Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches pluripotentes humaines sur la fonctionnalité et les réponses inflammatoires des cellules endothéliales pluripotentes induites par l’homme. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une description détaillée de la configuration expérimentale et de l’analyse des données pour l’évaluation de l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales pluripotentes induites par l’homme. Pour le revêtement microfluidique des copeaux, placez une puce stérile dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres et utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour injecter 10 microlitres de solution de travail de fibronectine fraîchement préparée dans chaque canal de la biopuce.

Couvrir la boîte de Pétri et la placer dans une chambre humidifiée pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, préchauffer la biopuce dans un incubateur de 37 degrés Celsius et suspendre à nouveau les cellules endothéliales pluripotentes induites par l’homme dérivées de cellules souches récoltées à partir d’une culture cellulaire 80 à 100 % confluente à la concentration désirée dans un milieu frais sans sérum cellulaire endothélial. Ensuite, aspirez la solution de fibronectine de tous les canaux de la puce microfluidique, et bien mélanger les cellules pour obtenir une suspension cellulaire homogène avant d’utiliser une pointe pipette de 10 microlitres pour injecter six microlitres de cellules dans chaque canal.

Examinez la biopuce au microscope pour confirmer que les cellules sont uniformément réparties avec une densité cellulaire élevée. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter 40 microlitres de cellules endothéliales sans sérum moyen PLEIN dans les réservoirs moyens des deux côtés de chaque canal. Et retournez la biopuce à l’incubateur pendant une heure.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de milieu sans sérum de cellules endothéliales FULL dans les réservoirs des deux côtés de chaque canal. Pour l’imagerie en direct des cellules ensemencées, confirmez que les configurations microfluidiques sont prêtes, que la chambre d’imagerie vivante est équilibrée à 37 degrés Celsius et que le niveau de CO2 a atteint 5 %, placez la puce biologique dans le porte-puces du microscope et montez le porte-puces au stade d’imagerie au microscope. Pour connecter la biopuce à la pompe via le collecteur, placez l’adaptateur à huit broches près des réservoirs de sortie de la puce et approfondissez toutes les broches dans le milieu sans connecter complètement les broches.

Dans le logiciel de pompe microfluidique, sélectionnez Washout/Connect to chip et cliquez sur Run Assay Step pour distribuer 30 microlitres de support RPMI à travers chaque broche. Insérez ensuite l’adaptateur à huit broches dans la sortie de la biopuce. Utilisez une pipette pour aspirer manuellement le milieu de tous les réservoirs d’entrée de la biopuce, et sélectionnez Washout/Chip Washout et Run Assay Step pour parcourir un canal à la fois avec 40 microlitres de milieu sans sérum cellulaire endothélial plein pour éliminer les cellules mortes et les débris.

Lorsque tous les canaux ont été lavés remplacer le milieu du réservoir d’entrée du canal d’intérêt par 100 microlitres de leucocytes humains dilués à un 2,5 fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre dans le milieu RPMI. Cliquez sur La description de l’analyse cellulaire/étape et définissez la description actuelle du canal/étape et définissez le canal d’intérêt vers On et les sept autres canaux vers Off. Sélectionnez la description de l’étape d’analyse cellulaire et cliquez sur Exécuter l’étape d’analyse.

Remplacer les leucocytes restants dans le réservoir d’entrée par 100 microlitres de milieu RPMI complet. Et cliquez sur La description de l’étape d’analyse cellulaire et exécutez l’étape d’analyse pour parcourir le canal pendant cinq minutes avec le milieu rpmi pour enlever tous les leucocytes nonherent. Puis acquérir des images d’au moins trois à quatre positions différentes dans le canal pour visualiser les leucocytes adhérents.

Pour quantifier les leucocytes adhérents, ouvrez le logiciel de traitement d’image CellProfiler et importez le fichier Count Leukocytes Pipeline. Sous les modules d’entrée sélectionnez Images et faites glisser-déposer le dossier avec les images brutes des leucocytes adhérents à la fenêtre liste de fichiers. Sous les modules d’analyse sélectionnez Identifier les objets primaires et indiquer les diamètres minimaux et maximaux des leucocytes adhérents en pixels.

Sous les modules d’analyse sélectionnez FilterObjects. Sélectionnez ensuite les critères de filtrage et entrez la zone minimalement acceptée des objets en pixels et cliquez sur Analyser les images pour commencer l’analyse. La dissociation optimale des cellules endothéliales pluripotentes induites par l’homme devrait entraîner une suspension à cellule unique exempte de touffes cellulaires.

En règle générale, 15 minutes après l’injection, les cellules endothéliales se fixent au fond du canal et commencent à se propager. Dans l’heure qui suit l’injection, les cellules endothéliales devraient former un monocouche bien répandu à travers le canal, à partir duquel elles sont prêtes à être utilisées dans l’analyse Flow. L’utilisation du logiciel de traitement d’image open source gratuit tel que démontré permet le filtrage des objets identifiés en fonction d’une zone minimale, et l’exclusion d’objets faussement identifiés tels que les débris cellulaires, l’autofluorescence ou tout autre signal fluorescent non spécifique.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser la stimulation avec des cytokines pro-inflammatoires et d’inclure les cellules endothéliales ombilicales humaines primaires comme contrôle positif. N’oubliez pas que le travail avec les lignées cellulaires et cellulaires des mammifères primaires peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un manteau de laboratoire, de gants et d’une protection oculaire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.