Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Dans ce protocole, nous pouvons identifier les interactions entre les protéines et l’ADN, révélant la régulation transcriptionnelle du gène. Cela aide à comprendre les mécanismes moléculaires dans les cellules. Nous modifions les protocoles préexistants, puis établissons des protocoles d’analyse simples et plus clairs.

Il vous suffit de suivre le protocole dès la première étape afin que l’analyse peut être fait avec succès. Pour préparer la chromatine croisée, dans une hotte de fumée, ajoutez quatre millilitres de 1% de médias de culture cellulaire VCaP et 0,229 millilitres de 18,5% PFA à un plat de six centimètres. Faites pivoter doucement le plat pour répartir le PFA uniformément.

Incuber à température ambiante pendant exactement 10 minutes. Ajouter ensuite 0,47 millilitres de solution glycine molaire de 1,25 molar au plat et incuber à température ambiante pendant cinq minutes pour arrêter d’autres liens croisés. Après avoir lavé les cellules selon le manuscrit, racler les cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Centrifugez le tube avec la suspension cellulaire à 3000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante pour récupérer la pastille cellulaire. Utilisez une pipette pour enlever complètement le PBS. Enregistrez le numéro de cellule par tube et stockez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius.

Pour effectuer la lyse cellulaire, décongelez d’abord les granulés de cellules VCaP stockés sur la glace. Ajouter 300 microlitres du tampon de lyse cellulaire ChIP préparé complété par pic à chaque tube, et resuspendre la pastille à fond. Vortex le tube pendant 15 secondes, et incuber la suspension sur la glace pendant 10 minutes.

Centrifugeuse à 9000 fois g pendant trois minutes à 4 degrés Celsius. Retirez complètement le supernatant et ajoutez 300 microlitres de tampon de digestion MNase pour résuspendre la pastille. Diluer le MNase avec le tampon de digestion MNase dans un tube de 1,5 millilitre pour produire 50 unités de gel par microlitre.

Ajouter le MNase dilué à la suspension, et incuber à 37 degrés Celsius pendant exactement 10 minutes. Réglez le mélange par inversion toutes les 2 1/2 minutes. Pour terminer la digestion mnase, ajouter 30 microlitres de 0,5 molaire EDTA au pH huit, et vortex brièvement.

Après incubation pendant cinq minutes sur la glace, centrifugeuse à 9000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez complètement le supernatant et resuspendez la pastille dans 300 microlitres du tampon de dilution ChIP préparé complété par pic. Puis, sur un sonicator équipé d’une sonde micro-pointe, réglez les conditions de sonication à l’amplitude deux, le temps traité 15 secondes, impulsion sur cinq secondes, et pulse OFF 30 secondes.

Sonicate la suspension sur la glace. Dessinez un microlitre de la suspension et placez-le sur un verre à glissière. Au microscope, observez pour vous assurer que la structure cellulaire est presque brisée.

Centrifugez le tube à 9000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Économisez 20 microlitres de la chromatine digérée dans un tube à vis de 1,5 millilitre pour un traitement plus long, et conservez le reste à moins 80 degrés Celsius. Tout d’abord, dans chaque tube à vis de 1,5 millilitre, ajouter 75 microlitres d’eau, quatre microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et un microlitre de proteinase K.To éliminer les liaisons entre les protéines et l’ADN, ajouter 20 microlitres de chromatine digérée de chaque condition de digestion MNase à un tube à vis.

Fermez le bouchon hermétiquement, mélangez complètement et incubez le tube à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin, après avoir centrifugé le tube à 2 à 3000 fois g pendant quelques secondes, ajouter 100 microlitres de PCI. Vortex vigoureusement pour former une émulsion.

Centrifugez à nouveau le tube à vitesse maximale pendant 30 secondes à température ambiante. Ensuite, préparez deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par condition. Ajouter 100 microlitres de PCI à un tube.

Ajouter 10 microlitres d’acétate de sodium trois molaires au pH 5,2 et deux microlitres de glycogène à un autre tube. À partir du tube sorti de la centrifugeuse, dessinez soigneusement la phase supérieure contenant de l’ADN et ajoutez-le au tube contenant du PCI. Vortex vigoureusement, et centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 30 secondes à température ambiante.

Ensuite, transférez la phase supérieure au tube contenant de l’acétate de sodium et du glycogène préparés précédemment. Ajouter 250 microlitres d’éthanol et mélanger par inversion. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Confirmez les granulés sur le fond du tube. Retirer soigneusement le supernatant afin de ne pas déranger la pastille, et ajouter 500 microlitres de 70% d’éthanol.

Centrifuger le tube à vitesse maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirer complètement le surnatant et sécher la pastille pendant environ cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 20 microlitres de TE pour dissoudre la pastille.

Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Après la préparation de la chromatine digérée, décongeler tous les échantillons sur la glace. Ajouter 1200 microlitres du tampon de dilution ChIP préparé complété par pic pour diluer la chromatine digérée à la concentration de cinq microgrammes par 500 microlitres.

Ajouter cinq microlitres de la chromatine digérée diluée à un tube à vis de 1,5 millilitre comme échantillon d’entrée. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres chacun de la chromatine digérée diluée à un tube à vis de 1,5 millilitre comme échantillon d’immunoprécipitation.

Ajouter deux microgrammes d’anticorps à chaque tube et fermer le bouchon. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit en mélangeant doucement sur une plate-forme berçante. Le matin, ajouter 30 microlitres de protéines G de qualité ChIP à chaque tube.

Incuber les tubes à nouveau à quatre degrés Celsius pendant deux heures avec un mélange doux. Après cela, tournez le tube brièvement à deux à 3000 fois g, et placez le tube dans un support en polyéthylène contenant des aimants au néodymium pendant une minute. Ensuite, retirez soigneusement le surnatant par aspiration.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitres de tampon de lavage complexe immunitaire à faible teneur en sel à chaque tube. Vortex brièvement le tube pour disperser les perles. Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avec un mélange doux sur une plate-forme berçante.

Répétez le lavage avec le complexe immunitaire à haute teneur en sel et le complexe immunitaire au chlorure de lithium selon le manuscrit. Après avoir complètement enlevé le supernatant restant, ajouter 150 microlitres de tampon d’élitution au tube. Vortex le tube pour disperser les perles complètement.

Fermez le bouchon et incubez le tube à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour bien disperser les perles, mélanger par inversion toutes les cinq minutes. Pendant l’incubation, préparer un tube à vis de 1,5 millilitre et ajouter six microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et deux microlitres de proteinase K.Thaw l’échantillon d’entrée de 1 % précédemment préparé sur la glace.

Ajouter 150 microlitres de tampon d’élitution, six microlitres de chlorure de sodium cinq molaires et deux microlitres de proteinase K à l’échantillon d’entrée. Après l’incubation du tube contenant des perles, tournez vers le bas. Placez le tube dans un support magnétique pendant une minute, et transférez le supernatant dans le tube à vis contenant du chlorure de sodium et des microphotographes proteinase K.Representative de granulés cellulaires reliés entre eux avant et après que la sonication montre des différences distinctes.

Sans sonication, la structure cellulaire reste intacte, ce qui indique que la chromatine est présente dans les noyaux. Une brève sonication brise la structure cellulaire. La chromatine croisée a été préparée à partir de cellules VCaP et digérée avec diverses quantités de MNase.

Sans ajouter MNase, un modèle de frottis avec un poids moléculaire très élevé est apparu. L’ajout de MNase a donné un modèle d’échelle, ce qui montre que MNase digère internucléosome. Seule la condition qui a produit des fragments de chromatine jusqu’à 900 bp peut être considérée comme une bonne digestion, tandis qu’un modèle de digestion inapproprié montre une surdigestion principalement entraîné une production mononucléosome.

Le modèle de digestion de la chromatine dans les cellules VCaP indiquent une bonne digestion de la chromatine. L’occupation la plus élevée de H3K4methyl3 a été observée autour de 0,5 kilobase et d’un kilobase en amont de l’AR-TSS. Toutefois, les régions situées à 19 kilobases et à huit kb en amont et à 12 kilobases en aval de l’AR-TSS avaient peu d’occupation du H3K4methyl3, ce qui indique qu’elles peuvent être utilisées comme régions négatives.

La détermination de l’état de digestion de MNase est la plus importante. Maintenez le nombre de cellules, le volume tampon et la quantité d’enzymes dans chaque expérience. La condition doit être identifiée pour chaque type de cellule.

Nous pouvons effectuer le séquençage de ChIP pour l’occupation globale des facteurs et des captures de conformation de chromatine pour déterminer les interactions entre les lésions génomiques distales. Cette méthode pourrait révéler les mécanismes de processus de la transcription. L’essai de ChIP est un outil puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle, mais il est lourd et non reproductible.

Notre méthode encourage les chercheurs à effectuer l’analyse régulièrement et facilement.