Assemblage des navettes moléculaires propulsés par réversiblement attaché kinésines
26 janvier 2019
Nous présentons un protocole pour construire des navettes moléculaires, où les protéines motrices kinésine adhère à la surface de propulsent marqué au colorant de microtubules. Les interactions faibles des kinésines avec la surface permet leur fixation réversible pour elle. Cela crée un système d’échelle nanométrique qui présente l’assembly dynamique et le démontage de ses composants tout en conservant sa fonctionnalité.
Ce protocole est significatif parce qu’il ouvre la porte à une étude plus approfondie dans la conception de systèmes biologiques à l’échelle nanométrique qui sont en équilibre dynamique. Cette technique comble une partie de l’écart entre les structures techniques et naturelles, car elle permet l’étude de ce que nous pourrions appeler, l’auto-guérison ou le remplacement dynamique des composants moléculaires. Le conseil le plus important pour essayer cette technique pour la première fois est de s’assurer que l’expérimentateur suit tous les protocoles de sécurité.
Tout d’abord, préparer les solutions de stock telles qu’décrites dans le protocole de texte. Pipette 21,8 microlitres de BRB80 Buffer dans un petit tube de micro centrifugeuse. Ajoutez 1 microlitre de la solution de stock de chlorure de magnésium, 1 microlitre de la solution de stock GTP et 1,2 microlitres de la solution de stock DMSO pour terminer la préparation du tampon de croissance des microtubules.
Pour commencer la polymérisation des microtubules, ajoutez 6,25 microlitres de tampon de croissance de microtubules directement dans un aliquot de 20 microgrammes de tubuline lyophilisée; Vortex à 40 RPS pendant 5 secondes. Laisser refroidir l’aliquot sur la glace pendant 5 minutes.
Puis, incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Pour commencer la stabilisation des microtubules, ajoutez 5 microlitres de la solution paclitaxel aliquoted à 490 microlitres de tampon BRB80. Vortex la solution à 30 RPS pendant 10 secondes.
Une fois que les 45 minutes d’incubation des microtubules sont en place, ajouter 5 microlitres de cette solution au mélange BRB80, et paclitaxel, pour créer la solution MT100. Tout d’abord, ajouter 9,0 microlitres de la solution de caséine aliquoted à 291 microlitres de tampon BRB80. Pipette 83 microlitres de la solution de caséine BRB80 dans un nouveau tube de micro centrifugeuse de 6 millilitres.
Ajouter 1 microlitre de D-glucose, oxidase de glucose, catalase, TNT, phosphate de créatine, et phosphokinase. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de la solution ATP stock à la solution de motilité. Feuilletez, ou vortex l’aliquot pour répartir homogènement les produits chimiques.
Ensuite, ajoutez 1 microlitre de solution de kinésine préparée à la solution de motilité, de sorte que la concentration finale est de 20 nanomolaires. Ajoutez 10 microlitres de la solution MT100 à la solution de motilité. Pour les cellules d’écoulement, utilisez à la fois un grand coverslip et un petit coverslip.
Rincer tous les coverslips deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec de l’eau ultrapure. Sonicate les coverslips lavés dans l’eau ultrapure pendant 5 minutes. Ensuite, séchez les couvercles dans un four à une température comprise entre 50 et 75 degrés Celsius.
Utilisez un nettoyant uv-ozone pour traiter un côté de chaque glissement pendant 15 minutes à température ambiante et dans des conditions atmosphériques normales. À l’aide d’une pince à épiler, retourner chaque glissement et utiliser l’ozone UV pour traiter le côté non traité. Sonicate les coverslips traités dans l’eau ultrapure pendant 5 minutes.
Ensuite, séchez-les dans un four à une température comprise entre 50 et 75 degrés Celsius. Ensuite, enz l’équipement de protection tel que décrit dans le protocole de texte. Plongez chaque coverslip dans une solution saline pendant 15 secondes.
Laver les coverslips deux fois en toluène et trois fois en méthanol. Utilisez de l’azote pressurisé pour sécher les couvercles. Une fois que les coverslips sont secs, couper un morceau de ruban adhésif à double face qui est de 2 centimètres par 2,5 centimètres.
Couper cette pièce en deux verticalement en deux bandes de 1 centimètre par 2,5 centimètres. Mettez le grand coverslip sur un essuie-glace de tâche délicat et collez les bandes de bande à elle, longueur-sage le long des bords pour créer une zone de 1 centimètre par 2.5 centimètre entre les morceaux de bande. Coller le petit coverslip sur le dessus des bandes de ruban pour terminer l’assemblage de la cellule d’écoulement.
Tout d’abord, écoulez environ 20 microlitres de la solution PEG-PPG-PEG dans la cellule d’écoulement assemblée. Laissez la solution absorber à la surface pendant 5 minutes, puis, échanger cette solution avec 20 microlitres de tampon BRB80 trois fois en faisant circuler le tampon. Écoulez 20 microlitres de la solution de motilité dans la cellule d’écoulement.
Après cela, sceller les bords de la cellule d’écoulement avec de la graisse pour éviter l’évaporation si l’expérience prévue est plus longue qu’une heure. Effectuez l’imagerie à l’aide d’une microscopie interne totale de florescence de type objectif. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif.
Ensuite, placez la cellule d’écoulement sur la plate-forme du microscope. Et amener l’objectif jusqu’à ce qu’il y ait un contact entre l’huile sur l’objectif et la cellule d’écoulement. Utilisez le système de couverture antiblocage du microscope pour empêcher toute lumière laser de s’échapper.
Ensuite, allumez le laser et concentrez-vous sur la surface inférieure de la cellule d’écoulement à l’aide d’un laser de 642 nanomètres pour imager les microtubules, et d’un laser de 488 nanomètres pour imager les moteurs de kinésine GFP. Enregistrez les images ou vidéos d’intérêt. Les images peuvent être enregistrées aussi longtemps qu’il y a motilité dans la cellule d’écoulement.
Dans cette étude, un système nanométrique actif, qui auto-assemble des blocs de construction faiblement contraignants pour construire sa propre piste, est présenté. À l’aide de la microscopie tirf, les microtubules glissants sont imagent séparément des moteurs kinésine. Les microtubules sont visibles lors de l’excitation avec un laser de 647 nanomètres.
Et la kinésine GFP sont visibles lorsqu’elle est excitée par un laser de 488 nanomètres. Le temps entre l’excitation et le feu rouge et vert était de moins d’une seconde. Comme on peut le voir, les microtubules planants accumulent les moteurs de kinésine de la solution et les déposent à la surface.
Les moteurs kinésine restent dans le sillage des microtubules pendant une courte période de temps avant de revenir à la solution. Il est très important d’avoir la concentration correcte de reagents dans l’antifade de la solution de motilité, sinon, le blanchiment photo provoquerait l’échec de l’expérience. Cette technique ouvre la voie à une utilisation plus efficace des moteurs protéiques dans les systèmes d’ingénierie à l’échelle nanométrique.
Ainsi, permettant la conception et l’étude de nanostructures plus complexes.
Aperçu
Cette étude présente un protocole pour la construction de navettes moléculaires utilisant des protéines motrices kinésines afin de propulser des microtubules marqués par un colorant. Le système permet un assemblage et un désassemblage dynamiques tout en conservant la fonctionnalité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biophysique
- Nanotechnologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les transporteurs moléculaires sont essentiels à la compréhension des systèmes biologiques à l'échelle nanométrique.
- Les moteurs kinésine facilitent le déplacement des microtubules lors des processus cellulaires.
- L'équilibre dynamique dans les systèmes à l'échelle nanométrique peut conférer des propriétés d'auto-réparation.
- Les protocoles de sécurité sont cruciaux pour la réalisation d'expériences impliquant ces composants.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour étudier les systèmes à l'échelle nanométrique en équilibre dynamique.
- Combler le fossé entre les structures biologiques conçues et celles d'origine naturelle.
- Explorer l'auto-assemblage et la motilité des microtubules propulsés par des moteurs kinésine.
Méthodes utilisées
- Préparation du tampon de croissance des microtubules et des solutions de stabilisation.
- Assemblage de cellules d'écoulement à l'aide de lamelles traitées.
- Acquisition d'images par microscopie de fluorescence par réflexion totale.
- Enregistrement de la motilité des microtubules et des moteurs kinésine.
Résultats principaux
- Les microtubules ont été correctement imagés et se sont révélés accumuler des moteurs kinésines.
- Le système a démontré un assemblage et un désassemblage dynamiques des composants.
- Des concentrations adéquates de réactifs étaient essentielles pour éviter le photoblanchiment.
- La technique permet la conception de nanostructures plus complexes.
Conclusions
- Ce protocole facilite l'étude de systèmes à l'échelle nanométrique dotés de propriétés dynamiques.
- Il améliore la compréhension des interactions moléculaires dans les systèmes conçus.
- Les résultats ouvrent la voie à de futures recherches en nanotechnologie et en biophysique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet l'étude de systèmes dynamiques à l'échelle nanométrique dans lesquels des composants moléculaires s'assemblent et se désassemblent à l'équilibre, offrant un modèle pour la réduction des risques mécanistiques lors de la validation précoce des cibles. En imitant le transport biologique à l'aide de protéines motrices fixées de manière réversible, il assure une confiance prédictive dans les tests de criblage nécessitant une mobilité soutenue et reproductible. Le système fournit une plateforme pertinente pour évaluer l'effet des composés sur la dynamique du cytosquelette sans immobilisation permanente.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la fonction des protéines motrices et des dynamiques d'interaction avec les microtubules dans des conditions proches des conditions physiologiques.
- Valeur opérationnelle : Permet l'assemblage réversible et renouvelable de complexes actifs pour des cycles de tests répétés.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une mesure quantitative du glissement des microtubules et du recrutement des moteurs par microscopie TIRF.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection en temps réel, basée sur des marqueurs, des protéines de cargaison et des protéines motrices dans le même essai.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Modélise les mécanismes de transport cytosquelettique liés aux voies des maladies neurodégénératives et prolifératives.
- Valeur opérationnelle : Permet d’évaluer les modifications induites par des composés sur la motilité et la cinétique de dissociation des moteurs moléculaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où l'engagement de la cible et les mesures fonctionnelles sont prioritaires avant l'optimisation du candidat médicament.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant les interactions moteur-cargo et la modulation des voies.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives reproductibles de la mobilité, essentielles pour la validation des résultats positifs.
- Analyse : Permet de corréler le temps de séjour du moteur à la surface avec la vitesse des microtubules et la longueur de parcours.
- Recherche translationnelle : Établit un lien avec des modèles précliniques de défauts du transport axonal grâce à des lectures fonctionnelles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme modulaire pour tester diverses protéines motrices ou composés associés aux microtubules.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en dissociant la liaison motrice de l'attachement permanent à la surface.
- Valeur opérationnelle : Assure la stabilité du test grâce au réapprovisionnement continu des moteurs actifs en solution.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données fonctionnelles dynamiques fondées sur l'équilibre.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles impliquées dans les voies de transport intracellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en purification des protéines, manipulation des microtubules et microscopie par fluorescence en incidence rasante (TIRF).
- Dépend de l'accès à des microscopes à fluorescence équipés d'une excitation double laser et d'un contrôle environnemental.
- Exige une passivation standardisée des surfaces et un assemblage soigneux des cellules d'écoulement afin de minimiser les liaisons non spécifiques.
- Implique l'optimisation des concentrations des moteurs moléculaires et des microtubules pour maintenir un équilibre dynamique.
- Est limité par les risques de photodégradation si les réactifs antifade ne sont pas formulés avec précision.
