Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Cette méthode facilite la dissection reproductible et le tranchage des troncs cérébraux des rongeurs pour l’analyse capturée du réseau respiratoire médullaire mirien. Cette technique offre une grande flexibilité expérimentale, ce qui permet de préparer soit un déblocage in vitro, soit une préparation en tranches pour l’enregistrement. Cette méthode peut être utilisée pour des expériences d’électrophysiologie pour explorer le circuit de contrôle neuronal qui génère des rythmes respiratoires et pour comprendre la pathologie et la déréglementation de la respiration chez les rongeurs génétiquement modifiés.

Après dissection de la neuraxis, transférez rapidement le tronc isolé de l’animal à une chambre de dissection aérée sous un microscope de dissection et placez le côté dorsale de tissu vers le haut, avec l’extrémité rostrale faisant face à l’avant de la chambre. Épinglez le tissu aux épaules et à l’extrémité la plus caudale de la moelle épinière et faites une incision midsagittal à travers le crâne suivant la suture pariétale pour éviter d’endommager le cortex et le tronc cérébral sous-jacents au crâne. À partir de la suture sagittale et en travaillant latéralement, couper les sutures occipitales du crâne pour créer des volets d’os qui peuvent être réfléchis et épinglés pour ancrer et stabiliser la partie rostrale du crâne.

Après avoir réfléchi les deux volets du crâne, exciser le reste du cortex cérébral, laissant la partie caudale du cervelet relativement intacte pour effectuer une laminectomie dorsale. Utilisez des micro ciseaux à ressort et des forceps pour enlever la musculature entourant le crâne et la colonne vertébrale. Retirer le tissu le long du côté dorsal de la cage thoracique, en laissant les côtes intactes et soigneusement étouffer les processus latéraux de la lamina vertébrale.

Après avoir coupé tout tissu qui survole les pons et la médulle, le verme, le cervelet, les pons et le début de la moelle épinière seront clairement visibles. Pour effectuer une laminectomie ventrale, placez le côté dorsale du tissu vers le bas et épinglez à la cage thoracique et à l’extrémité la plus caudale de la colonne vertébrale. Utilisez les volets du crâne pour épingler le côté rostral du tissu et enlever la moitié ventrale de la cage thoracique, y compris le sternum et tous les organes abdominaux.

Disséquer les tissus mous attachés à la cage thoracique pour exposer les côtes et la moelle épinière et enlever la langue, l’œsophage, la trachée, le larynx et tous les autres tissus mous et la musculature qui survolent la base du crâne et de la colonne vertébrale. Afin d’identifier la palette dure, disséquer le tissu au-dessus de cette plaque rectangulaire d’os à la base du crâne, qui comprend une indentation en forme de V. Ensuite, coupez le long de la ligne médiane de la palette, soulevant soigneusement le tissu vers le haut et effectuez une coupe transversale pour l’enlever.

Pour commencer une laminectomie ventrale, retirez le lamina, exposant la surface ventrale du tronc cérébral et de la moelle épinière de la première vertèbre cervicale à environ la vertèbre thoracique sept et coupez cinq à 10 millimètres le long des deux côtés de la colonne vertébrale au lamina. Lorsque la moelle épinière a été exposée, couper les radis environ 20 à 25 millimètres bilatéralement, le long de la colonne vertébrale à environ T7 et soulever soigneusement le bord rostral de C1, C2 et C3 avec des forceps accrochés ou pliés pour permettre le balayage sous l’os pour l’enlèvement des trois vertèbres. Lorsque la longueur désirée de la moelle épinière a été isolée de la colonne vertébrale, faire une coupe transversale pour enlever le tissu médullaire.

Après avoir enlevé le dura, placez le tronc cérébral au centre de la plate-forme de paraffine sur le bloc de coupe en plastique et utilisez de fines épingles à insectes, taillées à un centimètre de longueur pour épingler l’extrémité caudale du tronc cérébral à travers la moelle épinière distale. Alignez ensuite le bloc de coupe couvert de paraffine avec le tronc cérébral épinglé dans le support de bloc vibratone, de sorte que la lame coupera perpendiculairement à la face rostrale du tronc cérébral. Ensuite, faire une première tranche pour enlever 200 à 300 micromètres de tissu extranétique inégal sur l’extrémité la plus rostrale du tissu, en faisant de petits ajustements si nécessaire pour assurer la linéarité PARP et de petites coupures pour enlever tout tissu inégal.

Les radis glossopharyngés deviendront visibles au bord latéral du tronc cérébral, couperont une tranche de 300 à 500 micromètres de tronc cérébral à partir de ces marqueurs neuroanatomiques rostrals pour capturer le complexe pré-Botzinger et les circuits de transmission associés. Toutes les étapes de la procédure de tranchage sont essentielles pour créer une tranche reproductible et viable, avec tous les circuits neuronaux nécessaires dans l’orientation correcte pour produire un rythme robuste. Tous les éléments de circuit neuronaux minimalement nécessaires pour générer et transmettre le rythme inspiratoire peuvent être capturés en une mince tranche à l’aide de cette méthode.

Y compris le complexe pré-Botzinger, les neurones pré-moteurs se projetant vers les neurones moteurs hypoglossaux et les racines nerveuses hypoglossales. Le complexe pré-Botzinger, les rootlets hypoglossaux ou 12èmes de nerf crânien et les rootlets nerveux C4 peuvent alors être utilisés pour l’enregistrement inspiratoire. L’aspect clé de cette procédure est l’isolement soignif des rootlets et la confirmation que le tronc cérébral n’est pas endommagé avant de couper la tranche finale.

À la suite de cette procédure, des enregistrements d’électrophysiologie peuvent être réalisés à l’aide de méthodes de pince à patch, d’enregistrements cellulaires supplémentaires ou d’électrodes d’aspiration pour enregistrer l’activité électrique produite par le réseau. Les protocoles publiés précédemment ont fourni peu de détails étape par étape, ce qui rend difficile pour les nouveaux chercheurs d’utiliser cette méthode sans se rendre dans un autre laboratoire et passer du temps avec un chercheur chevronné.