Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

La façon standard d’obtenir une cellule souche de la pulpe dentaire est peu efficace, et cela dépend de plusieurs variables. Notre protocole a permis d’obtenir un isolement réussi des cellules souches des dents traitées dans 90% des cas. L’obtention d’un grand nombre de cellules en quelques semaines est le principal avantage.

Cela nous permet d’utiliser la cellule en médecine régénérative et de créer une biobanque fournissant à d’autres scientifiques cet outil utile. La procédure d’ouverture de la dent sera effectuée par le Dr Constantino Santacroce. Par la suite, le protocole sera montré par Stefano Martellucci, le doctorant de mon laboratoire, qui est le premier auteur de l’article.

Pour commencer, extraire la troisième molaire du patient, la rincer rapidement avec du PBS, mettre dans un tube à essai de 15 millilitres avec le milieu, et le transférer au laboratoire en moins de deux heures. Sous une hotte biodangereuse, utiliser un coupeur pour ouvrir la dent par un col de coupe coronal, parallèle et tangente, à travers le toit de la chambre à pâte. À l’aide d’une petite pelle, retirer délicatement la pulpe et la placer dans un tube à essai.

Ensuite, laver avec PBS trois fois, et centrifugeuse à 2500 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Après la centrifugation, retirer le supernatant. Resuspendez la pastille dans la solution de Hank, et transférez l’échantillon dans une boîte de Pétri.

Retirer la solution du Hank par centrifugation à 2 500 g à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, avec un scalpel jetable, diviser la pulpe en tranches d’environ un millimètre, et ajouter un millilitre de collagène de type IV. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 2500 fois g à température ambiante pendant 10 minutes.

Retirez le surnatant et réutilisez la pastille dans le milieu. Culturez-le dans un flacon T25 spécifique aux cellules souches à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone. Pendant la période d’incubation, changer le milieu de culture tous les trois jours.

Une fois que les cellules adhérentes atteignent la confluence, ajouter un millilitre de solution trypsine-EDTA aux cellules pour les détacher, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajouter quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine, et centrifuger la suspension cellulaire à 259 fois g pendant six minutes. Retirer le surnatant.

Ensuite, placez les cellules dans un flacon T25 à propager. Ensuite, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Centrifuger la suspension cellulaire à 259 fois g pendant six minutes.

Retirez le supernatant et testez les cellules pour l’analyse cytofluorimétrique. Pour effectuer l’étape transitoire de silencing de protéine de prion, la première culture les cellules souches dentaires humaines de pulpe dans les plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture pendant 24 heures. Ensuite, ajoutez 400 microlitres du petit milieu interférant de PrP d’ARN à chaque échantillon, et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant six heures.

Sans jeter siRNA PrP moyen, ajouter 1,6 millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq, et laisser les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Après la période d’incubation, retirer le surnatant et laver les cellules avec deux millilitres de PBS trois fois à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux millilitres du milieu de culture neuronale, et gardez les cellules pendant sept à 14 jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Après la période d’incubation, laver les cellules avec deux millilitres de PBS trois fois à température ambiante, et procéder à l’analyse des taches occidentales pour tester les antigènes neuronaux de surface. Pour effectuer le processus d’induction neuronale, la culture 2 millions de cellules souches de pulpe dentaire humaine dans six plaques de puits, jusqu’à 28 jours de la séparation de la pulpe. Tous les trois jours, jetez le surnatant.

Laver trois fois avec deux millilitres de PBS à température ambiante, et remplacer deux millilitres du milieu de culture neuronale. Après sept à 14 jours, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine.

Pour caractériser les cellules souches de pulpe dentaire humaine par cytométrie d’écoulement, la culture 2 millions par millilitre des cellules dans les plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture. À 28 jours de séparation post-dentaire de pulpe ou après 14 jours additionnels avec le milieu neuronal de culture, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour détacher les cellules. Ensuite, ajouter quatre millilitres du milieu de culture dans un rapport un à cinq pour arrêter l’action de la trypsine, et centrifuger à 259 fois g à température ambiante pendant six minutes.

Fixer les cellules non traitées ou traitées avec 300 microlitres de 4% de paraformaldéhyde dans PBS à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, et perméabiliser les cellules avec 1% de surfactant non ionique dans PBS à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires. Puis, centrifugeuse à nouveau, jeter le supernatant, et effectuer le blocage avec 5% de lait séché non gras dans un millilitre de PBS à température ambiante pendant une heure.

Lavez-vous trois fois avec un millilitre de PBS et incubez les cellules avec des anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-bêta-trois-tubulines, anti-NFH et anticorps monoclonaux anti-GAP43 à température ambiante pendant une heure. Ensuite, centrifugez les cellules à nouveau trois fois consécutives avec un millilitre de PBS à intervalles de six minutes, puis couvez avec des anti-souris PE ou anti-lapin CY5 anticorps monoclonaux à température ambiante pendant une heure supplémentaire. Utilisez les anticorps secondaires pour les cellules immuno-positives, et analyser tous les échantillons avec un cytomètre d’écoulement.

Culture 2 millions de cellules par millilitre des cellules souches de pulpe dentaire humaine dans des plaques de six puits avec deux millilitres du milieu de culture. À 21 et 28 jours après la séparation de pulpe dentaire ou après sept à 14 jours additionnels avec le milieu neuronal de culture, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour détacher les cellules. Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis fixer les spécimens avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis perméabiliser avec 1% de surfactant non ionique en PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le supernatant et tachez les cellules avec un anticorps monoclonal anti-PrP de lapin à température ambiante pendant une heure. Enfin, centrifugeuse, jeter le supernatant, puis incuber avec anticorps monoclonal anti-lapin CY5 à température ambiante pendant une heure supplémentaire.

Analyser tous les échantillons à l’l’insurdeur. Après la séparation de pulpe, des amas des cellules souches dentaires humaines de pulpe ont été étendus à la périphérie. Une comparaison entre la croissance de ces cellules avant et après la différenciation neuronale induite par EGF/bFGF a montré des changements significatifs dans la morphologie cellulaire et la excroissance des neurites.

Les cellules souches de pulpe dentaire humaine non traitées ont exprimé les antigènes stromales spécifiques multipotents de surface mésenchymal, tels que CD44, CD90, CD105, CD73, et STRO-1. Après des stimuli neuronaux appropriés d’induction, ces cellules ont exprimé des marqueurs neuronaux spécifiques, tels que bêta-trois-tubulin, NFH, et GAP43. Les cellules non traitées ou traitées n’exprimaient pas de marqueurs hématopoïétiques, comme le CD14 et le CD19.

Après 28 jours, la protéine de prion a été précocement exprimée dans les cellules souches dentaires humaines de pulpe comparées au contrôle négatif correspondant, et son expression a été augmentée après le processus neuronal de différenciation induit par EGF/bFGF. L’analyse occidentale de tache a prouvé que le silence de la protéine de prion par l’ARN avant que les stimulus d’EGF/bFGF puissent affecter le processus neuronal de différenciation des cellules souches dentaires humaines de pulpe en empêchant l’expression des marqueurs neuronaux bêta-trois-tubulin et NHF. La chose la plus importante est le choix de l’enzyme pour séparer les cellules de la pulpe.

En fait, si l’enzyme est trop agressive, les cellules pourraient être endommagées et leur capacité de croissance et de différenciation pourrait être compromise. Les cellules souches de pulpe dentaire sont un excellent modèle expérimental qui peut être utilisé in vivo et des études in vitro dans le domaine de la médecine régénérative. Puisque prp joue un rôle clé dans le processus neuronal de différenciation des cellules souches dentaires de pulpe, ce marqueur peut être un excellent candidat comme cible efficace dans les maladies neurodegenerative.

L’aspect le plus important à conseiller est l’état de santé des patients, comme l’absence de maladies infectieuses.