Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Le rapport principal est vraiment l’importance de souligner avec précision la région de fréquence spécifique de la membrane basilaire dans la plupart des modèles, où les nombres de synapse modifiés et la fonction peuvent être analysées. La localisation cochléaire des régions de fréquences spécifiques est effectuée de manière fiable à l’aide de cartes de fréquences de lieu en conjonction avec les données cochléogrammes. Le microscope donne un aperçu de plusieurs études de recherche.

Il soutient l’idée que la neuropathie cochléaire est les événements initiaux primaires précédant spécifiquement la perte d’audition, l’acouphène, et l’hyperacusis. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement d’orteil dans une souris mâle adulte de huit semaines anesthésiée de huit semaines C57 noire 6J. Placez la souris sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius dans une pièce électriquement et acoustiquement blindée.

Ensuite, placez une électrode d’enregistrement d’aiguille sous-dermique de 20 millimètres de calibre 28, avec la profondeur de trois millimètres sous la peau au sommet du crâne. Une électrode de référence dans la région parotide ipsilateral, au-dessous de la pinna de l’oreille mesurée et d’une électrode moulue dans la région parotide contralatérale. Placez un haut-parleur de champ fermé équipé d’un tube en plastique de deux centimètres avec une pointe en forme de cône à côté de la souris et placez la pointe dans le conduit auditif externe.

Pour une réponse auditive du tronc cérébral, ou enregistrement ABR, générer des pépins de tonalité à des niveaux de pression sonore décroissants de 90 à 10 décibels, en cinq à 10 décibels étapes de niveau de pression sonore. Au cours de cette étape, les réponses sont amplifiées, filtrées et moyennes. À chaque fréquence, déterminez le seuil ABR, qui est le niveau minimal de pression sonore qui se traduit par un enregistrement ABR fiable avec une ou plusieurs ondes distinguables qui peuvent être clairement identifiées par inspection visuelle.

Après l’enregistrement ABR, exposer le bulla du côté ventral et ouvrir le bulla avec des ciseaux pointus pour accéder à la cochlée. À l’aide de forceps fins, enlever les os temporels et couper l’artère des stapes. Retirez ensuite les stapes de la fenêtre ovale et rompez la membrane de la fenêtre ronde.

Faites pivoter doucement la pointe d’une aiguille de calibre 27 de 13 millimètres pour faire un petit trou au sommet de la cochlée, avant d’utiliser une pipette fine à pointe pour rincer doucement 4% de paraformaldéhyde à travers la fenêtre dans les espaces périlymphatiques. Ensuite, rincez les os trois fois pendant cinq minutes par lavage avec du PBS frais et froid de 0,1 molaire par lavage. Suivi de la décalcification des os avec 10%EDTA pendant quatre heures à température ambiante et 20 rotations par minute sur un shaker horizontal.

À la fin de l’incubation, transférer un os temporel décalcifié en PBS molaire frais de 0,1 molar sous un microscope dissectant. Utilisez 3 et 5 forceps Dumont et une aiguille de calibre 27 pour disséquer à leur tour les régions cochlées apical, moyennes et basales. Utilisez une lame de rasoir pour faire une petite série de coupures le long du ligament spirale et enlever la membrane tectoriale et la membrane de Reissner.

Disséquer davantage l’épithélium auditif restant, y compris le limbe en spirale, en virages cochléaires individuels pour des préparations entières de montage. Ensuite, utilisez l’objectif d’huile 40X d’un microscope léger pour mesurer la longueur de la membrane basilaire avec l’échelle de 250 micromètres placée dans le morceau d’oeil. Il peut être ajusté le long de la stéréocilia des cellules cils intérieures.

Après la dissection, placez chaque tour cochléaire en tubes de centrifugeuse individuels de 2,5 millilitres. Bloquez toute liaison non spécifique avec 10% de sérum de chèvre en PBS en 0,1%Triton X-100 pendant une heure à température ambiante sur un rotateur. À la fin de l’incubation, utilisez la pointe de pipette de 200 microlitres pour enlever la solution au microscope à dissection.

Incuber les spécimens avec les anticorps primaires d’intérêt dilués dans 5% sérum de chèvre et PBS dans 0,1%Triton X-100 pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un rotateur. Le lendemain matin, rincez les échantillons de tissus trois fois pendant cinq minutes avec du PBS molaire froid de 0,1 par lavage pour enlever tout anticorps primaire résiduel. Ensuite, étiquetez les spécimens avec les anticorps secondaires appropriés dilués dans 5% sérum de chèvre dans PBS dans 0,1%Triton X-100 pendant deux à trois heures à température ambiante sur le rotateur, protégé de la lumière.

À la fin de l’incubation, lavez les échantillons trois fois avec 0,1 PBS molaire tel que démontré et transférez les spécimens dans des plaques individuelles de 35 millimètres contenant 0,1 molaire PBS. Placez une goutte de milieu de montage complété par DAPI sur la lame et transférez les spécimens de PBS au milieu de montage. Placez un bord d’un couvercle glisser sur chaque glissière et relâchez pour laisser le couvercle glisser doucement.

Ensuite, séchez les glissières dans une boîte à glissière à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’image des spécimens, utilisez un microscope confocal avec les lasers appropriés et 63X lentille d’immersion d’huile haute résolution pour acquérir huit micromètres confocal Z piles de chaque tour cochléaire. Pour les comptes de ponction synaptique, réglez les piles Z avec la taille de l’étape de 0,3 micromètre pour couvrir toute la longueur des cellules cils intérieures, en assurant que toutes les ponctions synaptiques peuvent être photographiées et fusionner la ponction contenant des images dans une pile Z pour obtenir la projection d’accès Z.

Importez les images fusionnées dans un logiciel de traitement d’image approprié. Divisez le nombre total synaptique dans chaque pile Z à des régions de fréquence spécifiques par le nombre de cellules cils intérieures positives DAPI pour calculer le nombre de ponctions synaptiques pour chaque cellule. À chaque région de fréquence spécifique, la moyenne de toutes les ponctions synaptiques dans trois images de différents champs microscopiques, contenant neuf à 11 cellules cils intérieures.

Pour mieux visualiser l’architecture cytosquelettique et la localisation synaptique, utilisez l’outil brosse pour évaluer visuellement la structure synaptique et la distribution des cellules cils intérieures individuelles. Pour inspecter la juxtaposition de rubans présynaptiques et de timbres récepteurs postsynaptiques, utilisez l’outil rectangulaire de chapiteau extraire l’espace voxel autour des rubans et utiliser la coupe d’image pour isoler les rubans individuels. Cliquez ensuite sur la taille de l’image et de l’image pour acquérir un tableau miniature de ces projections miniatures qui peuvent être utilisées pour identifier les synapses appariées par rapport aux rubans orphelins.

Les dix souris de cette expérience représentative présentaient des seuils ABR en réponse à des éclats de tonalité allant de 25 à 70 décibels par niveau de pression sonore selon la fréquence du stimulus. Le seuil auditif de cette expérience était le plus bas à 16 kilohertz correspondant à environ 43 % de la distance par rapport à l’apex cochléaire, ce qui suggère que la sensibilité acoustique est considérablement réduite dans d’autres régions cochléaires. Les montures entières de l’épithélium auditif sont disséquées en trois morceaux et les longueurs sont mesurées et converties en leur pourcentage de distance par rapport à l’apex cochléaire.

L’emplacement de fréquence sur la membrane basilaire de chaque tour cochléaire est calculé à l’aide de la fonction logarithmique. Dans les oreilles normales des souris adultes, l’immunostaining révèle des paires juxtaposées de rubans synaptiques et de patchs récepteurs du glutamate. Étude de la surface de la membrane basolateral des cellules cils intérieures, avec huit à 20 paires par cellule.

Bien que la grande majorité des ponctions apparaissent comme des paires juxtaposées dans les oreilles normales, les rubans orphelins sont rarement observés à des grossissements élevés. Le nombre de synapses intérieures de ruban de cellules de cheveux est le plus élevé à la région de 16 kilohertz et diminue sensiblement pendant que la distance de cet endroit augmente. La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est qu’il faut garantir l’intégrité de la membrane basale cochléaire.

Nous devons insister sur l’exactitude jusqu’à ce que la compétence technique soit atteinte. Après cette procédure, la thérapie génique peut être effectuée pour répondre si la neuropathie cochléaire peut être réparée par cette mesure. Cette mesure est la technique plus large pour explorer la neuropathie cochléaire, qui si les événements initiaux primaires associent à avoir la perte d’audition, l’acouphène, et l’hyperacusis.