Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la délibération de l’UCMSC, comme la meilleure source d’USMSC pour la thérapie cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un isolement constant et une prolifération vigoureuse de l’UCMSC chez les nourrissons prématurés et à terme. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des maladies insolubles.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la délibération de l’UCMSC, elle peut également être appliquée à d’autres sources de MSC, telles que le tissu adipeux, le synovium, la peau, la pulpe dentaire, et ainsi de suite. En général, un individu nouveau à cette méthode luttera parce qu’il y a tant de variation dans les étapes de la dissection ombilicale et de l’isolement mésenchymal de cellules souches. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car ces étapes sont difficiles à apprendre car il y a plusieurs points susceptibles d’être négligés.

Pour commencer à disséquer le cordon ombilical, préparez d’abord un plateau métallique, des ciseaux stérilisés et des forceps, des pipettes de dix millilitres, des pipettes de 25 millilitres et deux plats de culture tissulaire de 60 millimètres. Réchauffez les mélanges d’enzymes purifiées PBS, un 500 millilitres de sérum réduit moyen et milieu de culture, à température ambiante. Retirez le cordon ombilical précédemment isolé d’un tube de 50 millilitres dans l’alpha MEM et placez-le dans le bac en plastique.

Pesez le cordon ombilical, puis utilisez des ciseaux stérilisés pour disséquer cinq grammes du cordon. Pour stériliser le cordon ombilical, utilisez une pipette de dix millilitres pour verser dix millilitres d’éthanol à 70 pour cent. Lavez ensuite le cordon deux fois en ajoutant dix millilitres de PBS avec une pipette de dix millilitres.

Placer le cordon ombilical lavé dans le plat de culture tissulaire stérilisé de 60 millimètres et ajouter dix millilitres de sérum réduit moyen et 0,5 millilitres mélanges d’enzymes purifiées. Utilisez des ciseaux stérilisés et des forceps pour couper le cordon en morceaux de deux à trois millimètres. Placer le plat dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, coupez les morceaux partiellement digérés en plus petits morceaux, et incubez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent jusqu’à ce que l’homogénéité devienne visqueuse. Enfin, assurez-vous que l’homogénéité coule facilement à travers une pipette de 25 millilitres. Préparez d’abord quatre tubes en plastique de 50 millilitres dans une bouteille de 500 millilitres de culture moyenne.

Utilisez une pipette de 25 millilitres pour diviser l’homogénéité du cordon ombilical en deux tubes en plastique de 50 millilitres avec environ 7,5 millilitres dans chaque tube. Ajouter ensuite 20 millilitres de milieu de culture dans chaque tube et bien mélanger. Recueillir chaque homogénéité avec une pipette de 25 millilitres et filtrer à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres placée au-dessus d’un nouveau tube de collecte de 50 millilitres.

Centrifugeuse deux tubes avec filtrates à 1000g pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation terminée, aspirer soigneusement le supernatant et le jeter. Ajouter cinq millilitres de milieu de culture à chaque tube et suspendre à nouveau les granulés cellulaires.

Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 60 millimètres et la culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Pour la culture de l’UCMSC, réchauffer le PBS, trypsine EDTA, et le milieu de la culture, à la température ambiante. Lorsque les cellules sont fixées à la plaque, retirez le milieu et lavez-les deux fois avec cinq millilitres de PBS pour enlever les débris et les globules rouges.

Ajouter le milieu de culture et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Remplacer le milieu deux fois par semaine, et la culture des cellules jusqu’à ce qu’ils atteignent 90 à 100 pour cent de confluence. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS, ajoutez 0,5 millilitres de trypsine EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes.

Lorsque les cellules deviennent arrondies et détachées, ajouter neuf millilitres de milieu de culture, et bien mélanger pour inactiver la trypsine. Ajouter la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 100 millimètres. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 à 100 pour cent de confluence.

Répétez la trypsinisation et divisez-les en deux nouvelles plaques, jusqu’au dixième passage. L’expression de marqueur de surface des UCMSC a été employée comme critère pour leur caractérisation. Lorsqu’ils sont incubés avec des anticorps appropriés et analysés par cytométrie d’écoulement, ils ont été trouvés positifs pour les marqueurs de signature de MSC, mais négatifs pour le macrophage de monocyte, négatifs pour les cellules souches hématapoïétiques et les cellules ephithéliales, négatifs pour la cellule B, négatifs pour les leucocytes de casserole, et négatifs pour les marqueurs complexes majeurs d’histocompatibilité.

Pour évaluer la capacité de différenciation de trilinage des USCMSC des enfants en bas âge prématurés et à terme, les cellules ont été induites pour différencier en adipocytes, ostéocytes, et chondrocytes. L’UCMSC s’est différencié avec succès dans les trois types de cellules mésodermiques confirmant leur capacité de différenciation. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il ya quatre étapes critiques.

Couper le cordon en morceaux de deux à trois centimètres, couper en petits morceaux, s’assurer que l’homogénéité coule facilement à travers une pipette de 25 millilitres, et filtrer l’homogénéité à travers une passoire à cellules de 100 micromètres.