Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

Notre protocole étend l’utilisation de G.mellonella d’un modèle d’infection systémique à un modèle qui permet l’administration bactérienne par la voie orale naturelle. G.mellonella est un modèle de remplacement approprié pour les rongeurs dans l’analyse des différentes caractéristiques des interactions micro-post innées que les larves peuvent être utilisées pour les bactéries pathogènes humaines. Commencez par transférer les œufs pondus par les papillons adultes dans deux boîtes de litres contenant du substrat de papillon de nuit de cire, à 30 degrés Celsius, dans l’obscurité.

Après une à deux semaines, transférer 25 grammes de larve contenant du substrat dans un substrat frais, lorsque de petites et minuscules larves deviennent visibles. Synchroniser les larves après deux semaines en fonction de leur taille, en groupes de 30 à 40 larves dans de nouveaux contenants de deux litres sur le substrat de papillon de nuit de cire. Après deux semaines, sélectionnez les larves pour l’expérience en poids.

En utilisant seulement pâle, larves en mouvement rapide avec une masse de 180 à 200 milligrammes. Pour forcer l’alimentation des larves, chargez une seringue à insuline avec une aiguille émoussée pour l’application orale, avec une fois 10 à la septième bactérie pour 10 microlitres de DPBS par larve. Charger la seringue dans une pompe à microsyringe.

Attendez qu’une larve ouvre ses parties buccaes avant d’insérer soigneusement la seringue entre les mandibules et de livrer les bactéries. Lorsque toutes les larves ont été nourries, incuber les animaux dans l’obscurité à 37 degrés Celsius, entre une et 24 heures. Pour le traitement des larves, nettoyez une hotte de sécurité avec de l’éthanol et un réaccageur de pulvérisation pour prévenir la contamination par la RNase.

Casser le gel de la larve vivante dans l’azote liquide. Homogénéiser chaque larve congelée à l’aide d’un mortier et d’un pilon et d’un petit volume d’azote liquide. Lorsqu’un homogénéate en poudre a été produit, transférez l’homogénéité dans un bateau d’attente jetable et attendez que l’azote liquide s’évapore.

Lorsque toutes les larves ont été homogénéisées, mélanger les homogénéités en poudre avec un millilitre de TRIzol dans un tube de deux millilitres. Incuber le mélange à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, pelleter l’homogénéité par centrifugation.

Transférer le supernatant dans un nouveau tube. Mélanger le supernatant avec 200 microlitres de 1-Bromo-3-chloropropane, ou BCP. Vortex et incuber pendant cinq minutes à température ambiante, suivi d’une incubation de 10 minutes sur la glace.

À la fin de la deuxième incubation, la centrifugeuse du BCP a ajouté de la réaction et transféré la couche transparente supérieure dans un nouveau tube de deux millilitres. Précipiter l’ARN de la couche supérieure transférée avec 500 microlitres d’isopropanol en mélangeant et en inversant le tube pendant cinq minutes. Puis recueillir l’ARN précipité par centrifugation.

Lavez la pastille d’ARN précipitée avec 500 microlitres de 75% d’éthanol et séchez l’ARN pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Lorsque l’éthanol s’est évaporé, ajouter 100 microlitres d’inhibiteur de la ribonucléase dans de l’eau sans nucléase à la pastille d’ARN séchée, et vortexer soigneusement le tube jusqu’à ce que la pastille soit complètement dissoute. Mesurer la qualité et la quantité de l’ARN selon les protocoles standard, en veillant à ce que le ratio de 260 à 280 soit d’environ deux, et que le ratio de 260 à 230 soit de l’âge de deux à 2,2.

Ensuite, utilisez cinq microgrammes de l’ARN isolé pour la digestion du DNase et l’analyse de l’expression des gènes, selon les protocoles standard. G.mellonella est capable de dégager la force initiale alimentée charge bactérienne jusqu’à ce qu’aucune bactérie ne soit détectable. Avec les 16s nombres de copies génétiques de B.vulgatus et E.coli sensiblement diminué dans les 24 heures.

Commensal administré une larves de G.mellonella induire l’expression du gène ARN de divers gènes marqueurs de l’immunité innée. Par exemple, les molécules de reconnaissance du LPS, l’apolipophorine et l’hémoline sont généralement exprimées plus fortement chez les larves administrées par E.coli que chez les larves administrées par B.vulgatus. De plus, la production d’espèces réactives d’oxygène et d’azote est fortement régulée par rapport à l’alimentation par force d’E.coli par rapport au B.vulgatus, ainsi que par l’expression antioxydante du gène de la TPS.

En outre, l’expression microbienne différentielle de peptide est induite plus fortement après administration d’E.coli qu’en réponse à l’alimentation de force de B.vulgatus. N’oubliez pas d’utiliser uniquement des larves saines, blanches et qui se déplacent rapidement, de faire preuve de patience pendant l’alimentation par la force pour éviter de stresser les larves et d’inclure tous les contrôles nécessaires. L’activation des marqueurs immunitaires G.mellonella peut être déterminée directement par des analyses d’activité de RUS ou de TPS et l’abondance des ANP peut être déterminée par des analyses d’inhibition de croissance bactérienne.

Cette technique peut être utilisée comme outil de dépistage des bactéries proportionnelles et pathogènes et pour explorer les symbiomes intestinaux et les pathobiomes sans sacrifier de nombreux vertébrés. Utilisez toujours l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, du BCP ou des substances TRIzol.