNBS pour induire la colite chez les souris et les rats et permet d'étudier en profondeur les réponses intestinales médiés par l'hôte.

Modèles DNBS / TNBS colite: Fournir connaissances sur les maladies inflammatoires de l&#39;intestin et des effets de graisses alimentaires

Ici, nous présentons un protocole pour induire une inflammation colique chez la souris par transfert adoptif de lymphocytes Tsyngéniques à haute teneur en CD4+CD45RB dans des receveurs déficients en lymphocytes T et B. Les caractéristiques cliniques et histopathologiques imitent les maladies inflammatoires de l’intestin humain. Cette méthode permet d’étudier l’initiation de l’inflammation colique et la progression de la maladie.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

Ici, nous fournissons une description détaillée de la procédure pour induire des biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris et suivre la fermeture de blessure en temps réel. En outre, des méthodes pour la préparation des tissus pour des analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires du lit de blessure sont fournies.

Effectuer des biopsies de pincement guidées par colonoscopique chez la souris et évaluer les changements ultérieurs des tissus

La notation systématique de l’inflammation intestinale utilisant un système informatique-aidé libre est un outil puissant pour comparer quantitativement des changements histopathologiques dans des modèles de colite caractérisés par la présence des ulcères et des changements inflammatoires. L’évaluation histologique de score de colite renforce des observations cliniques et facilite l’interprétation de données.

Analyse systématique de notation pour l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite par le sulfate de sodium murine dextran

Dans ce protocole, un modèle de colite adoptive de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. Les lymphocytes T CD4+ sont isolés à partir de souris transgéniques TCR CBir1. Ceux-ci sont spécifiques pour un antigène immunodominant du microbiote intestinal CBir1 flagellin, qui est transféré dans les souris Rag1-/- receveuses, entraînant une inflammation intestinale.

Induction de l’inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR à des souris immunodéficientes

L’interaction de la susceptibilité génétique, de l’immunité muqueuse et de l’environnement microécologique intestinal est impliquée dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Dans cette étude, nous avons appliqué la transplantation de microbiote fécal à des souris déficientes en IL-10 et étudié son impact sur l’inflammation colique et la fonction cardiaque.

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

Ce protocole décrit la méthode d’établissement d’un modèle de pochite chez le rat. Le modèle de la poche iléale a été créé en effectuant une chirurgie de la poche iléale-anastomose anale (IPAA) à l’aide de techniques microchirurgicales. Après l’opération, le rat a été traité avec du sulfate de dextran sodique (DSS) à 4 % pendant 4 jours.

Modèle de pochite chez le rat après proctocolectomie et anastomose iléale-anale à l’aide de sulfate de dextran sodique

Découvrez l'évaluation des effets pro et anti-inflammatoires des protéines de signalisation dans un modèle de souris IBD induit par DSS. Cette méthode permet d'étudier l'influence génétique sur l'inflammation intestinale.

Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin (Vidéo) | JoVE Journal

Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin

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