Name: Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez une méthode polyvalente de contrôle conditionnel de l'expression génique endogène in vivo utilisant les systèmes lac et tet. Cette approche permet d'étudier la fonction des gènes de manière réversible et dose-dépendante.

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Nous remercions la fin Dr Heidi Scrable pour son généreux don de la construction de gène lacI mammifères (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, France) pour la fourniture du promoteur Villin et Dr Laurie Jackson-Grusby (hôpital pour enfants, Boston, MA) pour sa contribution aux premiers stades du développement de cette technologie. Nous sommes reconnaissants pour le Dr Nancy Wu et Dr Robert Maxson pour leur aide dans la création de souris transgéniques et knock-out. Nous remercions les membres du laboratoire Laird des discussions utiles et soutien. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [R01 CA75090 DA030325 R01, R01 CA157918 et R01 CA212374 à P.W.L. et 1F31CA213897-01 a 1 à N.A.V.S].

PWL sert des conseils consultatifs scientifiques de AnchorDx et de Progenity, Inc.

Une étape cruciale et limitation potentielle du système de contrôle à distance est le défi associé à l’insertion du répresseur et/ou sites de liaison activateur sans affecter l’expression des gènes cibles. Notre approche originale de la répression, telle qu’appliquée au gène Dnmt1 , impliqué d’insertion des sites de liaison du répresseur lac au sein des régions transcriptionnellement critiques d’un promoteur. Afin de réduire le risque d’affecter les fonctions de promoteur et ainsi améliorer l’applicabilité générale du système de contrôle à distance, nous avons développé une approche axée sur l’intron de répression. La puissance de notre système amélioré de lac nous a permis de réprimer fermement la transcription de tous les promoteurs fortes nous avons testé à opérateurs situés plusieurs centaines à plusieurs kilobases en aval de la transcription démarrer sites (Figure 3A à C) 10. ce qui est important, les niveaux de répression étaient indépendantes des forces transcriptionnelles des promoteurs (Figure 3A – C)10. Ceci suggère que la capacité de répression de notre système de répression axées sur l’intron dépasse la résistance transcriptionnelle des promoteurs testés. Dans cette approche axée sur les introns, il est probable que la répression est véhiculée par des interférences physiques entre deux composants, le mécanisme d’allongement de transcription et le lac répresseurs57. Ce mécanisme simple de répression et la solidité démontrée de la méthode axée sur les introns peuvent rendre cette approche généralement applicables aux organismes, des tissus et des gènes différents.
La régulation par le système de contrôle à distance nécessite les séquences de liaison transactivateur en proximité avec le promoteur du gène cible, qui entraîne un risque d’affecter les fonctions de promoteur. Cependant, nous avons constaté que la position des séquences de liaison peut être à l’extérieur de la région transcriptionnellement critique. Promoteurs fois Dnmt1 et EF1α ont été solidement sur-exprimés de tet opérateurs situé quelques centaines de bases en amont de la transcription de sites début10. Cette contrainte détendue réduit considérablement le risque d’affecter la fonction de promoteur d’un gène cible en l’absence de la transactivateur. Séquences d’augmenter le nombre de liaison et/ou de l’utilisation des activateurs trans plus forts pourrait aider à réduire davantage les risques en permettant l’augmentation des sites loin du site d’initiation de la transcription.
Notre système de contrôle à distance permet de contrôler élégant le niveau, moment et lieu de l’expression des gènes endogènes, permettant de tester la réversibilité d’un phénotype et les conséquences des niveaux d’expression différents, qui ne sont pas facilement réalisables par technologies actuelles de contrôle expression des gènes in vivo. Il est important de noter que dans la plupart des analyses expression génique, y compris la nôtre, les valeurs de l’expression représentent la moyenne d’une population de cellules parmi lesquels se trouvent des variations considérables. Cette hétérogénéité peut influencer les processus décisionnels cellulaires, tels que la différenciation ou apoptose58. Bien que probablement, la précision du contrôle d’expression de gène pourrait être encore améliorée par des circuits génétiques supplémentaires génie59, l’efficacité observée de notre système actuel permettra à enquête utile de la fonction des gènes dans de nombreux contextes biologiques. En outre, un haut degré de spécificité de cible est attendu en raison de la complexité des séquences opérateur ainsi que la grande distance évolutive entre les mammifères et les espèces originaires des éléments réglementaires60. En outre, lignées de souris transgéniques de répresseurs et activateurs peuvent être développées et employées pour n’importe quel gène endogène. Par exemple, les modèles souris transactivateur tet existants peuvent être adaptés pour accomplir la stimulation de l’expression d’un gène cible dans les tissus de souris désiré. Nous avons récemment développé une lignée transgénique qui permet de piloter robuste expression tissu-spécifique de notre répresseur lac améliorée dans plusieurs types de tissus lorsqu’il est combiné avec les lignes existantes de Cre en introduisant le gène lacIGY dans le locus Hipp11 48 sous le contrôle d’un élément de Lox-STOP-Lox (non publié). Cette ligne faciliterait considérablement l’application de tissu-spécifique du système de contrôle à distance.
Upregulation de gène par le système de contrôle à distance offre plusieurs avantages par rapport aux approches transgéniques inductibles actuelles. Il ne nécessite pas de génération de multiples lignées transgéniques pour tester les effets de position de l’insertion, car il utilise le locus endogène. En outre, cette approche est bien adaptée pour la stimulation de l’expression des gènes avec l’expression de base forte parce qu’elle favorise l’expression d’un promoteur déjà robuste, tandis que les modèles transgéniques conventionnels s’appuient sur des promoteurs viraux minimales. Enfin, le tissu spécificité, contrôle du cycle cellulaire et l’épissage de variantes d’un gène cible peuvent être conservés sur upregulation par notre approche, car il préserve des éléments de régulation naturelle comme innée cis-éléments de régulation. L’avènement de la technologie de ciblage de gène CRISPR/Cas-mediated facilitera grandement l’application de cette technologie dans des systèmes divers modèles.

Masquage génétique ou approches transgéniques ont été un moyen efficace pour étudier la fonction des gènes dans des modèles animaux. Cependant, régulation de l’expression de ces approches est dichotomique (marche/arrêt), non-temporelle et donc n’est pas capable de révéler le spectre fonctionnel complet d’un gène. Conditionnelle Cre/LoxP technologies ont permis l’inactivation spatio-temporelle ou activation de la fonction du gène, mais leur nature dichotomique continue à poser des limites, comme la létalité cellulaire et irréversibilité1,2 , 3. afin de combler ce manque, conditionnels knockdown approches ont été développées à l’aide de tet-régis Sharn ou miRNA4. Cependant, hors cible effets demeurent une préoccupation pour les Arni5 et ont été difficile à contrôler in vivo. Plus récemment, les technologies de contrôle transcriptionnel CRISPR/Cas-mediated ont introduit une approche plus souple pour réaliser aussi bien en amont et une diminution de l’expression des gènes endogènes et démontré leurs utilitaires6,7 . Cependant, l’efficacité du contrôle transcriptionnel CRISPR/Cas-mediated ignore encore in vivo et la réversibilité de répression axées sur le KRAB n’est toujours pas vue, aussi forte répression par KRAB et sa protéine d’interaction KAP1 a été montré pour induire permanente gene silencing8,9.
Afin de pallier ces lacunes, nous avons développé un nouveau système réglementaire transcriptionnel capable de contrôler sous certaines conditions l’expression des gènes endogènes en réversible et accordable manière chez la souris à l’aide d’ingénierie transcriptionnelle procaryote binaire les systèmes de réglementation10. Procaryotes binaires systèmes de régulation transcriptionnelles avec des ligands réglementaires, tels que le lac et tet, ont permis à ce réversible et expression accordable contrôler11,12,13, 14. Cependant, la puissance de répression insuffisante des systèmes binaires actuels a nui à leur adoption généralisée pour le contrôle de l’expression des gènes endogènes chez les mammifères. Nous avons développé un système de répression renforcée lac suffisamment puissant pour la répression des gènes endogènes et employé une stratégie novatrice de ciblage tet transcription activateurs directement au promoteur apparenté d’un gène endogène pour atteindre upregulation robuste (Figure 1)10. Avec cette technologie, nous avons atteint presque deux ordres de grandeur contrôle d’expression du gène endogène Dnmt1 dans une manière accordable, inductible et réversible10. Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour son application in vivo à d’autres gènes et les organismes en utilisant la souris comme une espèce de modèle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du système télécommande. La transcription d’un gène endogène cible peut être réglée à l’aide machiné lac répresseur et systèmes d’activateur de tet . Le promoteur du gène cible ou l’intron est conçu pour contenir des opérateurs pour le répresseur de LacIGY attachement intime et/ou la rtTA-M2 activator. R indique Repron (Repl intrsur), qui contient 12 exploitants lac symétrique (S) plus un intron de bêta-globine lapin partielle. T indique opérateur tet . Le répresseur et/ou l’activateur est/sont exprimés à partir d’un promoteur spécifique aux tissus. L’expression du gène cible peut alors réversiblement activera le niveau d’expression voulue par l’administration d’IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, un antagoniste de la LacIGY répresseur) ou Doxycycline (Dox). Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Avant de commencer le présent protocole, revue tableau 1 afin d’identifier les mesures pertinentes pour le contrôle souhaité de l’expression génique. Par exemple, pour une souris qui permet la diminution réversible du « Gène X » de l’ingénieur, remplissez les sections 1, 3 et 4 de la sous protocole. Le tableau 1 résume également les composants nécessaires du système de contrôle à distance.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Changement de l’Expression souhaitée</td>
			<td>Seulement la répression</td>
			<td>Activation seulement</td>
			<td>La répression et l’Activation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sections pertinentes du protocole</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Séquence de contrôle à distance nécessaire dans le gène cible</td>
			<td>Repron (« Intron de répression » ; 12 exploitants symétrique bac plus un intron de bêta-globine lapin partielle)</td>
			<td>Tet opérateur (s)</td>
			<td>Repron et Tet opérateur (s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emplacement de la séquence de contrôle à distance</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Promoteur</td>
			<td>Intron &amp; promoteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Activator/répresseur nécessaire pour le contrôle souhaité</td>
			<td>LacIGY répresseur</td>
			<td>rtTA-M2 Activator</td>
			<td>LacIGY répresseur et rtTA-M2 Activator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligands réglementaires</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>IPTG et/ou Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Vue d’ensemble des composants de contrôle à distance.

<table><tbody><tr><td>B6C3F1/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100010</td><td>https://www.jax.org/strain/100010</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>Haeussler et al. 2016</td><td></td><td>http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Régime alimentaire de souris contenant de la doxycycline</td><td>Envigo</td><td>Varie selon la concentration</td><td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td></tr> <tr><td>Base de données ENCODE,</td><td>Université</td><td></td> de Stanford <td>https://www.encodeproject.org/</td></tr> <tr><td>iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td><td>Addgene</td><td>65795</td><td>https://www.addgene.org/65795/</td></tr> <tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C</td><td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg</td></tr><tr><td>pGL3-Basic</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td></tr><tr><td>SVM-BPfinder</td><td>Regulatory Genomics, Université</td><td></td> Pompeu Fabra <td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td></tr> <tr><td>TiProD : Tissu promoteur spécifique Base de données</td><td>Département de bioinformatique, UMG,&nbsp ; Université de G&ouml ; Ttingen&nbsp ;</td><td></td><td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td>Université de Californie Santa Cruz</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr></tbody></table>

application in vivo de la système de télécommande pour la manipulation d’expression des gènes endogènes

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Nous décrivons ici un protocole d’application du régime de contrôle à distance (réversible Manipulation of Transcription locus Endogenous), qui permet de contrôler l’expression réversible et ajustable d’un systèmes de modèle endogène gène d’intérêt dans la vie. Le système de contrôle à distance emploie améliorée bac répression et tet systèmes d’activation pour atteindre le bas ou stimulation de l’expression d’un gène cible dans un système biologique unique. Répression serrée peut être atteint de répresseur accepteurs souple situé très en aval d’un site de début de transcription en inhibant l’élongation de la transcription. Upregulation robuste peut être atteint en améliorant la transcription d’un gène endogène en ciblant les activateurs transcriptional tet au promoteur apparenté. Ce contrôle de l’expression réversible et ajustable peut être appliqué et retiré à plusieurs reprises dans les organismes. La puissance et la polyvalence du système, comme l’a démontré pour endogène Dnmt1 ici, permettra aux plus précises analyses fonctionnelles in vivo en permettant l’étude de la fonction du gène à différents niveaux d’expression et en vérifiant la réversibilité d’un phénotype.

La capacité de répression du système télécommande a été démontrée dans deux approches différentes à ce jour. Dans la première approche, les sites de liaison pour le répresseur lac ont été insérés au promoteur du gène Dnmt1 endogène. Dans la deuxième approche, qui est recommandée par le présent protocole, les sites de liaison du répresseur furent insérées dans un intron en aval pour éviter le risque d’affecter les fonctions de promoteur de l’insertion et donc de simplifier l’application de la télécommande système. Les deux approches a abouti à la répression réussie (Figure 2A, B et la Figure 3 a-C)10. Dnmt1 expression est réprimée à 15 % des niveaux non réglementées en utilisant l’approche axée sur le promoteur (Figure 2A). Cette répression serrée a été renversée de manière dose-dépendante, en traitant des souris avec des quantités variables d’IPTG (Figure 2A). La répression Dnmt1 observée a été validée au niveau protéique par immunomarquage (Figure 2B). Nous n’avons pas observé une différence notable dans l’expression Dnmt1 entre Dnmt1+ / + et souris Dnmt1LO/LO , confirmant que notre insertion d’opérateur lac n'avait pas perturbés promoteur normal fonction10. L’approche axée sur l’intron atteint plus de répression de 90 % des opérateurs situés plusieurs kilobases en aval du site d’initiation de la transcription en atténuant la transcription élongation (Figure 3A, B)10. Cette approche axée sur l’intron a été encore validée sur sept promoteurs robustes supplémentaires (Figure 3C). Répression invariablement serrée a été réalisée à partir de tous les promoteurs testés. Aucune corrélation entre les niveaux d’expression résiduelle et les points forts des promoteurs a été observée, ce qui suggère que la capacité de répression de notre système de répression axées sur l’intron est supérieure à l’activité transcriptionnelle de tous les promoteurs robustes, nous avons testé () Figure 3 ( C).
La capacité de stimulation in vivo de l’expression du système télécommande a aussi été démontrée sur le gène Dnmt1 . Nous avons introduit deux copies de l’opérateur de tet dans le promoteur Dnmt1 , ainsi que des séquences d’opérateur lac , afin de permettre pour une augmentation ou diminution de l’expression selon laquelle effecteur protéine est présente. Upregulation robuste et une diminution d’expression Dnmt1 , à proximité de deux ordres de grandeur (10 % à 650 %), ont été réalisés dans ces contenant l’allèle de Dnmt1 endogène modifié (Dnmt1LGT) (Figure 4A)10 . Les deux règlements ont été entièrement réversibles et inductible par traitements IPTG et Dox, respectivement (Figure 4A). Ensuite, nous avons introduit la modification Dnmt1LGT dans la lignée germinale de souris pour tester la capacité de stimulation in vivo de l’expression du système de contrôle à distance. Forte augmentation de Dnmt1 a été observée de la foie, la rate et le rein, alors qu’aucun upregulation détectable au coeur a été observée (Figure 4B)7. Le modèle d’expression cycle cellulaire dépendante de Dnmt1 et la rareté des cellules prolifératives au coeur pourraient expliquer cette observation10,56. Il reste à savoir si cette restriction peut être surmontée en augmentant le niveau d’expression de l’activateur ou le nombre de ses sites de liaison.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figure 2 : In vivo répression de Dnmt1 par le répresseur LacIGY. Souris de la (A), avec bac opérateurs (LO), insérées dans le promoteur Dnmt1 , avec ou sans expression de LacIGY, ont été traitées avec des doses différentes d’IPTG. analyse qRT-PCR de Dnmt1 expression montre l’inversion dose-dépendante de la répression Dnmt1 in vivo par le traitement de l’IPTG. Chaque barre représente les données d’une autre souris. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining des protéine Dnmt1 dans des cryptes coliques de souris fourni l’eau potable avec ou sans 160 mM IPTG pendant 3 semaines. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figure 3 : In vivo et répression in vitro de différents promoteurs par le système de contrôle à distance. (A), une première version de la séquence Repron (R *) a été inséré dans un intron en aval du promoteur Villin dans une souris transgénique Villin-mKate2 (VilmKate2). qRT-PCR analyse d’expression de mKate2 dans l’intestin des souris avec ou sans le répresseur LacIGY est montré. Chaque barre représente les données d’une autre souris. (B) mKate2 confocale images de l’intestin grêle avec et sans expression de LacIGY . (C) Six opérateurs de lac symétrique (S) ont été insérés entre les divers promoteurs et un reporter de la luciférase. Reporters (50 ng par puits en plaque 96 puits) et plasmides répresseur transitoirement ont été introduits de NIH/3 t 3 cellules dans un rapport molaire de 1:1. Luciférase valeurs ont été mises en recouvrement 24h après la transfection. Ces données in vitro représentent le pourcentage d’expression de la luciférase dans LacIGY-exprimant des cellules par rapport à celles exprimant non-fonctionnel LacI (NFlacI). Tests T ont servi à déterminer la signification statistique. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figure 4 : Down - et/ou upregulation de Dnmt1 expression in vitro et in vivo. (A) le système de contrôle à distance complet a été conçu dans ces cultivés par des approches de ciblage et électroporation de gène. Répression maximale d’expression Dnmt1 a été obtenue sans traitement alors que l’activation maximale a été obtenue par traitement des IPTG et Dox. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch t-tests). (B) activation In vivo des Dnmt1 par le système de contrôle à distance, tel que démontré par immunomarquage de protéine Dnmt1 dans divers tissus de souris de contrôle à distance. L’allèle LGT représente modification promoteur de Dnmt1 pour contenir le lac opérateur et tet activateur accepteurs. Souris ont été traitées avec une alimentation normale ou Dox contenant (5 000 mg/kg Doxycycline Hyclate) pendant un mois. Ce chiffre a été modifié par Lee et al.,10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Supplémentaire Figure 1 : Exemple d’atterrissage touche insertion dans murin Dnmt1 intron 1. (A) représentation schématique du modèle de l’ADN pour atterrissage d’insertion de tampon, adaptée de Quadros et coll. (2015)31. Hétérotypiques loxP sites, JT15 et Lox2272, sont séparés par une séquence de l’espaceur court (sp) et flanqués de chaque côté de 60 pb d’ADN qui est homologue à la région génomique de la cible. (B) échantillon ADN modèle d’atterrissage touche insertion dans l’intron Dnmt1 utilisant le sgRNA suivant : CTAGTACCACTCCTGTACCG (qui s’adresse le brin arrière). La région intronic sélectionnée a été bioinformatically par étape 1.1, et le sgRNA a été identifié à l’aide de la CRISPOR29. (C) exemple de conception d’amorces PCR pour évaluer l’insertion de l’aire d’atterrissage. Amorces PCR ont été conçus à l’extérieur les bras de l’homologie du modèle pour confirmer l’intégration endogène Dnmt1. L’amplicon PCR de type sauvage est 213 bp ; lors de l’insertion, il devient 291 BP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour générer un modèle de système dans lequel la transcription d’un gène endogène d’intérêt peut être conditionnellement contrôlée dans les animaux vivants ou de cellules à l’aide d’activator, renforcée lac répresseur et tet .

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

L’importance de notre méthode est sa polyvalence et sa puissance. Il permet aux chercheurs d’avoir un contrôle solide sur l’expression des gènes endogènes d’une manière qui a été difficile à réaliser en utilisant les méthodes existantes. Il permet aux chercheurs d’étudier la fonction d’un gène à différents niveaux d’expression et d’une manière spatio-temporelle.Ainsi, il permet de tester la réversibilité d’un phénotype, qui est utile lors de l’étude des gènes liés à la maladie. Pour accomplir la répression, le gène cible intron est conçu pour contenir le repron R, qui contient 12 opérateurs symétriques de Lac. Lorsque le répresseur LacIGY est exprimé à partir du promoteur spécifique du tissu désiré, le gène cible est réprimé.La répression du gène cible peut être inversée ou ajustée au niveau d’expression désiré par l’administration d’IPTG, un antagoniste du répresseur LacIGY. Pour effectuer l’upregulation, le promoteur du gène cible est conçu pour contenir quatre opérateurs Tat ou plus, T, comme sites de liaison pour les activateurs rtTA-M2. Lorsque l’activateur est exprimé à partir du promoteur tissulaire désiré en présence de doxycycline, l’upregulation du gène cible est induite.L’upregulation du gène cible peut être inversée ou ajustée au niveau d’expression désiré en retirant ou en modifiant la concentration de doxycycline. Pour accomplir à la fois la répression et l’activation, les systèmes d’activateur Lac et Tat peuvent être combinés. Pour modifier le gène d’intérêt pour la répression, une intronisation transcriptionnellement inerte vers les cinq extrémités principales du gène d’intérêt doit être identifiée pour l’insertion de la séquence de repron.Pour obtenir la séquence génomique du gène d’intérêt, accédez au navigateur du génome de l’UCSC et sélectionnez le dernier brouillon du génome de la souris sous l’onglet génomes. Entrez le nom ou le symbole du gène d’intérêt dans la barre de recherche pour afficher les transcriptions du gène, puis cliquez sur aller. Ensuite, sélectionnez la variante de transcription souhaitée pour le gène d’intérêt et cliquez sur le symbole génétique à côté de la variante transcription d’intérêt.Ensuite, sous la séquence et les liens vers des outils et des bases de données bannière, cliquez sur le lien séquence génomique. Pour les options de récupération de séquence, sélectionnez uniquement les exons, les introns et le par défaut un enregistrement FASTA par gène. Pour les options de mise en forme de séquençage, sélectionnez les exons dans le majuscule, tout le reste dans le cas inférieur et le masque se répète à N.Then, cliquez sur soumettre.Enfin, enregistrez cette séquence, en préservant le formatage supérieur et minuscule dans un document ou un programme qui peut être annoté. Pour éviter l’interruption des îles CpG, sélectionnez le spectacle pour la piste des îles CpG sous la bannière expression et régulation du navigateur génome de l’UCSC et cliquez sur actualiser. En zoomant sur les cinq introns principaux, cliquez sur chaque île CpG indiquée en vert et sélectionnez l’ADN de vue pour cette fonctionnalité.Après avoir sélectionné les répétitions de masque à N, cliquez sur obtenir de l’ADN pour obtenir la séquence des îles CpG. Enfin, superposez ces séquences avec le fichier séquence d’origine, et annotez-les comme des régions introniques à éviter. Pour éviter les régions introniques avec des signatures enhancer dans les tissus d’intérêt, naviguez vers la base de données ENCODE et sélectionnez l’icône expériences.Pour le type d’analyse, sélectionnez ChiP-seq ou DNase-seq et remplissez les autres catégories en fonction des cellules à concevoir. Après la sélection des fonctionnalités, sélectionnez le pictogramme le plus à gauche en bleu, pour lequel afficher les résultats comme liste apparaît. Ensuite, sélectionnez les ensembles de données pour les cibles de la monomethylation h3k4, h3k27 acetylation, DNase 1, et CTCF qui correspondait le plus étroitement aux cellules à concevoir.Dans chaque ensemble de données pertinent, faites défiler vers la section fichier, vérifiez que les mm10 et UCSC sont sélectionnés, et cliquez sur le bouton de visualisation. Maintenant, dans le navigateur du génome de l’UCSC, zoomez sur les cinq introns principaux et cliquez sur chaque pic dans les pistes de pointe annotées. Obtenez la séquence d’ADN pour chaque région de pointe en cliquant sur les coordonnées chromosomiques pour chaque pic.Dans le menu de drop-down de vue, sélectionnez l’ADN, et cliquez sur masque répète à N.Finally, superposer ces séquences avec le fichier séquence d’origine et annoter ces régions introniques pour éviter. Pour identifier un sgRNA dans les régions introniques restantes avec une grande spécificité et des scores d’efficacité prévus, naviguez vers un outil de conception sgRNA en ligne de choix, tel que CRISPOR. Entrez la séquence de la région intronronique d’intérêt, spécifiez le génome de référence pertinent et sélectionnez le motif adjacent protospacer désiré.Ensuite, cliquez sur soumettre. Ensuite, trier le sgRNA prédit par score de spécificité et sélectionnez un ou plusieurs sgRNA qui ont également un score d’efficacité élevé prédit. Enfin, concevoir un modèle d’ADN contenant une séquence de plaquette d’atterrissage PITT flanquée des deux côtés par des bras d’homologie de 60 bas qui correspondent au site de coupe sgRNA.Pour l’inversion de la répression des gènes cibles, administrer iPTG dans l’eau potable des homozygotes élevés souris avec l’allèle modifié d’intérêt en dissolvant complètement la quantité désirée d’IPTG dans l’eau distillée stérile le jour de l’administration. Envelopper la bouteille de papier d’aluminium et administrer l’eau IPTG dans une bouteille protégée par la lumière aux souris du génotype approprié et les commandes pendant au moins une semaine. Procéder à l’analyse de l’expression du gène d’intérêt dans le tissu cible.Pour induire l’upregulation des gènes, administrer de la doxycycline dans l’alimentation pendant une semaine et procéder à l’analyse de l’expression du gène d’intérêt dans le tissu cible. qRT PCR anaylisis a montré que l’expression DNMT1 a été réprimée à 15% des niveaux non réglementés en utilisant l’approche basée sur le promoteur. La répression a été inversée d’une manière dépendante de la dose en traitant les souris avec des quantités variables d’IPTG.La répression observée du DNMT1 et l’inversion de la répression du DNMT1 par le traitement de l’IPTG ont été validées au niveau des protéines par immunostaining. l’analyse pcr qRT de l’expression mKate2 a montré que l’approche basée sur l’intron a atteint plus de 90% de répression de la part des opérateurs situés à plusieurs kilobases en aval du site de démarrage de transcription en atténuant l’allongement de transcription. Les images confocales de l’expression mKate2 dans la petite intenstine des souris avec ou sans le répresseur LacIGY ont validé l’approche à base d’intron.La réglementation et la downregulation robustes de l’expression de DNMT1 ont été réalisées dans les cellules souches embryonnaires contenant l’allèle endogène modifié de DNMT1 avec des séquences d’opérateur de Tat et de Lac. Les deux règlements étaient entièrement réversibles et inductibles par les traitements IPTG et Dox. La forte upregulation de DNMT1 a été observée du foie, de la rate, et du rein.Cependant, aucune upregulation détectable dans le coeur n’a été observée, suggérant que le modèle d’expression cycle-dépendant de cellules de DMNT1 et la rareté des cellules prolifératives dans le coeur puissent sous-tendre cette observation. L’étude de la fonction in vivo d’un gène critique en manipulant son expression a souvent été difficile en raison de la létalité. Notre méthode nous a permis de surmonter le phénotype mortel pour notre gène d’intérêt et nous a permis d’étudier son rôle dans la tumorogenèse in vivo.De même, cette technologie permettra d’étudier d’autres gènes essentiels qui ont été difficiles à étudier.

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Cette vidéo démontre le système d’expression génique de la tétracycline, ou Tet-On, dans un modèle murin. En présence de doxycycline, un dérivé de la tétracycline, le système Tet-On constitué de la protéine transactivatrice inverse contrôlée par la tétracycline s’active et exprime le gène d’intérêt.

Expression génique inductible basée sur le système régulable Tet-On in vivo : un système d’expression génique induit par la tétracycline pour l’activation de la transcription du gène cible dans un modèle murin

L'expression ectopique est une technique permettant d'éclaircir le rôle des microARN dans le développement du cerveau. Cependant, le ciblage des zones spécifiques à l'aide de l'électroporation in ovo est un défi. Ici, nous montrons de manière efficace à des régions du mésencéphale ventral et dorsal sélectivement l'électroporation.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Cette étude démontre la reprogrammation des cellules somatiques vers la pluripotence in vivo sans génération de tératomes. Nous avons utilisé l’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de l’ADN plasmidique codant pour les facteurs de Yamanka afin d’induire la reprogrammation in vivo des hépatocytes adultes en cellules de pluripotence accrue.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Dans ce manuscrit, une méthode de préparation de vecteurs recombinants du virus adéno-associé 9 (rAAV9) pour manipuler l’expression génique dans le cœur de souris est décrite.

Préparation de rAAV9 à surexpriment ou Knockdown gènes dans les coeurs de souris

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Injection dans la veine des vecteurs d’intégration axée sur le transposon queue hydrodynamique permet une transfection stable d’hépatocytes murins in vivo. Nous présentons ici un protocole pratique pour les systèmes de transfection qui permet l’expression constitutive à long terme d’un transgène seule ou combinée expression constitutive et doxycycline-induisible d’un transgène ou miR-shARN dans le foie.

Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

Nous présentons ici un protocole pour manipulation spécifique cardiaque génétique chez la souris. Sous anesthésie, le coeur de souris ont été externalisé par le quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus, codage de gènes spécifiques ont été injectés avec une seringue dans le myocarde, suivi par mesure d’expression de protéines via l’imagerie in vivo et Western blot analyse.

Une méthode Simple et efficace pour la Manipulation de gène spécifique cardiaque In Vivo par intramyocardique Injection chez la souris

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit un nouveau test d’amplificateur-rapporteur transitoire basé sur le rAAV. Ce test peut être utilisé pour induire une expression pilotée par l’amplificateur in vivo dans le cerveau de la souris.

Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Découvrez une méthode polyvalente de contrôle conditionnel de l'expression génique endogène in vivo utilisant les systèmes lac et tet. Cette approche permet d'étudier la fonction des gènes de manière réversible et dose-dépendante.

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

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