Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en mécanobiologie, telles que la façon dont les échantillons biologiques réagissent aux forces mécaniques produites par la stimulation ultrasonique de faible intensité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à un expérimentien d’appliquer des forces mécaniques non invasives à un échantillon et de mesurer différents périmètres biologiques en temps réel. Pour commencer, percez lentement un trou de 12 millimètres au fond d’un plat de culture standard de 35 millimètres à l’aide d’une perceuse à presse verticale.

Une fois percé, retirer les morceaux de plastique fixés au fond du plat à l’aide d’une lame, pour créer une surface lisse sur le côté extérieur. Ensuite, appliquez une fine couche d’époxy ou de colle de qualité marine à la surface inférieure externe du plat. Sur le dessus de l’adhésif, placer un film de polyester de deux points cinq microns d’épaisseur, en appuyant fermement pour s’assurer que l’adhésif se propage uniformément entre le film et la surface en plastique épaisse.

Tirez doucement le film d’une manière centrifuge avec les doigts, pour créer une surface plane. Une fois que l’adhésif a séché, rincer brièvement le plat de fond en polyester avec 95% d’éthanol. Ensuite, les UV stérilisent le plat en le plaçant sous une forte source d’excitation UV de 254 nanomètres.

Ajustez la durée et l’intensité pour fournir une dose UV d’environ 330 millijoules par centimètre carré. Ensuite, diluer un mélange de protéines matricielles extracellulaires disponibles dans le commerce avec le milieu de culture désiré à un rapport de un à 100. Travaillez sur la glace pour prévenir la polymérisation matricielle et appliquez rapidement 100 microlitres du mélange moyen sur le film en polyester.

Remettre le couvercle sur le plat pour maintenir la stérilité. Une fois couvert, incuber les plats de fond en polyester enduits de matrice dans une culture cellulaire, incubateur tamponné de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant six à 12 heures. Après l’incubation, aspirer l’excès moyen et ensemencer directement la surface avec des cellules à la densité désirée.

Placez un réservoir d’eau sous l’objectif d’un microscope droit. Ensuite, à l’aide de composants optométriques disponibles dans le commerce, placez le porte-échantillon entre l’objectif et le transducteur. Assurez-vous que les pièces mobiles et les actionneurs des étapes de traduction se trouvent soit à l’extérieur du réservoir, soit au-dessus de la conduite d’eau pour éviter les dommages causés par l’eau.

Ensuite, remplissez le réservoir d’eau déionisée et dégazée jusqu’au plan horizontal du porte-échantillon, avant d’utiliser le transducteur d’immersion. À l’aide de composants optométriques non corrosifs et disponibles dans le commerce, assurez-vous que le transducteur se positionnant dans une position oblique par rapport au chemin optique. Cela permettra de s’assurer que toutes les ondes réfléchies seront dirigées loin de l’échantillon.

Ajuster la fréquence du générateur de fonction à la fréquence nominale de pointe du transducteur. Ensuite, créez une impulsion de tension sinusoïde de la durée désirée et de la fréquence de répétition, en utilisant le mode rafale du générateur de fonction. Ensuite, ajustez la tension de pointe à maximale à une valeur désirée.

Assurez-vous que la durée de l’impulsion est plus courte que le temps écoulé entre deux impulsions consécutives. Connectez la sortie du générateur de fonction à l’entrée d’un oscilloscope. Utilisez l’oscilloscope pour confirmer que la forme d’onde correspond au signal désiré.

Ensuite, connectez la sortie du générateur de fonction à l’entrée d’une puissance d’un amplificateur RF de bonne taille. À l’aide d’une sonde hydrophone qui fonctionne avec une plage de fréquences et une intensité acoustique compatibles avec celle du transducteur à ultrasons, mettre soigneusement l’extrémité de la sonde au point dans le champ de vision de l’objectif à la position de l’échantillon. Assurez-vous que la sonde et le transducteur sont immergés dans le bain d’eau et effectuez un pré-alignement brut du transducteur en positionnant visuellement son axe acoustique vers la sonde hydrophone.

Assurez-vous que la distance entre les deux correspond à la longueur focale du transducteur. Ne cognez pas la pointe de l’hydrophone avec un objet physique autre que l’eau, car cela modifiera son revêtement et affectera la mesure. Ensuite, connectez la sortie de l’hydrophone à l’une des entrées de signal de l’oscilloscope.

Ensuite, connectez la gâchette de synchronisation du générateur de fonction à une autre entrée oscilloscope. Visualisez les deux signaux simultanément sur l’oscilloscope. Ensuite, conduisez le transducteur avec peu de cycles ultrasoniques à un cycle de faible service et une faible amplitude pour éviter d’endommager la sonde.

Vérifiez auprès du fabricant de l’hydrophone des conditions de fonctionnement sécuritaires pour éviter d’endommager la pointe de l’hydrophone. Réglez le bouton de la division S en fonction du temps de déplacement de l’échographie de la surface du transducteur à l’hydrophone. Recherchez un signal hydrophone sur l’oscilloscope après le déclencheur de synchronisation.

Ensuite, actionner lentement le transducteur à l’aide d’un stade XYZ motorisé ou manuel. Placez le transducteur dans la position qui est corrélée avec le signal hydrophone maximal. Maintenant que le faisceau est aligné, mesurez l’amplitude de pointe à pointe de la sortie hydrophone à l’oscilloscope pour les différentes tensions qui conduisent le transducteur.

Assurez-vous de ne pas dépasser la limite de pression de l’hydrophone. Remplacez le milieu de culture de la cellule par le tampon d’imagerie désiré contenant cinq micromolaires d’un colorant sensible au calcium perméant, comme fluo-4 AM. Ensuite, incubez le plat de culture dans un incubateur tamponné de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, laver soigneusement les cellules avec le même tampon exempt de colorant.

Ensuite, placez le plat dans le porte-échantillon. Exciter les cellules à l’aide de l’éclairage de la lumière bleue à 490 nanomètres. Ajustez l’intensité de l’excitation et l’exposition à la caméra pour éviter un blanchiment excessif ou une saturation des pixels.

Effectuez l’imagerie en accéléré à l’aide d’un objectif d’immersion avec une longue distance de travail pour une meilleure qualité d’image, et pour réduire les réflexions non désirées. Ici, les cellules de glioblastome sont montrées sur le film extracellulaire de polyester matricielle-enduit dans le milieu standard de culture. Ces cellules ont été incubées avec un journaliste fluorescent sensible au calcium.

Dans cette image, les points rouges représentent des cellules fluorescentes individuelles, identifiées à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Lors de la stimulation pendant 10 secondes avec ultrasons, des élévations robustes de calcium ont été visualisées dans beaucoup de régions d’intérêt. Le nombre de régions d’intérêt activées est indiqué ici au fil du temps.

Après l’activation de 10 secondes par ultrasons, environ 70 % des régions se sont trouvées au-dessus des valeurs seuils définies par l’utilisateur. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’aligner le faisceau d’ultrasons avant de faire la mesure de fluorescence.