Analyse des taux de consommation d’oxygène dans les Cardiomyocytes néonatals cultivés primaires de souris à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire

Ce protocole nous permet d’isoler et de culture le bi-BBT élevé, connu seulement aux cardiomyocytes de souris. Pour évaluer la fonction mitochondriale, le taux de consommation d’oxygène des cardiomyocytes peut être analysé par un analyseur réel de flux d’argent. Un des avantages de cette technique est que la consommation d’oxygène des cardiomyocytes peut être facilement mesurée dans leur état d’adhérent en format 96-puits, ce qui permet de tester de multiples conditions avec un grand nombre de répliques.

Ce navire fournit un aperçu important du domaine de recherche en cardiologie. En plus de la consommation d’oxygène, nous pouvons également étudier d’autres paramètres métaboliques, tels que les grisgrices et l’epoxidation peracid. La réalisation d’une grande variabilité des cardiomyocytes est essentielle pour cette expérience.

Cela nécessite une digestion efficace des cœurs. Puisque les cardiomyocytes néonatals sont très fragiles, la manipulation douce des cardiomyocytes est également importante. Dans le capot de culture cellulaire, aliquot 5ml de HBSS à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits et le placer sur la glace.

En outre, aliquot 10ml de HBSS à un plat de culture cellulaire de 10cm, puis, préparer 20 ml de trypsine solution de prédigestion dans un tube conique stérile de 50ml. Gardez toutes les solutions sur la glace. Ensuite, extraire le cœur et le transférer immédiatement dans le plat stérile de culture cellulaire contenant HBSS.

Enlevez tout tissu pulmonaire résiduel et les vaisseaux plus gros. Lavez le cœur dans HBSS à l’aide d’agitation douce. Par la suite, couper le cœur avec des ciseaux fins en 8 morceaux et transférer le tissu cardiaque avec des forceps dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits avec HBSS.

À l’aide d’une cuillère moria, laver le tissu cardiaque en le transférant du puits au puits dans la plaque de 6 puits remplie de HBSS. Ensuite, transférez le tissu cardiaque dans un tube conique contenant 20ml de trypsine et couvez avec une agitation douce à 4 degrés Celsius pendant 4 heures. Dans cette procédure, préchamez la solution de digestion de collagène dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.

Transférer le tube conique contenant du tissu cardiaque et la solution de prédigestion de 4 degrés Celsius à une hotte de culture cellulaire. Laissez couler le tissu cardiaque au fond du tube et retirez la solution de prédigestion à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Ensuite, ajouter 10ml de HBSS dans le tube.

Resuspendez le tissu cardiaque avec HBSS 2 à 3 fois pour laver trypsine à l’aide d’une pipette sérologique de 10ml. Aspirez HBSS et ajoutez 10ml de solution préchaurée de digestion de collagène dans le tube avec le tissu cardiaque. Pour la première digestion, incuber le tube avec du tissu cardiaque dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes sans agitation.

Ensuite, transférez le tube sur le capot de culture cellulaire. Triturer le tissu en le réutilisant doucement 10 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Cela permettra au cœur de se disperser et aux cellules d’être libérées du tissu cardiaque.

Laissez couler le tissu non digéré. Transférer la solution digérée enrichie en cardiomyocytes dans un nouveau tube conique et ajouter immédiatement une quantité égale de milieu de culture cellulaire pour arrêter la digestion collagène. Ajoutez ensuite 10ml de solution de digestion de collagène dans le tube contenant le reste du tissu cardiaque non digéré.

Pour la deuxième digestion, incuber le tube avec du tissu cardiaque dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Répétez les procédures de la première digestion et transférez la solution digérée enrichie en cardiomyocytes dans un nouveau tube conique avant d’arrêter la digestion des collagènes. Ensuite, placez une passoire cellulaire stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml.

Pré-mouiller la passoire cellulaire avec 2 à 3 ml de milieu de culture cellulaire et passer les cellules à travers la passoire cellulaire. Par la suite, rincer la passoire cellulaire avec le milieu de culture cellulaire. Puis, centrifugeuse le tube conique contenant des cardiomyocytes pendant 5 minutes à 180 fois la gravité.

Après 5 minutes, aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire dans 10ml de milieu de culture cellulaire. Plaquez les cellules sur un plat de culture cellulaire de 10 cm et incubez-les pendant une heure. Ensuite, agitez doucement la plaque.

Lavez les cellules non adhérentes et résuspendez les cellules en pipetant à plusieurs reprises le milieu de culture cellulaire sur le plat à l’aide d’une pipette sérologique de 10ml. Ensuite, transférez les cellules non adhérentes dans un nouveau plat de culture cellulaire de 10 cm et incubez-les pendant une autre heure. Après une heure, agiter doucement la plaque et laver les cellules non adhérentes.

Transférer les cardiomyocytes dans un nouveau tube conique de 50ml. Ensuite, préparez une plaque de culture de 96 puits en incitant 50 microlitres de solution de revêtement dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits. Si des bulles sont présentes, retirez-les à l’aide d’une pipette de 20 microlitres.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure pour permettre le séchage du revêtement matricielle. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Plaquez les cellules dans la matrice extracellulaire enduite de plaque de culture cellulaire de 96 puits à une densité comprise entre 10 et 30 mille cellules par puits.

Et placez les cellules dans l’incubater. Pour préformer l’analyse de consommation d’oxygène, hydratez une cartouche de capteur d’analyseur de flux pendant au moins 3 heures, ajoutez 200 microlitres de solution calibrée dans chaque puits de la plaque d’utilité. Remettre la cartouche du capteur sur la plaque d’utilité et incuber à 37 degrés Celsius sans supplément de CO2 ou d’O2 pendant au moins 3 heures.

Une heure avant l’essai, retirez doucement le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec 200 microlitres de milieu de test de stress mitochondrial préchauré deux fois. Après le deuxième lavage, ajouter 175 microlitres de milieu de test de stress mitochondrial préchauré. Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone ou supplémentation en oxygène.

Préparer 3ml de chacun des composés d’essai dans le milieu de test de stress mitochondrial. Chargez 25 microlitres de chaque composé dans les ports d’injection de la cartouche de capteur à l’aide d’une pipette multicanal. L’état des cellules et les prétraitements peuvent affecter la restauration maximale obtenue par injection de FCCP découpler.

La sensibilité cellulaire au découpler peut également changer, par conséquent, il est essentiel d’optimiser la concentration de travail de FCCP pour chaque traitement particulier. Par la suite, configurez le protocole d’analyse de flux extracellulaire et démarrez le programme. Tout d’abord, mettre le capteur cartiridge dans la machine pour étalonnage.

Remplacez le calibreur pour la plaque d’essai une fois que l’étape d’étalonnage est faite. Si désiré, après l’essai, jetez soigneusement tous les médiums d’analyse à l’aide d’une pipette multicanal. Et stocker la culture cellulaire mircoplate à négatif 20 degrés Celsius pour la normalisation cellulaire future en utilisant l’analyse des protéines.

En utilisant le protocole décrit, les coeurs ont été isolés du jour 0 les chiots et les cardiomyocytes néonatals ont été ensemencés à des densités de 10, 20 ou 30 mille cellules par puits dans les plaques de 96 puits. Après la culture du jour au lendemain, les cardiomyocytes ont été trouvés bien attachés à la surface en plastique enduit et il y avait très peu de cellules non attachées. À ce stade, les cardiomyocytes spontanément contractants étaient facilement visibles.

Une densité d’ensemencement de 30 000 cellules par puits a montré une confluence un jour après l’ensemencement à mesure que les cellules se propageaient. Des cardiomyocytes ont été immunotachés avec un anticorps contre l’actinine d’alpha sarcomeric, un marqueur spécifique de cardiomyocyte. Comme indiqué ici, la plupart des cellules ont montré la coloration positive de l’actinine alpha indiquant la pureté élevée de l’isolement cardiomyocyte.

Un schéma d’un test de stress mitochondrial typique est montré ici. Le test de stress mitochondrial commence par une mesure de base du taux de consommation d’oxygène, ceci est suivi par l’injection de myosine d’Oligo qui inhibe atpa. Puis, l’agent de découplage FCCP a été injecté pour mesurer le taux maximum de consommation d’oxygène.

Enfin, avec l’injection de deux inhibiteurs complexes de transport d’électrons, la respiration mitochondriale s’arrête complètement et ocr diminue à son niveau le plus bas. Pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Il est essentiel d’atteindre une survie élevée.

Par conséquent, il est important d’utiliser des nouveau-nés nouveau-nés et des tissus cardiaques manipulés en douceur dans les cardiomyocytes. En utilisant des lignes de souris manipulées génétiquement nouvelles ou existantes, cette méthode peut être facilement traduite en données qui peuvent conduire à la compréhension de nouveaux mécanismes de régulation bioénergétique dans le cœur. Les mitochondriaux jouent un rôle clé dans la fonction cardiaque.

Nous nous attendons à ce que cette méthode aide à identifier de nouveaux régulateurs et voies régulant le métabolisme oxydant et trouvant de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’insuffisance cardiaque.