Enquête bio-énergétique en temps réel à l’aide de Candida albicans analyse extracellulaire de Flux

Ce protocole est significatif pour déterminer la fonction glycolytique et la respiration mitochondrique dans Candida albicans. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer la fonction mitochondriale sans avoir besoin de purifier les mitochondries de Candida albicans. Cette méthode peut être optimisée pour étudier les effets de la manipulation génétique ou des modulateurs chimiques sur les voies mitochondriales et glycolytiques chez Candida albicans ou d’autres pathogènes fongiques.

Cette technique est relativement simple. Ou selon l’organisme, leur utilisation peut aider à optimiser le nombre de cellules et la concentration d’inhibiteurs mitochondriques dans leur analyse. Dans une hotte d’écoulement laminaire, dissoudre poly-D-Lysine dans l’eau du réseau tissulaire à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre.

Bien mélanger la solution et l’aliquot en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre en s’assurant d’aliquot au moins 1,3 millilitres par tube. Ajouter 50 microlitres de ce mélange à chaque puits de la plaque d’essai, couvrir le couvercle et incuber à température ambiante pendant une à deux heures. Ensuite, aspirez la solution.

Rincer les puits de la plaque d’essai une fois avec 500 microlitres d’eau stérile de qualité de culture tissulaire, ouvrir le couvercle et laisser sécher les puits à l’air libre. Si vous n’utilisez pas la plaque le jour de sa préparation, conservez-la à quatre degrés Celsius pendant un maximum de deux à trois jours. La veille de l’expérience, ouvrez le kit d’analyse de flux supplémentaire et retirez le contenu.

Placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire. Remplissez chaque puits de la plaque utilitaire d’un millilitre de calibre, puis placez la cartouche du capteur en arrière. Assurez-vous que les capteurs qui contiennent des fluorophores sont immergés dans le calibre.

Incubez la cartouche du capteur à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant la nuit. La veille de l’essai, inoculer les albicans C préparés dans le bouillon YPD et pousser toute la nuit à 30 degrés Celsius dans un shaker à 200 rpm. Le jour de l’analyse, diluer un nombre approprié de cellules dans le milieu d’essai pour donner une concentration finale de 100 000 cellules par 100 microlitres.

Ajouter 100 microlitres des cellules diluées dans chaque puits de la plaque d’analyse, à l’exception des puits A1, B4, C3 et D6. À ces puits, ajouter seulement 100 microlitres de milieu d’analyse pour la correction de fond. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 60 minutes pour laisser les cellules adhérer à la surface de la plaque. Préparer les composés pour l’analyse de la fonction mitochondrique à la concentration de 10X dans le milieu d’analyse correspondant tel que décrit dans le protocole de texte.

Ajouter 50 microlitres de SHAM dans le port A, 50 microlitres d’Oligomycine dans le port B, 62 microlitres de cyanure de potassium dans le port C, et 68 microlitres d’Antimycine A dans le port D.Next, préparer les composés pour l’analyse de stress glycolytique à la concentration de 10X dans le milieu d’analyse correspondant tel que décrit dans le protocole de texte. Ajouter 50 microlitres de glucose au port A, 55 microlitres d’Oligomycine dans le port B, 62 microlitres de 2-DG dans le port C, et 68 microlitres d’Antimycine A dans le port D.Avant l’essai, ouvrez l’analyseur de flux supplémentaire et configurez le modèle d’essai en utilisant l’onglet assistant d’essai. Suivez les instructions étape par étape et remplissez toutes les informations qui apparaissent pendant la configuration.

Générer une mise en page de groupe et configurer le protocole tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Enregistrez ces dispositions avant l’analyse. Au moment de l’analyse, restaurer le protocole enregistré en ouvrant le fichier correspondant dans l’option de fichier ouvert dans l’onglet assistant d’analyse.

Chargez ensuite les composés 10X dans les ports respectifs de la cartouche de capteur hydratée contenant le calibre. Chargez la cartouche du capteur dans le plateau du transporteur de l’analyseur de flux supplémentaire. Démarrez l’étalonnage en cliquant sur le bouton de démarrage sur l’écran.

Ensuite, ajouter délicatement 350 microlitres du milieu d’essai à la plaque cellulaire le long du côté des murs pour minimiser les perturbations cellulaires, ce qui porte le volume final à 450 microlitres. Remplacez la plaque d’utilité contenant le étalonnage par la plaque d’essai et continuez l’analyse. Une fois l’essai terminé, retirez la cartouche du capteur et la plaque.

Enregistrez le fichier dans le dossier de destination approprié. Dans cette étude, les fonctions bioéco énergétiques des albicans C sont évaluées par analyseur de flux supplémentaire. Un mutant dépourvu de la protéine mitochondriale mam33 est également inclus avec sa souche complémentaire pour étudier les effets de la suppression d’une protéine mitochondriale sur le taux de consommation d’oxygène et les taux d’acidification extracellulaire.

Le type sauvage C albicans montre un taux de consommation d’oxygène de 145 picomoles par minute qui est bien dans la plage optimale pour tout essai de flux extracellulaire. Le taux de consommation d’oxygène basal du type sauvage, des souches mutantes mam33 et mam33 complétées ne montre aucune différence. De même, aucune différence significative n’est observée dans les taux d’acidification extracellulaire basale entre les souches.

Cependant, en inhibant le complexe IV avec le cyanure de potassium, le type sauvage et le mutant mam33, les souches complétées de mam33 montrent un décalage significatif vers la glycolyse. La souche mutante mam33 n’a toutefois pas montré un décalage glycolytique compensatoire suggérant que la voie dépendante composé-IV soit altérée dans cette souche. Dans le test de stress glycolytique, les cellules sont affamées de glucose pendant une heure et le taux de consommation d’oxygène basal et le taux d’acidification extracellulaire sont mesurés.

Lors de la famine, la souche mutante mam33 montre une consommation d’oxygène significativement plus faible et des taux d’acidification extracellulaire par rapport aux autres souches. Ceci suggère une utilisation altérée du glucose pour la respiration et la glycolyse quand les cellules sont forcées à la condition de famine. Après l’injection de glucose, toutes les souches montrent une stimulation de leur taux de consommation d’oxygène et de leur taux d’acidification extracellulaire.

Le revêtement de la plaque d’essai permet aux cellules candida albicans d’adhérer à la plaque. L’adhérence incorrecte des cellules d’albicans de Candida affectera le résultat d’essai. Après le développement de cette technique, il a été employé dans un large éventail de types de cellules et de maladies traitant comment les mitochondries fonctionnent pendant des conditions physiologiques et pathologiques.

Par exemple, en utilisant des cellules dérivées du patient et de contrôle dans ce test, il est possible d’aborder les questions spécifiques de la façon dont la fonction mitochondriale est modifiée. Il faut prendre soin de préparer des inhibiteurs mitochondriques tels que le cyanure de potassium et l’antimycine A parce que ces composés sont extrêmement toxiques.