Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Cette méthode peut révéler des modèles spatiaux d’expression des gènes bactériens et des stratégies d’adaptation physiologique aux micro-environnements des tissus hôtes qui sont perdus lorsqu’ils sont en moyenne dans l’ensemble de la population dans les tissus. Avec cette technique, des hétérogénéités potentielles peuvent être détectées qui doivent être prises en compte lors de l’identification de nouvelles voies bactériennes et protéines à cibler par des antivirulences ou des composés antibactériens. Commencez par strier les souches s.aureus d’intérêt sur les plaques d’agar sanguin à partir d’un stock congelé de glycérol et en incubant les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures pour confirmer leurs phénotypes hémolytiques en fonction de leur capacité à lyser les globules rouges et à former des zones transparentes claires.

Inoculer des isolats de colonie unique de chaque souche en quatre millilitres de bouillon de soja tryptique, ou BST, dans des tubes de verre stériles et faire pivoter les tubes à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures dans un rouleau à tube à un angle d’environ 70 degrés et 70 rotations par minute. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 600 nanomètres, ou OD 600, des cultures sur un spectrophotomètre et diluez les cellules à un OD 600 de 0,05 en 25 millilitres de BST stérile à un rapport de cinq à un flacon par volume en flacons de 125 millilitres Delong. Incuber les cultures dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius à 280 rotations par minute et récolter les cellules pendant la phase exponentielle.

Pelleter les cellules par centrifugation et laver les cellules deux fois dans un volume égal de PBS stérile. Puis résuspendez les cellules dans le PBS frais à une fois 10 à la huitième colonie formant des unités par concentration millilitre pour leur injection suivante dans un animal destinataire. Au point final expérimental approprié, récoltez le rein, le cœur, le foie, les poumons et la rate en tubes de polypropylène de 15 millilitres contenant de la formaline tamponnée à 10 % pendant une incubation de 24 à 48 heures dans l’obscurité à température ambiante avec une légère secousse ou rotation.

À la fin de la fixation, intégrer les organes dans un milieu clair de congélation des tissus pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un cryostat pour acquérir 10 sections de tissus épais de micromètre et sécher les sections sur des glissières de verre chargées pré-nettoyées individuelles pendant 20 minutes dans l’obscurité avant d’appliquer un support de montage dur complété par dapi. Appliquez ensuite des feuillets de couverture et guérissez les glissières à température ambiante pendant la nuit avant de transférer les échantillons à l’entreposage à long terme à quatre degrés Celsius.

Pour identifier les lésions dans les échantillons, placez une diapositive sur la scène d’un microscope confocal à balayage laser et utilisez un objectif approprié pour visualiser les cellules individuelles pour acquérir des images des lésions. Pour mesurer les intensités de fluorescence dans les images confocales, ouvrez une image dans ImageJ et ajustez la luminosité et le contraste pour visualiser correctement le signal de fluorescence de la lésion. Définissez la région d’intérêt en utilisant l’outil de sélection polygone et ajoutez le retour sur investissement au gestionnaire de retour sur investissement sous l’onglet Modifier dans ImageJ.

Sélectionnez Modifier, puis Sélectionnez, et enfin Ajouter au Gestionnaire. Ensuite, renommez le roi et étiquetez l’image respective. Pour définir le centroïde, ouvrez l’onglet Analyser et sélectionnez Zone, Valeur grise moyenne, Centroïde et Limite de seuil.

Extraire la valeur d’intensité de fluorescence centroïde ou mesurer l’intensité moyenne de fluorescence dans une lésion donnée par unité. Pour ce faire, il est possible d’utiliser la fonction de seuil pour fixer les limites de fluorescence inférieures et supérieures au besoin. Exportez les données vers un fichier Excel et préparez une colonne indiquant l’intensité moyenne de fluorescence par unité de surface pour la périphérie et le noyau.

Pour calculer les intensités moyennes de fluorescence par unité de surface dans la périphérie et le noyau, définissez manuellement les limites supérieures et inférieures du seuil. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusion fluorescence est en moyenne près de neuf fois plus élevé dans les cellules portant le gène de fusion que dans les cellules ne portant pas la fusion reporter. De même, la fluorescence de fusion de tomate dimère tandem est environ six fois plus élevée que le contrôle de reporter nul.

Le modèle des activités de journaliste peut être confirmé par la cytométrie de flux avec des homogénéités de tissu. Bien que les différences de pli dans la fluorescence sont généralement plus faibles. Les variations dans les mesures de fluorescence peuvent être dues à l’expression hétérogène des journalistes.

Par exemple, dans ces échantillons représentatifs, on a observé que certaines lésions exprimaient l’un ou les deux des reporters dans environ 100 micromètres de distance dans le même échantillon de tissu. L’examen de l’activité du journaliste à une résolution cellulaire unique dans les communautés abcess staphylococciques révèle une régulation spatiale de l’expression thermonucléase staphylocoque aureus dans les abcès circonscrits avec une forte coloration DAPI, probablement associée à la formation et à la libération de pièges extracellulaires neutrophiles. Par exemple, la fluorescence de fusion de GFP de staphylococcus aureus aureus sensiblement plus élevée est observée dans le noyau intérieur de la communauté staphylococcique d’abcèss comparée localisée à la périphérie.

Dans le même abcess, le modèle pour la fluorescence dimeric tandem de fusion de tomate semble être inversé. Cependant, le modèle dans cette expérience n’était pas statistiquement significatif. L’obtention de dissections cryo-intégrées intactes est essentielle à l’analyse de l’image de fluorescence et doit être effectuée avec soin.

Le tri des cellules bactériennes pour capturer les sous-populations exprimant la fusion à des degrés divers, couplé à l’analyse ARN-Seq pourrait éclairer les changements importants du génome dans le transcriptome. Prenez soin lorsque vous travaillez avec la formaline car elle est cancérigène et peut causer une irritation de la peau, des réactions allergiques ou des lésions oculaires lors d’une exposition directe. Générer des dérivés mutants de souches transportant des reporters fluorescents d’intérêt peut aider à révéler la base génétique des modèles de régulation spatiale observés.