Identification des souris et des répertoires d’anticorps humain par séquençage de prochaine génération

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode simple et efficace pour visualiser et analyser un répertoire d’anticorps au niveau mondial. Il est possible de décrire des répertoires entiers de cellules B chez les individus et leurs changements dynamiques en réponse à la stimulation immunitaire. Cette méthode peut être appliquée pour analyser des échantillons pathologiques de patients d’infections virales émergentes et pour obtenir les données avec un aperçu sans précédent de la pathogénie de l’infection.

Un des domaines les plus passionnants pour l’application est un contrôle du vaccin. L’efficacité du vaccin peut être évaluée en analysant la dynamique du répertoire mondial des anticorps chez les personnes administrées par un vaccin. L’individu sont nouveaux à cette méthode peut avoir besoin d’optimiser les conditions PCR parce que l’efficacité de l’amplification des gènes anticorps dépend des types de matériaux de départ.

Fla-cher pour l’identification des amplicons d’immunoglobuline. Il est important de démontrer ces actions visuellement. Mlle Sayuri Yamaguchi et M. Hanbing Xue, technicien et étudiant diplômé de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette procédure, disséquez le tissu d’une souris noire de six souris C57 de huit semaines et passez-le à travers un maillage en acier inoxydable avec deux millilitres de PBS pour obtenir des cellules dispersées. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres et une centrifugeuse à 600 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 800 microlitres de tampon de lysage ACK à la pastille.

Incuber sur la glace pendant deux minutes pour lyse les globules rouges dans le tissu. Ensuite, lavez les cellules tissulaires trois fois à l’aide de trois millilitres de PBS pour chaque lavage. Centrifugeuse à nouveau à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le supernatant et ajoutez 800 microlitres de phénol/guanidine isothiocyanate reagent à la pastille et vortex à fond. Incuber à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme et agiter manuellement pendant 15 secondes.

Incuber à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Centrifugeuse à 12 000 fois g et à 25 degrés Celsius pour séparer les phases. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.

Ajouter un volume de 70 % d’éthanol. Vortex brièvement et appliquer ce mélange sur la colonne de spin de silice. Elute l’ARN avec 30 à 100 microlitres d’eau.

Après cela, utilisez un fluoromètre pour quantifier la concentration initiale d’ARN. Conservez l’ARN purifié à moins 80 degrés Celsius. Tout d’abord, synthétiser le premier brin cDNA de deux à 10 microgrammes de modèle d’ARN total en utilisant l’amorce 5'RACE CDS et l’oligonucléotide SMART-PCR selon les instructions du fabricant.

Pour l’immunoglobuline de souris, PCR amplifie cDNA avec la polymése d’ADN haute fidélité, utilisant l’amorce avant universelle et les amorces inverses spécifiques à la classe d’immunoglobuline, comme décrit dans le protocole de texte. Pour l’immunoglobuline humaine, effectuez le premier PCR à l’aide de l’amorce avant universelle et des amorces inversées spécifiques à la classe immunoglobuline avec des séquences d’étiquettes. Incluez les séquences d’index pour chaque échantillon par deuxième PCR à l’aide d’amorces de séquence d’index.

Ensuite, électrophorese l’un ou l’autre des produits PCR sur un gel agarose de 2%. Visualisez les bandes d’ADN sur un transilluminateur UV et excisez la tranche de gel contenant la large bande entre 600 et 800 paires de base. Ajouter 10 microlitres de solution de liaison membranaire par tranche de gel de 10 milligrammes.

Mélanger et incuber à 50 à 65 degrés Celsius jusqu’à ce que les tranches de gel se dissolvent complètement. Ensuite, transférez la solution de gel sur la colonne de spin de la membrane de silice. Lavez la colonne une fois avec le tampon de lavage et élisez l’ADN avec 50 microlitres d’eau sans nucléase.

À l’aide d’un fluoromètre, quantifier les amplicons purifiés et mettre en commun les amplicons de chaque classe d’immunoglobuline en quantités égales pour le séquençage NGS. Après cela, utilisez une électrophoresis à base de microcapillaires avec puce de dimensionnement d’ADN pour déterminer la taille et la concentration des bibliothèques. Stockez les bibliothèques à moins 20 degrés Celsius.

Tout d’abord, générer une feuille de calcul d’échantillon de l’exécuter de séquençage tel que décrit dans le protocole de texte. Ensuite, décongelez une cartouche de reagent et les bibliothèques. Faire une solution normale de 0,2 hydroxyde de sodium et diluer les bibliothèques pour obtenir les concentrations molaires souhaitées.

Rincez et séchez ensuite la cellule d’écoulement et ajoutez 600 microlitres de la solution de bibliothèque diluée et dénaturée dans le puits de la cartouche de reagent, et commencez la course de séquençage. Une perspective d’un répertoire d’anticorps murine dans son ensemble peut être obtenue à partir de cellules ou de tissus tels que la rate, la moelle osseuse, le ganglion lymphatique ou le sang. Les résultats représentatifs des répertoires IgM, IgG1, IgG2c et immunoglobuline de la chaîne lumineuse d’une rate de souris naïve sont présentés ici.

Dans le réarrangement V(D)J par parcelle 3D V(D)J, la taille de chaque boule représente le nombre relatif de lectures. En d’autres termes, il représente le nombre d’anticorps dans les cellules B entières. Le maillage 3D se compose de 110 gènes V à chaîne lourde d’immunoglobuline, de 12 gènes de la chaîne D lourde d’immunoglobuline et de quatre gènes J à chaîne lourde d’immunoglobuline, qui sont alignés pour refléter leur ordre sur le chromosome.

L’intrigue 2D VJ montre le profil de réarrangement VJ dans le répertoire IGL. La longueur de chaque barre représente le nombre relatif de lectures. L’axe X représente 101 gènes V-kappa de la chaîne lumineuse de l’immunoglobuline, et trois gènes V-lambda de la chaîne lumineuse de l’immunoglobuline, et l’axe Y représente quatre gènes J-kappa de la chaîne lumineuse de l’immunoglobuline et trois gènes J-lambda de la chaîne lumineuse de l’immunoglobuline.

Une perspective d’un répertoire humain d’anticorps dans son ensemble peut être analysée à partir de divers tissus, y compris les cellules mononucléaires périphériques du sang ou les tissus pathologiques. Les résultats représentatifs des répertoires IgM, total IgG, total IgA, IgD, IgE et IgL des cellules mononucléaires sanguines périphériques normales sont montrés ici. Comme le modèle murin, le profil du répertoire du réarrangement V(D)J est affiché sur l’intrigue 3D V(D)J dans laquelle la taille de chaque boule représente le nombre relatif de lectures.

Le maillage 3D se compose de 56 gènes V à chaîne lourde d’immunoglobuline, de 27 gènes de la chaîne D lourde de l’immunoglobuline et de six gènes J à chaîne lourde d’immunoglobuline, alignés dans l’ordre où ils apparaissent sur le chromosome. Le profil du réarrangement VJ dans le répertoire IgL est représenté dans l’intrigue VJ 2D dans laquelle la longueur de chaque barre représente le nombre relatif de lectures. L’axe X représente 41 gènes V-kappa de la chaîne de lumière de l’immunoglobuline, et 32 gènes V-lambda de chaîne de lumière d’immunoglobuline, et l’axe Y représente cinq gènes de la chaîne de lumière d’immunoglobuline J-kappa, et cinq gènes de J-lambda de chaîne de lumière d’immunoglobuline.

Dans le matériel d’étude de ce protocole, un petit nombre de cellules triées par cytométrie de flux ou même cryosections d’échantillons pathologiques sont utilisables. Toutefois, une optimisation minutieuse des conditions pcr sera nécessaire. Étant donné que l’information sur la production de ce protocole est énorme, l’alphabétisation en bioinformatique aiderait à trouver la structure du réseau d’anticorps.

Cela conduirait non préparé à une compréhension profonde du système immunitaire.