In Vivo Ciblé d’Expression des protéines Optogenetic, soie/AAV Films

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences des systèmes. Comme la façon dont l’activité des ensembles neuronaux soutient le traitement sensoriel et cognitif dans le cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite le ciblage précis des protéines optogénétiques comme chan rhodopsine et GCaMP aux régions du cerveau d’intérêt, sans nécessiter une procédure d’injection de virus distincte.

La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car le dépôt de soie et de virus vers de petits implants optiques peut prendre une certaine pratique afin d’obtenir des résultats reproductibles. Tout d’abord, mélanger aav décongelé et cinq à sept points cinq pour cent fibreuse de soie aqueuse dans un rapport un à un dans un tube PCR de 200 microlitres. Pipette doucement la solution dans et hors plusieurs fois pour bien mélanger l’AAV et la fibroine.

Pour déposer la soie/AAV, chargez une pipette d’injection avec la quantité de solution requise pour le nombre d’implants de fibre étant faits, plus approximativement 30 pour cent supplémentaire pour accueillir des pertes dues à l’obstruement de pipette. Ensuite, montez un support de ferrule dans un appareil stéréotaxique équipé d’un microinjecteur. Placez le support de ferrule au-dessus du microinjecteur et appliquez le mélange soie/AAV d’en bas.

Manœuvrer la pipette d’injection jusqu’à ce qu’elle touche ou touche presque le centre de la surface de la fibre optique, et éjecter 10 à 20 nanolitres de solution de soie/AAV. Ensuite, retirez la pipette. Ensuite, observez le bolus de soie/AAV sur la surface plane qui apparaît comme un dôme liquide qui sèche à un film plat dans un délai d’environ une minute.

Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que la quantité désirée de soie/AAV soit déposée. Lors de la préparation de plusieurs implants, appliquez la solution soie/AAV sur un implant, puis passez à enduire d’autres implants, avant de revenir au premier. Après une heure de séchage, placez le support de ferrule entier dans une chambre à vide et videz-le pendant la nuit à environ 125 torr et quatre degrés Celsius.

Le lendemain, évaluez la forme et la position du film de soie résultant sous un microscope de grande puissance. Assurez-vous que les films sont confinés à l’extrémité de la surface de la fibre optique, relativement minces et symétriques. Pour enduire les fibres optiques coniques, placez la pipette d’injection de soie/AAV contre le côté de la fibre optique au début du cône, en s’assurant que la pipette touche la fibre optique.

Éjecter 20 nanolitres de soie/AAV pour démarrer le processus de revêtement, en veillant à ce que la gouttelette adhère à la fibre optique et reste à l’interface de la fibre et de la pipette. Évacuez doucement la gouttelette vers l’extrémité de la pointe de fibre pendant que la soie/AAV sèche, et maintenez la pipette d’injection en contact avec la gouttelette de séchage pour éviter d’obstruer la pointe de pipette. Lorsque le premier bolus a presque complètement séché, éjecter encore 20 nanolitres et continuer à évacue la gouttelette le long du cône.

Répétez l’étape précédente en éjectant de petites quantités de soie/AAV, et en séchant progressivement la solution sur le côté du cône. Après séchage, évaluez la forme et la position du film de soie résultant sous un microscope de grande puissance. Pour enduire les implants de lentilles GRIN, déposez de la soie/AAV en une seule injection sur un implant de lentille GRIN.

Après séchage, évaluez la forme et la position du film de soie résultant sous un microscope de haute puissance pour s’assurer que le film couvre la surface de la lentille. Pour enduire les fenêtres crâniens en verre, pipette à la main une gouttelette de cinq microlitres de soie / AAV sur la surface d’un glissement de couverture ronde de trois millimètres de sorte que la gouttelette s’étale pour couvrir toute la surface de verre. Après séchage, conserver les fibres optiques recouvertes de soie/AAV dans un dessiccateur sous vide refroidi à 125 torr et quatre degrés Celsius avant d’implanter les dispositifs.

Les images de fluorescence des protéines optogénétiques taguées fluorophores ont fourni une mesure de l’étendue de l’expression des films de soie/AAV, et les fibres optiques typiques peuvent facilement accueillir 200 nanolitres de soie/AAV. Avec la pratique, les expérimentateurs peuvent réaliser l’expression fortement fiable autour de la pointe des fibres implantées. Deux problèmes possibles avec les fenêtres crâniens enduites sont l’expression insuffisante, et les films de soie qui ne parviennent pas à dissoudre, et obscurcissent le champ de vision.

Pour augmenter l’expression, une durectomie peut être effectuée avant l’implantation de la fenêtre, et / ou d’augmenter la quantité de virus dans le film. La meilleure expression a été obtenue en utilisant un à quatre mélange de soie et de stock-titer AAV, respectivement. La quantité de soie dans les fenêtres enduites est 10 à 100 fois plus que sur les implants en fibre, et le film est moins intégré dans les tissus, et ne peut donc pas être exposé aux mêmes niveaux d’activité protéolytique qui peuvent dissoudre les films de soie.

Cependant, la présence d’un peu de soie est essentielle à la réalisation de votre expression sous les fenêtres, probablement parce qu’un film fait de virus seul est emporté par le liquide interstitiel pendant la chirurgie. Tout en essayant cette procédure, il est important de préparer et de stocker des implants recouverts de soie de la manière que nous décrivons. Un stockage inadéquat peut modifier les propriétés des films de soie ou diminuer l’efficacité des vecteurs d’expression virale.

Cette technique peut être d’une grande utilité pour les chercheurs dans le domaine des neurosciences des systèmes pour explorer comment l’activité neuronale conduit le traitement sensoriel et cognitif dans le cerveau de mammifères tels que les souris, les rats, ou même les primates non humains. N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs d’expression virale peut être dangereux et que l’équipement de protection individuelle, comme les gants, les lunettes et les blouses de laboratoire, doit toujours être porté pendant qu’il travaille avec le virus associé à Adeno.