Name: Nouveau procédé d’impression 3D Decellularise Matrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez une technique d'impression 3D combinant polycaprolactone et matrices décellularisées pour créer des échafaudages tissulaires mécaniquement solides. Cette méthode améliore les conditions de culture cellulaire en reproduisant fidèlement l'environnement tissulaire natif.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce projet a été financé en partie par une subvention de la société orthopédique pédiatrique de l’Amérique du Nord (POSNA) et le National Institutes of Health accorde NIBIB R21EB025378-01 (subvention de recherche exploratoire bioingénierie).

1. obtention et microsphères de prétraitement
<ol><li>Produire des microsphères avec la matrice souhaitée encapsulé (PLA-DM)2. Remarque : Il est impératif que les microsphères sont de taille uniforme. Pour cette raison, il est essentiel de tamisage des microsphères avant toute utilisation. Bien que l’encapsulation et décellularisation matrice ont été détaillés dans les précédentes publications2, fait suite à un bref résumé du processus.<ol>
<li>Tout d’abord, récolter des bouchons de cartilage de porc des membres postérieurs. Decellularize le cartilage dans une série de lavages avec acide 0.05 % trypsine/0,5 mm tetrasodium EDTA (EDTA), Dulbecco modifiée de l’aigle l’acide peracétique moyen (DMEM) et 1,5 % et 2,0 % Triton X-100 pendant 4 heures chacun avec eau distillée lavages avant et après chaque étape2.</li>
		<li>Égoutter la matrice decellularise, congeler, lyophiliser, moudre et se dissoudre dans la solution de pepsine. Après dissolution, mélanger la solution de pepsine avec PLA, qui a été dissoute dans du dichlorométhane.</li>
		<li>Ajouter quelques gouttes du mélange dans un polyalcool de 3 % en solution aqueuse. Centrifuger les microsphères qui en résulte, la rincer, la vidange et lyophiliser à nouveau. Remarque : Pour plus de détails sur le processus voir le publiées antérieurement protocole n°2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tamisez les microsphères.<ol>
<li>S’assurer que toutes les plaques de tamis ont été nettoyés à fond et sont secs avant utilisation. Si nécessaire, nettoyer tamis par ultrasons nettoyeur à assurer que toutes les sphères sont écartés de la passoire.</li>
		<li>Assembler le shaker passoire avec le plateau de tamis 106 µm en haut, le plateau de µm 53 après que cela et le tamis pan en bas.</li>
		<li>Placez les microsphères secs dans le bac de tamis plus haut et placez le couvercle sur le plateau supérieur. Vous allumez un tamisage grossier pour 8 à 10 min. Repeat sur amende pour 8 à 10 min. NOTE : Les temps de tamis devrez peut-être être augmenté ou diminué selon le lot.</li>
		<li>Soigneusement, enlever les plaques de tamis un et placez-les à l’envers sur un papier de grand poids. Appuyez sur les côtés doucement pour faire en sorte que la plupart des sphères est tombés sur le tamis et sur le papier.</li>
		<li>Jetez les sphères surdimensionnés (> 106 µm) et sphères sous-dimensionné (< 53 µm). Ajouter les sphères qui sont dans la gamme de taille de 53 à 106 µm dans un tube à centrifuger étiquetées avec le type et numéro de lot, puis placer dans un congélateur à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. microsphères contrôle de la qualité des évaluations
Remarque : Voir la Figure 1.
<ol><li>Effectuer analyse macroscopique/visuel pour vérifier que les microsphères sont harmonisés et sphérique, avec aucun agrégat présent.</li>
	<li>Évaluer les microsphères en utilisant une micrographie électronique à balayage (SEM).<ol>
<li>Pour ce faire, des microsphères de lieu sur un SEM chuck et bredouiller manteau avec or-palladium dans une atmosphère d’argon à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique pour une épaisseur de 4 nm.</li>
		<li>Observer les caractéristiques de la surface, la morphologie et diamètres des microsphères en utilisant un 10 kV, accélération de la tension et une distance de travail de 10 mm pour s’assurer que la production et le tamisage des microsphères a réussi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. filament création pour l’impression 3D
<ol><li>Mesurer et noter la masse des microsphères obtenues aux étapes 2 et 3 ; Il faut au moins 25 g.</li>
	<li>Ajouter la poudre de polycaprolactone (PCL) pour les microsphères pour un rapport de 1:4 poids de microsphères à PCL.</li>
	<li>Mélanger le mélange de poudre dans un mélangeur roulement miniature à 20 tr/min pendant 5 min puis retourner le récipient et mélanger à 20 tr/min pour un 5 min supplémentaire (voir Figure 2).</li>
	<li>Beaucoup des extrudeuses disponibles dans le commerce (voir la Table des matières) ont vestes isolantes étant leur température de travail prévue pour les filaments de modeling (FDM) de dépôts fondue traditionnelle. L’extrudeuse de modifier (si nécessaire) en supprimant l’isolant et l’utiliser en combinaison avec des ventilateurs de bureau (qui soufflent de l’air ambiant sur l’extrudeuse et filament extrudé) d’utiliser de l’extrudeuse à basse température. NOTE : Ventilateurs de bureau qui soufflent de l’air ambiant pour refroidir l’extrudeuse et filament sont utiles pour cette procédure.</li>
	<li>Programme d’installation l’installation de l’équipement pour l’extrusion. Voir la Figure 3.<ol>
<li>Configurer l’extrudeuse pour que sa sortie soit ~ 60 cm de l’entrée et le spouleur, avec une voie directe de la prise d’extrusion à l’entrée du spouleur. Remarque : Le spouleur peut éventuellement être déclenché 3-4 pouces sur le banc s’il est constaté que le filament est tombante jusqu’au point de toucher la paillasse.</li>
		<li>Placer un ventilateur de bureau ~ 15 cm de la gaine de chauffage et de l’orienter vers la gaine de chauffage offre de refroidissement à l’air ambiant dans l’ensemble de la production de filament. Placez un deuxième ventilateur de refroidissement environ à mi-chemin entre l’extrudeuse et spouleur et dirigez-la vers l’extrudat pour aider au refroidissement du filament avec l’air ambiant.</li>
		<li>Ajuster le positionnement selon les besoins tout au long du processus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Définir l’extrudeuse mis à jour le chauffe à 52 ° C, se tourner vers le bureau de ventilateurs de refroidissement et laissez l’instrument à venir à l’équilibre pour 20 à 30 min. veiller à ce que la buse adéquate est attachée à l’extrudeuse.</li>
	<li>Juste avant de commencer, remplir la trémie de l’extrudeuse avec le mélange de microsphères/PCL à l’étape 3.3. Allumez le spouleur et la vis d’extrudeuse pour initier l’extrusion du filament.</li>
	<li>Lorsque le filament initial est extrudé, tirez l’extrudat de la prise de l’extrusion avec une pince et le nourrir et le spouleur de filament manuellement.</li>
	<li>Le filament désiré prendra du temps à sortir le spouleur. À l’aide de bobines séparées ou ruban, marquer clairement quand la composition de filament visuellement semble uniforme.</li>
	<li>Suivre de près le processus et de modifier les paramètres si nécessaire. Ajuster la température de l’extrudeuse, extrusion auger vitesse et vitesse de spouleur pour obtenir un filament de diamètre de 1,75 mm mesurée par des étriers à. Ajustez les fans comme nécessaire pour refroidir le filament correctement pour éviter les coupes non circulaire à incandescence. Mélanger et remplir la trémie si nécessaire. Remarque : Une attention particulière est nécessaire au cours de ce processus pour obtenir le filament adéquat pour ultérieure impression 3D. Les paramètres ci-dessus vont changer en fonction des conditions ambiantes, le niveau de remplissage et l’homogénéité du mélange dans la trémie et la dynamique de thermodynamique et d’écoulement des lots spécifiques de PCL et microsphères.</li>
	<li>Continuer jusqu'à ce que toute la poudre a été utilisée et la trémie est presque vide d’extrusion. Ajouter la poudre PCL (sans les microsphères) dans la trémie pour rincer le mélange de microsphères qui est actuellement dans l’extrudeuse. Continuez à ajouter la poudre PCL à la trémie jusqu'à ce qu’aucuns plus de microsphères ne sont visibles dans l’extrudat.</li>
	<li>N’oubliez pas d’étiqueter et distincte le filament qui contient des microsphères dans la concentration désirée, comme lorsque le filament est refroidi, il est plus difficile de distinguer le filament uniform des filaments non uniforme.</li>
	<li>Continuer jusqu'à ce qu’il n’y a poudre minime à gauche dans la trémie d’extrusion, puis éteignez le spouleur, extrudeuse auger, élément chauffant extrudeuse et les fans.</li>
</ol>4. impression avec le Filament
<ol><li>Concevoir une géométrie de la forme désirée et la forme à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur. Puis couper le modèle et dicter la trajectoire d’outil à l’aide de tranchage de logiciel qui est compatible avec la machine d’impression 3D utilisée.</li>
	<li>Charger le filament de l’étape 3 sur n’importe quelle imprimante standard de FDM, équipé de buses standard du diamètre désiré (en général 0. 4 mm). Commencer l’impression (généralement à 65-70 ° C et 300 mm/min vitesse linéaire) que le filament personnalisé est couche par couche déposée par la machine.</li>
	<li>Veillez à accorder une attention particulière à la première couche et ajuster les paramètres nécessaires pour obtenir une bonne qualité impression. Remarque : Modifications peuvent être apportées à la vitesse d’impression, impression température, température de plate-forme, multiplicateur d’extrusion et d’autres paramètres. Se référer à l’imprimante et guide de dépannage du tranchage fabricant pour obtenir de l’aide.</li>
</ol>5. contrôle de la qualité évaluation
<ol><li>Placez les constructions imprimées sur des mandrins de SEM et bredouiller manteau avec or-palladium dans une atmosphère d’argon à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique pour une épaisseur de 4 nm.</li>
	<li>Observer au microscope à l’aide d’un 10 kV, accélération de la tension et une distance de travail de 10 mm pour vérifier les caractéristiques de la surface et la présence ou l’absence de microsphères le cas échéant.</li>
</ol>6. test fonctionnel des constructions de l’imprimé
Remarque : La phosphatase alcaline (ALP) peut servir comme un substitut pour la matrice decellularise pour déterminer si les protéines encapsulées sont biologiquement actifs après le processus de production de filament. ALP est utilisé parce qu’il catalyse une réaction d’un substrat, p-nitrophényl phosphate, de changer d’incolore à jaunes sous-produits, p-nitrophénol et phosphate inorganique, mais seulement si l’ALP est dans la conformation fonctionnelle.
<ol><li>Imprimer une géométrie (n = 3) qui a une masse de fin d’au moins 400 mg avec le filament de microsphères ALP (PLA-ALP/PCL) à l’aide de paramètres d’impression identiques comme les échafaudages de PLA-DM/PCL. Aussi d’impression PCL-seule (PCL(-)) échafaudages de la même géométrie que les échafaudages de PLA-ALP/PCL. Les plonger dans un tampon Tris-HCl 1 mL et incuber pendant 24 h à 37 ° C et 110 tr/min rotation pour permettre la diffusion de l’enzyme.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 1 mg/mL p-nitrophényl phosphate, disodique hexahydrate dans Tris-HCl. incuber à 37 ° C, 110 tr/min pour une supplémentaire 10 h. lire l’absorbance surnageante à 415 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Decellularise les deux matrices et 3D impression PCL échafaudages indépendamment auraient dû être divulgués afin de permettre l’adhésion et la prolifération des cellules, valider leur utilisation pour cartilagineuses réparer10,11,12. L’utilisation de la matrice decellularise de génie d’approches à la réparation des tissus a été un sujet de grand intérêt et le succès dans le passé récent,2,<sup ...

Cours techniques d’ingénierie tissulaire pour applications cliniques telles que des os, du cartilage, tendons et ligament reconstruction utilisent auto - et allogreffes à réparer le tissu endommagé. Chacune de ces techniques est effectuée systématiquement comme un « gold standard » dans la pratique clinique par récolte tout d’abord le tissu du donneur par le patient ou un match cadavérique et puis en plaçant le tissu du donneur dans le défaut site2. Toutefois, ces stratégies sont limitées par la morbidité site donneur, rareté de site donneur pour les gros défauts, risque d’infection et la difficulté à trouver des greffes qui correspondent à la géométrie souhaitée. En outre, des études ont montré qu’allogreffes utilisés pour la reconstruction ont réduit les propriétés mécaniques et biologiques par rapport aux tissus natifs3. Avec ces considérations à l’esprit, ingénieurs de tissus ont récemment tourné à trois dimensions bioprinting (3D) pour produire des géométries personnalisées et complexes qui sont biologiquement actives et conçu pour défaut de taille et la forme tout en offrant suffisamment propriétés mécaniques jusqu'à ce que le remodelage biologique est complet.
Idéalement, un échafaudage imprimés 3D consisterait en une épine dorsale polymère qui peut retenir la nécessaire stabilité mécanique du tissu native, tandis que le produits biologiques constitué offrent des indices biochimiques qui entoure les cellules, menant à leur migration, prolifération, différenciation et tissus production2,5. Malheureusement, la plupart des constructions qui contiennent des composants biologiques sont faites avec des gels ou des polymères qui sont trop faibles pour résister aux forces d’en vivo vécues par les tissus ciblés pour la reconstruction automatique/allogreffe. Autres polymères tels que l’acide polylactique (PLA) sont biorésorbable, 3D imprimable et structure solide, mais sont imprimés à des températures égales ou supérieures à 210 ° C - il est impossible pour les produits biologiques être co imprimé pendant la fabrication. Polycaprolactone (PCL) est un autre polymère biorésorbable FDA affranchis, qui peut être imprimé à une température plus basse (65 ° C), qui est devenu de plus en plus populaire dans la fabrication d’implants spécifiques à un patient avec des morphologies complexes5,6 en 3D ,7,8,9. Cependant, la plupart des bioprinters à l’aide de la technologie pneumatique rendent impossible d’impression PCL à des températures inférieures, où les activités biologiques peuvent rester sain et saufs. A ce jour, l’intégration de ces polymères avec auto/allogreffes dans un nouveau biomatériau imprimable doit encore être accompli. En l’absence d’un tel matériau, une approche de vrai tissu conçu pour la reconstruction des tissus est peu probable. Par conséquent, nous avons cherché à combiner PLA, PCL et decellularise matrices allogreffe (DM) d’utiliser les avantages de chaque matière pour fabriquer une construction viable capable de reconstruire les tissus complexes. Ce processus permettrait à la résistance mécanique initiale nécessaire pour résister aux forces de in vivo et la stabilité thermique pour accueillir la fabrication additive à une construction qui induit la formation du tissu désiré.
Dans une récente tentative d’aborder les obstacles susmentionnés, nous avons montré qu’il est possible d’encapsuler la matrice extracellulaire du cartilage decellularise dans un écran PLA thermiquement protecteur qui peut être expulsé dans les filaments de PCL, conservant la capacité de DM pour influencer les cellules environnantes du hôte2. Cela a inspiré nous cherchions des approches efficaces sur le plan clinique pour la reconstruction des tissus. Dans la présente étude, nous utilisons la technologie de la plate-forme pour construire les échafaudages tout-en-un qui incluent PLA, DM et PCL (PLA-DM/PCL).
Notre objectif est d’améliorer l’efficacité et l’utilité des allogreffes utilisant la technique de la biofabrication roman proposé de récapituler avec plus de précision le tissu natif, pour finalement utiliser dans diverses applications.

<table><tbody><tr><td>Tamiseur</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Pure</td><td></td></tr><tr><td>Sieve 90 um</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>170328156 n° 170</td></tr><tr><td>Tamis 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>162513588 n° 270</td></tr><tr><td>Tamis 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>n° 140</td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Hitachi, États-Unis</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td></td><td>Filabot.com FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6" Fan</td><td>Comfort Zone, Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau à ultrasons</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Table de mixage</td><td>sur mesure</td><td>n/a</td><td>Matériel similaire : https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Micro Balance</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D n</td><td>/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td></td><td>SolidWorks n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microspheres</td><td>Produit en interne, voir simultanément Phosphate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de p-nitrophényle, sel disodique, hexahydraté</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>Absorbance Reader</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur chauffant</td><td>Nouveau Brunswick Scientific</td><td>Excella E24</td><td></td></tr></tbody></table>

nouveau procédé d’impression 3d decellularise matrices

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Bioprinting 3D vise à créer des échafaudages personnalisés qui sont biologiquement actives et adaptées à la taille désirée et la géométrie. Une dorsale thermoplastique peut fournir une stabilité mécanique semblable au tissu natif tandis que les agents biologiques offrent compositions repères à des cellules progénitrices, menant à leur migration, la prolifération et la différenciation pour reconstituer les tissus originales / organes de1,2. Malheureusement, nombreux compatible d’impression 3D, polymères biorésorbables (tels que l’acide polylactique PLA) sont imprimées à une température de 210 ° C ou supérieur - températures qui nuisent aux produits biologiques. En revanche, polycaprolactone (PCL), un autre type de polyester, est un biorésorbable, 3D matériel imprimable qui a une température plus douce impression de 65 ° C. Par conséquent, il a émis l’hypothèse que matrice extracellulaire decellularise (DM) contenue dans une barrière thermique protectrice de PLA a pu être imprimé dans les filaments PCL et rester dans sa conformation fonctionnelle. Dans cet ouvrage, cartilagineuses réparation était l’application pour laquelle l’hypothèse a été vérifiée. Par conséquent, cartilages porcins a été decellularise et encapsulé dans des microsphères de (PLA) acides polylactique, qui étaient ensuite extrudés avec polycaprolactone (PCL) en filament pour produire des constructions 3D via fusionnés avec modélisation dépôts. Les constructions avec ou sans les microsphères (PLA-DM/PCL et PCL(-), respectivement) ont été évalués pour les différences dans les caractéristiques de la surface.

Après tamisage, microsphères devraient apparaître uniformes et être exempt de granulats. En vertu de la SEM, les microsphères tamisées peuvent avoir des petits pores sur leur surface, mais seront autrement sphériques et lisses, comme illustré à la Figure 1. Tous les filaments extrudés devraient être de diamètre uniforme et de section circulaire. Un filament qui contient des microsphères (PLA-DM/PCL) aura un peu plus mat finish tout en un PCL uniquement (filam...

Ce protocole décrit la production du filament polycaprolactone (PCL) avec des microsphères de (PLA) d’acide polylactique embarqués qui contiennent decellularise matrices (DM) pour l’impression 3D de tissus structuraux des constructions de génie.

Nouveau procédé d’impression 3D Decellularise Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Cette méthode permet la co-impression de synthétiques structurels et de composants biologiques pour les échafaudages d’ingénierie tissulaire. Ces échafaudages peuvent reproduire l’environnement tissulaire indigène avec plus de précision, ce qui peut être bénéfique pour les cellules de culture. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut imprimer mécaniquement des structures sonores sans endommager le matériau biologique encapsulé dans les échafaudages dans une technique tout-en-un pour l’ingénierie tissulaire.Produire des microsphériques avec la matrice désirée encapsulée. Ces microsphériques ont été faites avec le cartilage décellularisé des membres postérieurs porcins. Leur taille varie.Travaillez avec une machine à tamis pour obtenir des microspheres de taille uniforme. Assurez-vous que les trois plateaux de tamis ont été soigneusement nettoyés et séchés avant utilisation. Assembler le shaker du tamis avec le plateau en maille plus grand sur le dessus et le plateau en maille plus petit au milieu.Mettez le tamis sur le fond. Placez les microsphères secs dans le plateau le plus haut. Ensuite, placez le couvercle sur le plateau.Tamis grossier pendant huit à dix minutes. Puis passer au tamis fin pendant huit à dix minutes. En attendant, disposer le papier pesé pour les sphères tamisées.Lorsque le tamisage est terminé, retirez soigneusement un plateau de tamis. Placez le plateau à l’envers sur le papier de peser. Appuyez doucement sur les côtés pour vous assurer que la plupart des sphères tombent.Avec toutes les plaques de tamis vidées sur du papier de pesage, jetez les sphères surdimensionnées et sous-surdimensionnées. Les sphères restantes ont la taille correcte pour une utilisation dans les étapes suivantes. Placez ces sphères dans un tube de centrifugeuse étiqueté.Conserver le tube dans un congélateur de 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Pesez le matériau nécessaire à la réalisation du filament. Faire un rapport de poids d’un à quatre des microsphériques à la poudre de polycaprolactone avec au moins 25 grammes de microsphériques.Transférer le mélange de poudre dans un mélangeur roulant miniature. Mélanger la poudre à 20 rotations par minute pendant cinq minutes. Après cinq minutes, arrêter la rotation et retourner le récipient.Mélanger ensuite à 20 rpm pendant cinq minutes supplémentaires. Pour continuer, prenez le mélange à une configuration d’extruge et de bobine. Installez l’extrème de sorte que sa prise est d’environ 60 centimètres de l’entrée d’un bobineur.Ensuite, à l’élément de chauffage extruder, assurez-vous qu’il n’y a pas de veste isolante. Placez un ventilateur de bureau à mi-chemin entre l’extrudeuse et le bobine pour refroidir l’extrudate. Placez un autre ventilateur près de la veste chauffante pour la refroidir avec de l’air ambiant.Assurez-vous ensuite que la buse appropriée est fixée à l’extrtruder et réglez la température de l’élément chauffant. Démarrez les ventilateurs de refroidissement et laissez l’instrument atteindre un état stable. Après 20 à 30 minutes, obtenir le mélange de MICROSphère PCL et remplir la trémie de l’extrème.Allumez le bobineur et la tarière de l’extrurateur pour déclencher l’extrusion de filament. Utilisez des forceps et tirez manuellement le filament extrudé initial. Donnez le filament au bobine de filament.Comme il est extrudé, observez le filament pour identifier sa composition. Après un certain temps, la composition du filament apparaîtra uniforme, ce qui est souhaité. Enroulez du ruban adhésif autour du filament pour marquer le début de la région uniforme.Au-delà des rouleaux de bobine, surveillez le diamètre du filament. Utilisez des étriers pour vérifier si le diamètre est proche des 1,75 mm désirés. Ajustez les vitesses et les températures du bobine et de l’extruge au besoin.Pour ajuster le diamètre du filament, modifiez d’abord les vitesses du bobine et de l’extrurateur. Vous pouvez également modifier la température de l’extrextruge, bien que cela ne soit généralement pas nécessaire. Continuer à remplir la trémie et à extruder jusqu’à ce que toute la poudre soit utilisée.Lorsque la trémie est presque vide, ajouter de la poudre de PCL à la trémie pour éliminer le mélange de microsphère. Surveillez l’extrémité tout en ajoutant la poudre pcl. Dans un premier temps, les microsphériques seront encore visibles dans l’extrudate.Finalement, lorsque plus de microsphères sont visibles, arrêtez d’ajouter le PCL. Séparer et étiqueter le filament avec des microsphériques dans la concentration désirée. Lorsqu’il y a peu de poudre dans la trémie, arrêtez d’extruder et éteignez l’équipement.Le filament peut être utilisé dans une imprimante de modélisation de dépôt fusionnée standard. Chargez le filament dans l’imprimante équipée de buses du diamètre désiré. Avec le modèle chargé, réglez la température et la vitesse linéaire pour l’impression et commencez à déposer le filament.Le filament personnalisé est déposé couche par couche. Portez une attention particulière à la première couche et ajustez les paramètres au besoin. Ces deux échafaudages imprimés en 3D sont difficiles à distinguer à cette échelle.On a filament contenant de la polycapralactone, PCL seulement. L’autre a du filament PCL avec des microsphères incorporés d’acide polylactique et des matrices décelluarisées. Vu à l’aide de microscopie électronique à balayage, l’échafaudage PCL seulement semble généralement lisse.En revanche, pour les autres filaments, les microsphériques intégrées dans le PCL sont visibles dans tout l’échantillon. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les microsphère surdimensionnés ou sous-surdimensionnés peuvent avoir un impact sur la dynamique de flux du matériau dans l’extrtruder. Pour cette raison, assurez-vous de bien préparer vos microsphère avant utilisation.Afin de minimiser les déchets, il est conseillé de créer un grand lot de filament nécessaire pour toutes les expériences plutôt que de créer des lots plus petits plus fréquemment. L’expertise en production de filaments viendra au fil du temps. Les échafaudages produits à la suite de cette procédure peuvent être évalués in vitro et in vivo pour répondre à d’autres questions sur l’induction accrue et la force mécanique par rapport à d’autres échafaudages bio-imprimés.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour explorer l’induction contragénique de matrice porcine décelluarisée dans les échafaudages 3D. N’oubliez pas que travailler avec de petites particules peut présenter des risques respiratoires. Le port d’un petit masque particulaire pendant cette procédure est encouragé.

novel-process-for-3d-printing-decellularized-matrices

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La matrice extracellulaire tissu-spécifique (ECM) est un médiateur clé de la fonction cellulaire. Cet article décrit les méthodes de synthèse pures mousses dérivées ECM et microporteurs qui sont stables dans la culture sans la nécessité d' une réticulation chimique pour des applications en 3D avancées in vitro des modèles de culture cellulaire ou bioscaffolds pro-régénération.

Fabrication de Mousses et microsupports dérivés Matrice extracellulaires culture cellulaire spécifique de tissu et plates-formes de livraison

Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.

Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

Decellularise dérivés de cartilage échafaudages peuvent être utilisés comme un échafaudage pour la réparation du cartilage guide et comme un moyen de régénérer le tissu ostéochondral. Cet article décrit le processus de décellularisation en détail et offre des suggestions pour utiliser ces échafaudages en milieu in vitro.

Fabrication d’échafaudages Decellularise dérivé de Cartilage Matrix

Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.

Production des fibres de la matrice extracellulaire par Culture de cellules de Membrane fibre creuse sacrificiel

La matrice extracellulaire décellularisée (DECM) peut fournir des indices microenvironnementaux appropriés pour récapituler les fonctions inhérentes des tissus cibles dans une construction machinée. Cet article élucide les protocoles pour la décellularisation du tissu pancréatique, l'évaluation du bioink dECM pancréatique de tissu-dérivé, et la génération des constructions pancréatiques 3D de tissu utilisant une technique de bioimpression.

Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

Ce protocole met en évidence une méthode permettant d’évaluer rapidement la biocompatibilité d’une encre de biomatériau hydrogel composite de nanocellulose cristalline (CNC) / agarose avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris en termes de viabilité cellulaire et d’expression phénotypique des récepteurs de surface cellulaire, Kit (CD117) et récepteur IgE à haute affinité (FcεRI).

Fabrication d’une encre de biomatériau d’agarose incorporée de nanocellulose cristalline pour la culture de mastocytes dérivés de la moelle osseuse

Dans ce travail, un protocole de décellularisation a été optimisé pour obtenir des matrices décellularisées du muscle squelettique de souris fœtale. Les myoblastes C2C12 peuvent coloniser ces matrices, proliférer et se différencier. Ce modèle in vitro peut être utilisé pour étudier le comportement cellulaire dans le contexte de maladies musculaires squelettiques telles que les dystrophies musculaires.

Préparation de matrices décellularisées 3D à partir de muscle squelettique de souris fœtale pour culture cellulaire

Le protocole élucide deux méthodologies de décellularisation distinctes appliquées aux tissus pulmonaires bovins natifs, fournissant un compte rendu complet de leurs caractérisations respectives.

Développement et caractérisation d’hydrogels à matrice extracellulaire pulmonaire décellularisée

La matrice de rate décellularisée (DSM) a des applications prometteuses dans le domaine de l’ingénierie tissulaire hépatique. Ce protocole décrit la procédure de préparation du DSM chez le rat, qui comprend la récolte de rates de rats, leur décellularisation par perfusion et l’évaluation du DSM résultant pour confirmer ses caractéristiques.

Fabrication d’une matrice de rate décellularisée dérivée de rats

Ce protocole décrit la fabrication de constructions osseuses 3D utilisant des ostéocytes humains intégrés dans des hydrogels de gélatine méthacrylée (GelMA) complétés par une matrice extracellulaire décellularisée. La méthode est peu coûteuse, évolutive et compatible avec le matériel de laboratoire de base, offrant une plateforme translationnelle pour étudier les processus de maladies musculosquelettiques.

Une plateforme de culture osseuse 3D utilisant des ostéocytes humains et une matrice extracellulaire décellularisée pour modéliser les maladies musculosquelettiques

Découvrez une technique d'impression 3D combinant polycaprolactone et matrices décellularisées pour créer des échafaudages tissulaires mécaniquement solides. Cette méthode améliore les conditions de culture cellulaire en reproduisant fidèlement l'environnement tissulaire natif.

Nouveau procédé d’impression 3D Decellularise Matrices

Explorer plus de vidéos