Name: Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Découvrez l'isolement et la propagation efficaces des cellules souches de pulpe dentaire humaine avec un taux de réussite de 90%. Cette méthode permet d'évaluer l'expression de la protéine prion lors de la différenciation neuronale pour la médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu par la « Fondazione Varrone » et Rieti Université Hub « Sabina Universitas » de Vincenzo Mattei.
La figure 5 (A, B) reproduit avec la permission de l’éditeur Taylor & Francis Ltd du : complexe multimoléculaire de rôle de Prion protein-EGFR durant la différenciation neuronale des humains cellules souches issues de pulpe dentaires. Mekki, S., Manganelli V., C. Santacroce, Santilli F., L. Piccoli, Sorice M. Mattei V. Prion. Le 4 mars 2018. Taylor & Francis Ltd.

Troisièmes molaires utilisés dans l’étude ont été excisés de patients (13-19 ans) avec aucun antécédent de consommation d’alcool ou de drogue, toutes non-fumeurs et avec une bonne hygiène buccale. Le jour de l’explication, au département de Science dentaire et maxillo-faciale de l’Université « La Sapienza » de Rome, le consentement éclairé a été obtenu depuis les patients ou les parents. Le consentement éclairé a été obtenu basée sur des considérations éthiques et à l’approbation du comité d’éthique.
1. dents et Extraction de la pulpe dentaire
<ol><li>
Préparation du support approprié pour la conservation ou le transport.
	<ol>
<li>Préparer moyen faible concentration de l’aigle de la modification de Dulbecco de glucose (DMEM-L) en L-glutamine (494,5 mL).</li>
		<li>Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) et 0,5 mL d’amphotéricine (0,1 %).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrait le patient de la troisième molaire, rapidement, rincez-le avec du PBS, mis dans un tube de 15 mL avec le milieu et transférez-le au laboratoire en moins de 2 h.</li>
	<li>Sous une hotte de biohazard, ouvrir la dent avec un cutter en passe d’usinage coronale parallèle et tangent à travers le toit de la chambre pulpaire.</li>
	<li>Doucement, retirer la pulpe avec une petite pelle et placez-le dans un tube à essai.</li>
	<li>Laver trois fois, avec du PBS et centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante.</li>
</ol>2. le traitement de la pulpe dentaire et la libération de cellules souches
<ol><li>Retirez le surnageant, resuspendre le culot dans une solution de Hank et placez-le dans une boîte de pétri. Incuber pendant 2 h à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
	<li>
Préparation de solutions IV collagénase de type.
	<ol>
<li>Préparation de 0,8 mL de DMEM-L.</li>
		<li>Faire fondre 1 mg de collagénase IV type de 0,8 mL de DMEM-L et vortexer pendant plusieurs minutes.</li>
		<li>Ajouter DMEM-L à 1 mL d’avoir une concentration finale de 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlever la solution de Hank par centrifugation à 2 500 g pendant 10 min à la droite et diviser la pâte en petites tranches approximativement 1 mm chacun avec un scalpel jetable.</li>
	<li>Déposer les tranches de pâte dans un plat de Pétri et incuber 1 ml de collagénase de type IV pendant 15 min à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
	<li>
Préparation de culture moyenne (500 mL).
	<ol>
<li>À 445 mL de DMEM-L en L-glutamine.</li>
		<li>Ajouter 50 mL de sérum fœtal (SVF) (10 %).</li>
		<li>Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 2 500 g pendant 10 min à ta, retirez le surnageant, resuspendre le culot dans le milieu (étape 2.5) et la culture dans ballon T25 spécifique des cellules souches à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
</ol>3. propagation et Culture cellules souches
<ol><li>Chaque jour vérifier la culture et, après 3 jours de croissance, observer différents clones de cellules adhérentes dans la fiole.</li>
	<li>Tous les 3 jours changer le milieu de culture.</li>
	<li>Entre 7 et 12 jours, une fois que les cellules adhérentes ont portée confluence, détacher en traitant les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement en utilisant un grattoir de cellules.</li>
	<li>Ajouter 4 ml (ratio 1:5) bouillon de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g, éliminer le surnageant et placer les cellules dans une fiole de T25 pour se propager. Remarque : Tous les 3 jours les cellules atteignent la confluence.</li>
	<li>Propager les cellules jusqu'à 21 ou 28 jours (environ 6 à 8 passages) afin d’éviter la présence de souches non-comme des cellules dans la culture.</li>
	<li>Détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou en grattant doucement. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g.</li>
	<li>Retirez le surnageant et tester les cellules pour analyse cytofluorométrique (étape 6).</li>
</ol>4. transitoire PrPC arreter de siARN
<ol><li>Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5) pendant 24 h.</li>
	<li>
Le lendemain, préparer des siARN PrP milieu (400 µL).
	<ol>
<li>Dans un tube à essais stérile, ajouter µL 384 DMEM-L.</li>
		<li>Ajouter 1 µL pour chaque type de siARN PrP à DMEM-L afin d’obtenir une concentration finale de 5 nM (4 siARN PrP ont été utilisés et vérifiés par le fournisseur pour garantir une efficacité défiant ≥70 %).</li>
		<li>Ajouter 12 µL de transfectionreagent à DMEM-L.</li>
		<li>Le mélange de vortex et incuber pendant 10 min à RT pour permettre la formation de complexes de transfection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 400 μL de siARN PrP moyen dans chaque échantillon et incuber pendant 6 h à 37 ° C.</li>
	<li>Sans jeter le siARN PrP moyen, ajouter 1,6 mL (ratio de 1 à 5) du milieu de culture (étape 2.5).</li>
	<li>Laissez les cellules pendant 72 h à 37 ° C.</li>
	<li>Éliminer le surnageant et laver 3 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de milieu de culture neuronale pendant 7 ou 14 jours (étape 5.1).</li>
	<li>Changer le milieu de culture neuronal tous les 3 jours. Remarque : Remplacer le siARN PrP solution chaque remplacement de temps le milieu de culture neuronal.</li>
	<li>À la fin de l’époque, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à ta et tester des antigènes de surface neuronales à l’analyse Western Blot.</li>
</ol>5. neuronale processus d’Induction de hDPSCs
<ol><li>
Préparation du milieu de culture neuronale (500 mL).
	<ol>
<li>Préparer 444,7 mL de milieu de base formulés aux cellules neuronales.</li>
		<li>Au milieu, ajouter 50 mL de supplément sans sérum utilisé pour soutenir la viabilité à long terme des adultes et embryonnaires cellules souches neuronales (10 %).</li>
		<li>Ajouter 200 µL de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentration finale de 40 ng/mL) et 100 µL de facteur de croissance épidermique (EGF) au milieu (concentration finale 20 ng/mL).</li>
		<li>Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) dans le milieu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La culture hDPSCs à plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) jusqu'à 28 jours de la séparation de la pulpe et de les stimuler avec 2 mL de milieu de culture neuronale.</li>
	<li>Tous les 3 jours jeter le surnageant, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à RT et remplacer 2 mL de milieu de culture neuronal.</li>
	<li>Après 7 ou 14 jours, détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou délicatement avec une spatule.</li>
	<li>Ajouter 4 mL (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.</li>
	<li>Tester la présence d’antigènes de surface neuronales (étape 6) ou l’expression de la protéine prion (étape 7) par analyse en cytométrie en flux.</li>
</ol>6. caractérisation des hDPSCs par cytométrie en flux
<ol><li>Sélectionnez stromal mésenchymateuse (CSM)-les antigènes de surface spécifiques ou neuronales.</li>
	<li>Culture de la hDPSCs en plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).</li>
	<li>Détacher les hDPSCs à 28 jours de séparation de la pulpe dentaire ou après 14 jours de milieu de culture neuronale (étape 5.1) avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement un grattoir.</li>
	<li>ajouter 4 ml (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine et centrifuger à 259 x g pendant 6 min à température ambiante. laver l’autre 2 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Difficulté la hDPSCs ou traités avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize hDPSCS avec surfactant non ionique de 0,1 % (v/v) dans du PBS supplémentaires 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Effectuer le blocage avec 5 % lait écrémé en poudre dans 1 mL de PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber les cellules avec anti-CD105 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD44 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-STRO-1 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD90 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD73 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-β3-tubuline (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-NFH (au 1/100 / 5 x 105 cellules) et anti-GAP43 (au 1/100 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber avec anti-souris PE (01:50 / 5 x 105 cellules) ou anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb supplémentaires 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Utiliser les anticorps secondaires pour blocage des cellules immunopositifs (anti-souris PE ou anti-lapin CY5 mAb) et d’analyser tous les échantillons avec un cytomètre en flux et acquérir au moins 20 000 événements.</li>
</ol>7. évaluation de l’Expression de la PrPC en hDPSCs par Flow Cytometry analyse
<ol><li>Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).</li>
	<li>Détacher des hDPSCs 21 et 28 jours de séparation de la pulpe dentaire et après 7 ou 14 jours avec milieu de culture neuronal (étape 5.1) avec 1 mL de trypsine-EDTA et arrêter l’action de la trypsine, comme indiqué au point 6.4. Difficulté les spécimens avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize avec 0,1 % (v/v) non ionique surfactantin PBS pendant 10 min à RT. Retirez le surnageant et tacher les cellules avec lapin anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à RT. incuber avec anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pour supplémentaire 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Analyser tous les échantillons avec un cytomètre de flux et d’acquérir au moins 20 000 événements.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur les méthodes d’isolement et de la différenciation neuronale de hDPSCs ; en outre, nous avons évalué le rôle de la PrPC dans ce processus. Il y a plusieurs méthodes pour isoler et différencier hDPSCs en cellules semblables à des neurones et des étapes critiques au cours du processus. hDPSCs sont capables de se différencier en plusieurs lignées comme chondroblastes, adipocytes, ostéoblastes et neurones. Dans notre document, nous avons étudié les mécanismes de la d...

Cellules souches mésenchymateuses ont été isolées de divers tissus, y compris la moelle osseuse, sang de cordon ombilical, pulpe dentaire humain, le tissu adipeux et sang1,2,3,4,5 , 6. comme indiqué par plusieurs auteurs, hDPSCs montrent une adhésion en plastique, une morphologie typique des fibroblastes. Il s’agit d’une population très hétérogène avec des clones distincts et les différences dans la capacité de prolifération et de différenciation7,8. hDPSCs expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches mésenchymateuses (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), ils sont négatifs pour certains marqueurs hématopoïétiques (comme CD14 et CD19) et sont capables de différenciation multilignée in vitro9, 10,11.
Plusieurs auteurs ont montré que ces cellules sont capables de se différencier en cellules de neurone comme utilisant des protocoles différents, qui comprennent l’ajout de NGF, bFGF, EGF en combinaison avec le spécifique médias et suppléments7,12. En outre, beaucoup de protéines est impliquées au cours du processus de différenciation neuronale et, parmi ceux-ci, plusieurs journaux montre un rôle pertinent et une expression significative de la protéine prion cellulaire (PrPC), aussi bien dans les cellules souches embryonnaires et adultes13, 14. PrPC représente une molécule pléiotrope capable de remplir des fonctions différentes à l’intérieur de cellules dans le métabolisme du cuivre, l’apoptose, et résistance à l’oxydation stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Dans notre précédente du livre23, nous avons examiné le rôle de la PrPC dans le processus de différenciation neuronale hDPSCs. En fait, hDPSCs exprimer précocement PrPC et, après la différenciation neuronale, il était possible d’observer une augmentation supplémentaire. D’autres auteurs l’hypothèse d’un rôle possible de la PrPC dans les processus de différenciation neuronale de cellules souches. En effet, PrPC entraîne la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans les neurones, les astrocytes et oligodendrocytes24. Le but de cette étude était de mettre l’accent sur la méthodologie pour l’obtention de cellules souches de la pulpe dentaire, ses processus de différenciation et le rôle de la PrPC au cours de la différenciation neuronale.

<table><tbody><tr><td>Solution d’amphotéricine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Il est utilisé pour compléter les milieux de culture cellulaire, c’est un antibiotique antifongique polyène de Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubuline</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp ;</td><td>#4466</td><td>L’une des six isoformes de la B-tubuline, elle est fortement exprimée au cours du développement fœtal et postnatal, restant élevée dans le système nerveux périphérique</td></tr>. <tr><td>Anti-CD105.</td><td>BD Biosciences</td> 611314 <td>L’endogline (CD105), une glycoprotéine majeure de l’endothélium vasculaire humain, est une protéine membranaire intégrale de type I avec une grande région extracellulaire, une région transmembranaire hydrophobe et une courte queue cytoplasmique</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Anticorps marqueurs cellulaires positifs dirigés contre les cellules souches mésenchymateuses</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>13160</td><td>CD73 est une glycoprotéine de 70 kDa ancrée dans le glycosyl phosphatidylinositol, liée à une membrane, qui catalyse l’hydrolyse des monophosphates nucléosidiques extracellulaires en nucléosides bioactifs</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Anticorps à marqueurs cellulaires positifs dirigés contre les cellules souches mésenchymateuses</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>#8945</td><td>Est une protéine spécifique du système nerveux, associée à la croissance, dans les cônes de croissance et les zones de haute plasticité</td></tr><tr><td>Anti-PE de souris&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>Est un anticorps utilisé en cytométrie en flux ou en analyse FACS</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>#2836</td><td>Est un anticorps qui détecte les niveaux endogènes de la protéine Neurofilament-H totale</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Lapin monoclonal [EP 1802Y] à protéine prion PrP</td></tr><tr><td>Anti-lapin CY5&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>est un anticorps utilisé en cytométrie en flux ou en analyse FACS</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Marqueurs cellulaires positifs anticorps dirigés contre les cellules souches mésenchymateuses</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco par life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp ; peut être utilisé pour soutenir l’induction de cellules souches neurales humaines (hNSC) à partir de cellules souches pluripotentes (PSC), l’expansion des hNSC, différenciation des hNSC et maintien des neurones différenciés matures en culture</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux BD Accuri C6&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Cytomètre en flux équipé d’un laser bleu (488 nm) et d’un laser rouge (640 nm)</td></tr><tr><td>Logiciel BD Accuri C6&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Contrôle le système de cytomètre en flux BD Accuri C6 afin d’acquérir des données, de générer des statistiques et d’analyser les résultats</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>basic Fibroblast Growth Factor&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>c’est un appareil qui est utilisé pour la séparation des fluides, gaz ou liquides, basé sur la densité</td></tr><tr><td>Incubateur de CO2 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>il assure des conditions de croissance optimales et reproductibles pour les cultures cellulaires</td></tr><tr><td>Collagénase, type IV&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>La collagénase est une protéase qui clive le lien entre un acide aminé neutre (X) et la glycine dans la séquence Pro-X-Glyc-Pro, que l’on trouve à haute fréquence dans le collagène.</td></tr><tr><td>Scalpel jetable&nbsp ;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Il est utilisé pour couper les tissus</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Low Glucose avec L-Glutamine avec Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Facteur de croissance épidermique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Le sérum de veau fœtal</td><td>Gibco de life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS est un complément de milieu populaire car il offre un large éventail de fonctions dans la culture cellulaire. FBS fournit des nutriments, des facteurs de croissance et d’attachement et protège les cellules des dommages oxydatifs et de l’apoptose par des mécanismes difficiles à reproduire dans les systèmes de milieux sans sérum (SFM)</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0,2 500 mL Filtre à bouchon de bouteille</td><td>Sarstedt</td><td>831 823 101</td><td>c’est un appareil qui est utilisé pour la filtration des solutions</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution pour PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNA pour le gène Entrez 5621. Séquence cible N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp ; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp ; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp ; N.4&nbsp ; La</td></tr><tr><td>solution de Hank 1x</td><td>Gibco de life technologies</td><td>240200083</td><td>La fonction essentielle de Hanks&prime ; La solution saline équilibrée permet de maintenir le pH ainsi que l’équilibre osmotique. Il fournit également de l’eau et des ions inorganiques essentiels aux cellules</td></tr><tr><td>Réactif de transfection HiPerFect.</td>Le réactif de transfection <td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect est un mélange unique de lipides cationiques et neutres qui permet une absorption efficace des siRNA et une libération efficace des siRNA à l’intérieur des cellules, ce qui entraîne une inactivation élevée des gènes même en utilisant de faibles concentrations de siRNA</td></tr><tr><td>.</td><td>Gibco de life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium est un milieu basal conçu pour le maintien et la maturation à long terme des neurones cérébraux post-natals et adultes purs.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Le paraformaldéhyde a été utilisé pour la fixation de cellules et de coupes de tissus lors des procédures de coloration</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>Il est utilisé pour compléter les milieux de culture cellulaire afin de contrôler la contamination bactérienne</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate&nbsp ; (Crédit : PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10</td><td>Le PBS est une solution saline équilibrée utilisée pour la manipulation et la culture des cellules de mammifères. Le PBS est utilisé pour irriguer, laver et diluer les cellules de mammifères. Le tampon phosphate maintient le pH dans la plage physiologique</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 bien, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>C’est une surface de croissance pour les cellules adhérentes</td></tr><tr><td>Fiole de culture tissulaire T-25,Cell+,Vented Cap</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Fiole de culture tissulaire T-25, polystyrène, surface de croissance Cell+ pour cellules adhérentes sensibles, par exemple cellules primaires, col incliné, capuchon de ventilation, jaune, stérile, apyrogène, non cytotoxique, 10 pièces/sac</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Tensioactif non ionique largement utilisé pour la récupération des composants membranaires dans des conditions douces et non dénaturantes</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>La trypsine va cliver les peptides du côté C-terminal des résidus d’acides aminés de lysine et d’arginine. La trypsine est utilisée pour éliminer les cellules adhérentes d’une surface de culture</td></tr><tr><td>Tube</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Offre une protection totale pour l’environnement et le travailleur</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash ; Inversé&nbsp ; Le microscope</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1 offre un prix d’entrée de gamme unique et peut fournir toutes les techniques de contraste, y compris le fond clair, le contraste de phase, le PlasDIC, le VAREL, le contraste de modulation Hoffman amélioré (iHMC), le DIC et la fluorescence. Incorporez un éclairage LED pour une imagerie douce pour les cellules marquées par fluorescence. Axio Vert.A1 est conçu de manière ergonomique pour le travail de routine et suffisamment compact pour être placé à l’intérieur des capots de culture tissulaire.</td></tr></tbody></table>

isolement, propagation et expression de la protéine prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Les enjeux éthiques associés à la manipulation des cellules souches embryonnaires ont entravé les progrès dans le domaine de la recherche médicale. Pour cette raison, il est très important d’obtenir des cellules souches adultes de différents tissus tels que les tissus adipeux, cordon ombilical, la moelle osseuse et le sang. Parmi les sources possibles, la pulpe dentaire est particulièrement intéressant parce qu’il est facile d’obtenir en ce qui concerne les considérations bioéthiques. En effet, Dental Pulp des cellules souches humaines (hDPSCs) sont un type de cellules souches adultes capables de se différencier en cellules neuronales semblables et peuvent provenir de la troisième molaire des patients en bonne santé (âgés de 13 à 19). En particulier, la pulpe dentaire a été enlevée avec une excavatrice, coupée en petites tranches, traitée par collagénase IV et cultivée dans un ballon jaugé. Pour induire la différenciation neuronale, hDPSCs ont été stimulées avec EGF/bFGF pendant 2 semaines. Auparavant, nous avons démontré qu’au cours du processus de différenciation de prion cellulaire protéine (PrPC) en hDPSCs augmenté. L’analyse cytofluorométrique ont montré une expression précoce de la PrPC qui a augmenté après le processus de différenciation neuronale. Ablation de la PrPC de siARN PrP a empêché la différenciation neuronale induite par l’EGF/bFGF. Dans cet article, Nous illustrons que que nous avons amélioré l’isolement, de séparation et de méthodes de culture in vitro de hDPSCs avec plusieurs opérations simples, les clones de cellules plus efficaces étaient expansion obtenue et à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) a été observée. Nous montrons aussi comment les hDPSCs, obtenues avec les méthodes décrites dans le protocole, sont un excellent modèle expérimental pour étudier le processus de différenciation neuronale de MSCs et procédés cellulaires et moléculaires.

Les procédures d’isolement et de séparation de hDPSCs de la pulpe dentaire, obtenue à partir de la troisième molaire, sont des processus complexes dans lesquels petits changements peuvent entraîner un résultat ruineux. Dans cet article, nous utilisons le protocole de Arthur et al. 12 avec plusieurs améliorations. Un schéma représentatif de procédures est illustré à la Figure 1.
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Nous présentons ici un protocole pour humain isolement des cellules souches pulpe dentaire et propagation afin d’évaluer l’expression de la protéine prion au cours du processus de différenciation neuronale.

Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

La façon standard d’obtenir une cellule souche de la pulpe dentaire est peu efficace, et cela dépend de plusieurs variables. Notre protocole a permis d’obtenir un isolement réussi des cellules souches des dents traitées dans 90% des cas. L’obtention d’un grand nombre de cellules en quelques semaines est le principal avantage.Cela nous permet d’utiliser la cellule en médecine régénérative et de créer une biobanque fournissant à d’autres scientifiques cet outil utile. La procédure d’ouverture de la dent sera effectuée par le Dr Constantino Santacroce. Par la suite, le protocole sera montré par Stefano Martellucci, le doctorant de mon laboratoire, qui est le premier auteur de l’article.Pour commencer, extraire la troisième molaire du patient, la rincer rapidement avec du PBS, mettre dans un tube à essai de 15 millilitres avec le milieu, et le transférer au laboratoire en moins de deux heures. Sous une hotte biodangereuse, utiliser un coupeur pour ouvrir la dent par un col de coupe coronal, parallèle et tangente, à travers le toit de la chambre à pâte. À l’aide d’une petite pelle, retirer délicatement la pulpe et la placer dans un tube à essai.Ensuite, laver avec PBS trois fois, et centrifugeuse à 2500 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Après la centrifugation, retirer le supernatant. Resuspendez la pastille dans la solution de Hank, et transférez l’échantillon dans une boîte de Pétri.Retirer la solution du Hank par centrifugation à 2 500 g à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, avec un scalpel jetable, diviser la pulpe en tranches d’environ un millimètre, et ajouter un millilitre de collagène de type IV. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 2500 fois g à température ambiante pendant 10 minutes.Retirez le surnatant et réutilisez la pastille dans le milieu. Culturez-le dans un flacon T25 spécifique aux cellules souches à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone. Pendant la période d’incubation, changer le milieu de culture tous les trois jours.Une fois que les cellules adhérentes atteignent la confluence, ajouter un millilitre de solution trypsine-EDTA aux cellules pour les détacher, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajouter quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine, et centrifuger la suspension cellulaire à 259 fois g pendant six minutes. Retirer le surnatant.Ensuite, placez les cellules dans un flacon T25 à propager. Ensuite, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Centrifuger la suspension cellulaire à 259 fois g pendant six minutes.Retirez le supernatant et testez les cellules pour l’analyse cytofluorimétrique. Pour effectuer l’étape transitoire de silencing de protéine de prion, la première culture les cellules souches dentaires humaines de pulpe dans les plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture pendant 24 heures. Ensuite, ajoutez 400 microlitres du petit milieu interférant de PrP d’ARN à chaque échantillon, et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant six heures.Sans jeter siRNA PrP moyen, ajouter 1,6 millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq, et laisser les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Après la période d’incubation, retirer le surnatant et laver les cellules avec deux millilitres de PBS trois fois à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux millilitres du milieu de culture neuronale, et gardez les cellules pendant sept à 14 jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius.Après la période d’incubation, laver les cellules avec deux millilitres de PBS trois fois à température ambiante, et procéder à l’analyse des taches occidentales pour tester les antigènes neuronaux de surface. Pour effectuer le processus d’induction neuronale, la culture 2 millions de cellules souches de pulpe dentaire humaine dans six plaques de puits, jusqu’à 28 jours de la séparation de la pulpe. Tous les trois jours, jetez le surnatant.Laver trois fois avec deux millilitres de PBS à température ambiante, et remplacer deux millilitres du milieu de culture neuronale. Après sept à 14 jours, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine.Pour caractériser les cellules souches de pulpe dentaire humaine par cytométrie d’écoulement, la culture 2 millions par millilitre des cellules dans les plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture. À 28 jours de séparation post-dentaire de pulpe ou après 14 jours additionnels avec le milieu neuronal de culture, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour détacher les cellules. Ensuite, ajouter quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine, et centrifuger à 259 fois g à température ambiante pendant six minutes.Fixer les cellules non traitées ou traitées avec 300 microlitres de 4% de paraformaldéhyde dans PBS à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, et perméabiliser les cellules avec 1% de surfactant non ionique dans PBS à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires. Puis, centrifugeuse à nouveau, jeter le supernatant, et effectuer le blocage avec 5% de lait séché non gras dans un millilitre de PBS à température ambiante pendant une heure.Lavez-vous trois fois avec un millilitre de PBS et incubez les cellules avec des anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-bêta-trois-tubulines, anti-NFH et anticorps monoclonaux anti-GAP43 à température ambiante pendant une heure. Ensuite, centrifugez les cellules à nouveau trois fois consécutives avec un millilitre de PBS à intervalles de six minutes, puis couvez avec des anti-souris PE ou anti-lapin CY5 anticorps monoclonaux à température ambiante pendant une heure supplémentaire. Utilisez les anticorps secondaires pour les cellules immuno-positives, et analyser tous les échantillons avec un cytomètre d’écoulement.Culture 2 millions de cellules par millilitre des cellules souches de pulpe dentaire humaine dans des plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture. À 21 et 28 jours après la séparation de pulpe dentaire ou après sept à 14 jours additionnels avec le milieu neuronal de culture, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour détacher les cellules. Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis fixer les spécimens avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis perméabiliser avec 1% de surfactant non ionique en PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le supernatant et tachez les cellules avec un anticorps monoclonal anti-PrP de lapin à température ambiante pendant une heure. Enfin, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis incuber avec anticorps monoclonal anti-lapin CY5 à température ambiante pendant une heure supplémentaire.Analyser tous les échantillons à l’l’insurdeur. Après la séparation de pulpe, des amas des cellules souches dentaires humaines de pulpe ont été étendus à la périphérie. Une comparaison entre la croissance de ces cellules avant et après la différenciation neuronale induite par EGF/bFGF a montré des changements significatifs dans la morphologie cellulaire et la excroissance des neurites.Les cellules souches de pulpe dentaire humaine non traitées ont exprimé les antigènes stromales spécifiques multipotents de surface mésenchymal, tels que CD44, CD90, CD105, CD73, et STRO-1. Après des stimuli neuronaux appropriés d’induction, ces cellules ont exprimé des marqueurs neuronaux spécifiques, tels que bêta-trois-tubulin, NFH, et GAP43. Les cellules non traitées ou traitées n’exprimaient pas de marqueurs hématopoïétiques, comme le CD14 et le CD19.Après 28 jours, la protéine de prion a été précocement exprimée dans les cellules souches dentaires humaines de pulpe comparées au contrôle négatif correspondant, et son expression a été augmentée après le processus neuronal de différenciation induit par EGF/bFGF. L’analyse occidentale de tache a prouvé que le silence de la protéine de prion par l’ARN avant que les stimulus d’EGF/bFGF puissent affecter le processus neuronal de différenciation des cellules souches dentaires humaines de pulpe en empêchant l’expression des marqueurs neuronaux bêta-trois-tubulin et NHF. La chose la plus importante est le choix de l’enzyme pour séparer les cellules de la pulpe.En fait, si l’enzyme est trop agressive, les cellules pourraient être endommagées et leur capacité de croissance et de différenciation pourrait être compromise. Les cellules souches de pulpe dentaire sont un excellent modèle expérimental qui peut être utilisé in vivo et des études in vitro dans le domaine de la médecine régénérative. Puisque prp joue un rôle clé dans le processus neuronal de différenciation des cellules souches dentaires de pulpe, ce marqueur peut être un excellent candidat comme cible efficace dans les maladies neurodegenerative.L’aspect le plus important à conseiller est l’état de santé des patients, comme l’absence de maladies infectieuses.

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Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

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