Sidérophore High-throughput Screening d’échantillons environnementaux : planter la rhizosphère sols, sols en vrac et tissus

Lesrophores latéraux sont de faible poids moléculaire, les biomolécules métalliques impliquées dans le cycle du fer dans l’environnement. Ce protocole permet une évaluation rapide à haut débit de l’activité du siderophore dans les échantillons de sol et de plantes. Les méthodes antérieures de détection des siderophores ont éliminé l’environnement crucial de la communauté microbienne.

Notre technique permet la détection au sein de la communauté microbienne relativement intacte et de l’habitat dans lequel elle s’est impliquée. Étant donné que la disponibilité du fer est cruciale pour la productivité agricole, ce protocole pourrait donc être utilisé pour étudier le rôle des microbes dans la modulation de la disponibilité du fer pour les plantes. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour évaluer l’impact des pratiques de gestion agricole sur la santé des sols et les collectivités productrices de siderophore, ainsi que sur le développement de ces collectivités au fil du temps.

Pour commencer, l’acide laver toute la verrerie dans 100 millimolar hydrochlorique 100 millimolar acide nitrique pendant un minimum de deux heures avant l’utilisation dans l’essai CAS. Préparer un moule en aluminium rempli de sable de laboratoire et le couvrir de papier d’aluminium. Autoclave à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes et réserver.

Préparez HDTMA en ajoutant 0365 grammes à 20 millilitres d’eau double déionisée, et placez la solution dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour favoriser la solubilisation. Ajouter 0302 grammes de CAS à 25 millilitres d’eau double déionisée tout en remuant doucement à l’aide d’une barre magnétique stérile. Ajouter ensuite cinq millilitres d’un hexahydrate de chlorure de fer molaire aux 25 millilitres de solution CAS tout en continuant à remuer doucement.

Maintenant, ajoutez lentement les 20 millilitres de solution HDTMA dans la solution complexe cas de fer tout en remuant doucement. Préparer la solution tampon en dissolvant 15,12 grammes de PIPES en 375 millilitres d’eau double déionisée en remuant doucement. Réglez le pH à 6,8 avec cinq hydroxyde de sodium molaire.

Ajouter ensuite de l’eau pour porter le volume à 450 millilitres. Maintenant, ajoutez cinq grammes d’agarose à la solution. Autoclavez la solution tampon PIPES et la solution complexe cas de fer à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ajouter soigneusement l’intégralité de la solution complexe cas de fer à l’ensemble du tampon PIPES dans l’armoire de biosécurité après chacun d’eux a été autoclavé. Placez la solution mixte dans un bain d’eau à 50 degrés Celsius. Placez maintenant un bateau reagent stérile dans le sable stérile dans l’armoire de biosécurité et chauffez à 50 degrés Celsius.

Transférez l’agar complexe cas de fer sur le bateau, puis aliquot rapidement 100 microlitres à chaque puits d’une microplaque stérile claire à fond plat de 96 puits. Préparer 800 micromolaires de la norme de pyoverdine dans un milieu M9 modifié préalablement préparé. Diluer la solution en 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 solutions micromolaires.

Ajouter EDTA à 500 millilitres de milieu M9 modifié précédemment préparé pour préparer la norme EDTA de 3,2 millimlaires. Diluer cette solution en solutions 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 micromolaires. Pour générer une courbe standard, ajouter 100 microlitres de chaque concentration de pyoverdine et d’EDTA pour séparer les puits d’une microplaque de 96 puits contenant 100 microlitres de milieu d’agar complexe cas de fer.

Faites des réplications techniques en double de chaque concentration. Ajoutez également des puits vierges avec seulement M9. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorption après une, six et 24 heures d’incubation à 22 degrés Celsius, et utilisez des mesures d’absorption pour générer des courbes standard. Lavez l’équipement d’échantillonnage avec de l’eau double déionisée à filtre de 22 microns suivie d'70 % d’éthanol et essuyez-la avec des serviettes en papier.

Effectuez le lavage avant l’échantillonnage et entre les échantillons afin de maintenir une technique stérile et de réduire la contamination croisée. Après avoir excisé les tissus végétaux et excavé une petite boule de racine des plantes sur le terrain, placez la boule de racine dans un sac en plastique étiqueté séparé pour la séparation de l’échantillon dans l’environnement de laboratoire. Placez tous les échantillons directement sur la glace et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les échantillons soient traités pour l’analyse de production du siderophore.

Séparez les échantillons de sol associés aux racines dans le sol rhizosphère en vrac et lâchement lié et le sol rhizosphère étroitement lié. Pour ce faire, retirez les boules de racine des sacs et secouez doucement le sol de la boule de racine. Secoué du sol, avec le sol laissé dans le sac, comprennent le sol en vrac.

C’est le sol rhizosphère vaguement lié. Générer un sol rhizopshere étroitement lié en prenant des racines avec l’échantillon étroitement lié et en les mettant dans un tube de centrifugeuse. Ajouter 30 millilitres d’eau double déionisée et de vortex pendant deux à trois minutes.

Enlevez les racines pour obtenir la dilution étroitement liée de boue de sol de rhizosphère. Homogénéiser chaque échantillon de sol dans le sac d’échantillon en mélangeant et en tournant le sol autant que possible sans ouvrir le sac. Une fois que chaque échantillon a été complètement mélangé, aliquot et suspendre deux grammes de chaque échantillon de sol dans 20 millilitres de milieu M9 modifié dans un tube stérile centrifugeuse de 50 millilitres.

Diluer l’échantillon, puis sceller le tube avec un bouchon de mousse stérile pour permettre l’aération. Pour les échantillons de rhizosphère étroitement liés, ajouter deux millilitres de boue de sol rhizosphère à 20 millilitres de milieu M9 modifié dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres. Diluer l’échantillon, puis sceller le tube avec un bouchon de mousse stérile pour permettre l’aération.

Pour préparer l’échantillon de tissu, la surface stérilise la racine, la pousse et le grain avec 70 % d’éthanol. Macérer deux grammes de tissu frais en 20 millilitres de milieu M9 modifié à l’aide d’un mélangeur à haute hauteur pendant 30 secondes. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres, diluez et scellez le tube avec un bouchon de mousse stérile.

Pour enrichir la production de siderophore par limitation du fer, incuber les tubes de centrifugeuse de 50 millilitres à température ambiante et secouer à 160 RPM. À 24, 48 et 72 heures après le début de la culture d’enrichissement, retirez un millilitre de sous-humides des tubes d’enrichissement en utilisant une technique stérile. Centrifugez les sous-humides à 10 000 fois G pendant une minute dans deux tubes de centrifugeuse millilitre pour pelleter les cellules.

À l’aide d’une technique stérile, ajouter 100 microlitres du supernatant à une solution de 100 microlitres d’agar complexe cas en fer en double ou en triplicate dans la microplaque. Ajoutez également 100 microlitres de milieu M9 stérile sous forme de blancs. Puis incuber la plaque à 28 degrés Celsius.

Chaque plaque doit être scellée et recouverte de papier d’aluminium avant d’être mise en place dans l’incubateur. Suspendre le reste du supernatant et des granulés pour chaque échantillon dans son propre tube stérile de centrifugeuse de deux millilitres. Ajouter 400 microlitres de glycérol stérile dans chaque tube de supernatant de l’échantillon et suspendre à nouveau la pastille pour créer des stocks de glycérol.

Congeler le stock à moins 80 degrés Celsius pour une analyse ultérieure. Mesurez l’absorption à six, 24, 48 et 72 heures à une longueur d’onde de 420 nanomètres. Un mélange de pyoverdine biosynthétisé par Pseudomonas fluorescens a été utilisé comme norme pour interpréter et quantifier l’absorption d’échantillons dans des échantillons d’équivalence de pyoverdine en micromolaire.

La relation entre l’absorption à 420 nanomètres et la concentration de départ de pyoverdine est montrée ici. L’activité de siderophore de l’enrichissement de 72 heures a été évaluée à 48 heures d’incubation pour déterminer l’influence du génotype et du type d’échantillon sur l’isolement de siderophore. L’activité du siderophore dans les échantillons de sol en vrac était relativement faible et ne présente pas de différences entre le génotype de blé à partir duquel le sol en vrac a été échantillonné.

Cependant, les enrichissements du sol lâchement lié isolé du génotype 725 ont montré une plus grande production de siderophore par rapport au sol lâchement lié de Madsen et 727 mais pas de Lewjain. Inversement, la production de siderophore dans les enrichissements du sol étroitement lié n’a pas été fortement influencée par le génotype. Les cultures d’enrichissement des tissus céréaliers ont donné une production relativement faible de siderophore indépendamment du génotype.

Les enrichissements du tissu de pousse de Lewjain ont eu la production sensiblement inférieure de siderophore que les autres génotypes, et 725 cultures de tissu de pousse ont eu comme conséquence la production plus variable de siderophore. La plus grande différence dans l’activité de siderophore a été observée dans les cultures d’enrichissement de tissu de racine où 725 ont eu plus de 200% plus grande activité de siderophore que tous les autres génotypes. L’un des aspects les plus taxants de l’exécution du protocole est le maintien de conditions aseptiques tout en complétant les nombreuses étapes pour générer la microplaque d’agar de fer cas et des échantillons d’essai pour l’activité siderophore.

Un large éventail de techniques chromatographiques basées sur la culture ou l’ADN peuvent être appliquées soit au puits de microtiter réel, soit à la culture conservée au glycérol pour d’autres tests biochimiques ou à la caractérisation génétique et à la modélisation métabolique. En utilisant ce protocole, l’activité du siderophore peut plus tard être liée à des organismes spécifiques responsables de cette activité ou par la suite ciblés comme mécanisme pour des impacts écologiques plus importants. Ce protocole pourrait facilement être modifié pour évaluer la production de siderophore dans les cultures d’enrichissement générées à partir d’échantillons prélevés dans d’autres compartiments environnementaux, y compris l’air, l’eau et les sédiments.