Chromatographie d’échange ionique (IEX) couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS) pour la caractérisation et la séparation de protéines

Ce protocole présente des LM iration, une nouvelle méthode de contrôle et de caractérisation de la qualité des protéines, un contrôle de la qualité essentiel à la cohérence et à l’intégrité des résultats dans la recherche en sciences de la vie et le développement de produits pharmaceutiques. L’échange d’ion MALS détermine la pureté des protéines, l’état oligomérique, l’homogénéité, l’identité, la conformation, la structure, les modifications post-traduction et d’autres propriétés. Les mesures ne sont pas destructrices et sont effectuées en solution dans des conditions tampons quasi physiologiques.

Cette méthode détermine avec précision la masse molaire de protéines ou de peptides, l’état oligomérique et le degré de conjugaison, par exemple, les glycoprotéines. Il peut également être appliqué sur les protéines membranaires. IEX sépare les macromolécules par leur charge de surface.

L’échange d’anion, AIEX, et l’échange de cation, CIEX, matrices lient négativement et positivement chargés des variantes, respectivement. Avec une séparation fine entre les populations protéiques qui partagent une masse ou une forme relativement proche, IEX-MALS détermine avec succès la masse molaire de chaque état protéique individuel dans un échantillon de mélange. Pour commencer, utilisez un filtre de 0,1 micromètre pour filtrer tous les reagents, y compris les tampons de lavage et d’élitution.

Filtrer les 50 à 100 premiers millilitres de tampon dans une bouteille de déchets afin d’éliminer les particules des filtres secs. Dans une bouteille propre et stérile qui a été lavée à fond avec de l’eau filtrée et plafonnée pour empêcher la poussière d’entrer, filtrer le reste du tampon. Avec le tampon de tris pH-huit et le chlorure de sodium de 50 millimlaires, diluer un échantillon de BSA à six milligrammes par millilitre de sorte que le pH et la force ionique permettront de se lier à la colonne d’échange d’ion.

Utilisez une seringue pour injecter au moins 0,3 à 0,5 milligramme de BSA dans une colonne d’un millilitre pour obtenir une analyse MALS de bonne qualité. Pour démarrer une expérience MALS d’échange d’ion, ouvrez nouvelle expérience à partir de la méthode dans le logiciel MALS, et sélectionnez la méthode en ligne à partir du dossier méthodes système de diffusion de lumière. Si le module DLS est disponible et que les données DLS doivent être acquises, sélectionnez la méthode en ligne à partir du sous-foldeur Light Scattering, With QELS.

Pour définir les paramètres, sous la section Configuration, définissez d’abord le débit de la course dans la section Pompe générique au débit utilisé dans le FPLC comme 1,5 millilitres par minute. Sous la section Solvant, entrez ou vérifiez les paramètres tampons. Sous la section Injecteur, entrez le nom protéique sous le nom de BSA, l’incrément de l’indice réfractif comme 0,185 millilitres par gramme, et le coefficient d’extinction uv à la longueur d’onde de 280 nanomètres comme 0,66 litres par gramme par centimètre.

Dans l’onglet Échantillon, entrez la concentration de l’échantillon de protéines sous forme de six milligrammes par millilitre, puis insérez le volume de l’échantillon pour injection sous forme de 170 microlitres. Dans la section Procédures, dans l’onglet Collection de base, sélectionnez la gâchette de la case à cocher sur Auto-Inject et réglez la durée de la course à 70 millilitres afin que la collecte de données soit poursuivie pendant au moins cinq minutes après que le gradient a atteint sa valeur finale. Ensuite, dans le logiciel FPLC, créez une nouvelle expérience dans l’onglet Éditeur de méthode.

Pour l’expérience initiale, créez un gradient linéaire de sel ou de pH, tandis que pour la méthode optimisée créer un gradient plus spécifique ou un programme stepwise selon le manuscrit. Inclure un signal d’impulsion dans la méthode qui déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS. Ensuite, ouvrez la vanne de la pompe et lavez-la avec de l’hydroxyde de sodium de 0,5 molaire pour éliminer les impuretés fortement liées, suivie d’un lavage tampon de neutralisation.

Ensuite, lavez la colonne avec tris tampon pH huit, la valve A avec tampon de lavage, et la valve B avec tampon d’élitution. Utilisez le tampon de lavage avec la faible concentration de sel comme lavage final pour rincer la colonne, pour permettre la liaison de la protéine à la matrice de colonne. Avant l’injection de l’échantillon, après le lavage et à la fin de l’élitution, la ligne de base de diffusion de la lumière doit être stabilisée pour assurer un faible bruit et une dilution complètement pure.

À l’aide d’une seringue, placer l’échantillon de protéines dans la boucle. Commencez l’expérience d’abord dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton Exécuter, puis dans le logiciel FPLC. Les données seront recueillies après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS.

Si le MALS d’échange d’ion est effectué manuellement avec un mode de flux continu au lieu d’une méthode autonome, appliquez les mêmes paramètres de l’exécuter et les instructions que précédemment décrites. Une fois que la méthode finale a été vérifiée et exécuté, effectuer exactement la même méthode en utilisant une injection vierge en chargeant tampon au lieu de l’échantillon. Il est important que le moment entre l’impulsion d’auto-injection et le gradient de la course blanche soit identique à celui de l’échantillon exécuté.

Pour commencer l’analyse, sous la section Procédures du logiciel MALS, utilisez l’onglet Despiking et le niveau Normal pour lisser les chromatogrammes. S’ils présentent beaucoup de bruit, réglez le niveau à Heavy. Dans la vue Baseline, définissez la ligne de base pour tous les signaux, y compris les détecteurs LS, UV et RI.

Dans la vue Pics, définissez les pics pour analyse. Vérifiez les valeurs correctes de la valeur d’incrément ri dn/dc et du coefficient d’extinction UV pour la protéine sous chaque pic. Sous la masse molaire et le rayon de la vue de diffusion de lumière, analyser la masse molaire et le rayon à l’aide du modèle Zimm et du degré d’ajustement de zéro.

Si QELS est disponible, sous la vue Rh du QUELS, observez les valeurs rh et la qualité de l’ajustement de la fonction de corrélation. Le signal RI change considérablement au cours de l’échange d’ion MALS exécuter en raison de l’augmentation de la concentration de sel. Pour soustraire le signal de base de l’injection vierge, ouvrez à la fois la protéine et les expériences mals d’échange d’ion vierges.

Cliquez à droite sur le nom de l’expérience protéique, sélectionnez Appliquer la méthode et choisissez le dossier de soustraction baseline à partir du dialogue de fichier. Sélectionnez la méthode en ligne pour l’analyse de masse molaire standard. Sous la vue Subtraction de base, cliquez sur Import Blank pour importer les signaux de la course vide.

Sous Instruments, vérifiez tous les détecteurs à soustraire. Pour calibrer le système MALS d’échange d’ion avec le monomère BSA, sous la vue Procédures et Configuration, alignez les pics. Sous la vue Normalisation, entrez 3,0 nanomètres comme valeur Rg pour effectuer la normalisation.

Ensuite, sous l’élargissement de la bande dans le même onglet Configuration, choisissez le pic et utilisez le bouton Perform Fit pour faire correspondre les signaux UV et LS au signal RI. Le graphique des résultats est affiché dans la vue Résultats appropriés. Modifiez les échelles de l’axe et d’autres paramètres graphiques en cliquant à droite sur le graphique, en sélectionnant Modifier, puis en cliquant sur le bouton Avancé.

Pour avoir plus d’options d’affichage, sélectionnez l’onglet Graphique EASI, et en haut de la fenêtre dans le menu drop-down display, sélectionnez les résultats Molar Mass ou Rh Q.All, y compris la masse molaire, le rayon, le niveau de pureté, et d’autres sont disponibles dans la vue Rapport sous la section Résultats. Utilisez le bouton Report Designer pour ajouter plus de résultats ou de paramètres, ainsi que des chiffres, au rapport. Dans cette expérience, BSA a été analysé sur mals d’échange d’ion utilisant une colonne analytique d’échange d’anion.

Les chromatogrammes affichaient l’UV à 280 nanomètres, la diffusion de la lumière à un angle de 90 degrés, l’indice réfractif et les courbes de conductivité ainsi que la masse molaire de chaque pic. Un large gradient linéaire composé de 30 volumes de colonnes de chlorure de sodium de 75 millimlaires à 350 millimaux séparait les monomères BSA des dimers et des oligomères plus élevés. L’analyse en aval du MALS a donné lieu à une masse molaire monomère calculée de 66,8 kilodaltons et à une masse molaire calculée de 130 kilodaltons.

Basé sur la conductivité tampon aux sommets allongés, le gradient a été changé en un programme différent, une longue étape de chlorure de sodium de 175 millimlaires, suivie d’un gradient linéaire de chlorure de sodium de 175 millimolar à 500 millimolar. Le nouveau gradient a grandement amélioré la résolution et produit une excellente séparation entre le monomère BSA et les espèces oligomériques supérieures. Un programme stepwise de chlorure de sodium de 200 millimolar et 250 millimolar a été appliqué pour se concentrer également sur les espèces oligomériques élevées.

Il a eu comme conséquence une excellente séparation entre le monomère, le dimère, et le trimer de BSA. Après cette procédure, des méthodes telles que la spectrométrie de masse, l’activité SDS-PAGE et les tests de stabilité peuvent être effectuées sur chaque variante séparée par échange d’ions pour identifier et caractériser davantage chacune d’entre eux. Nous avons constaté que mals iration d’ions étend la puissance de l’analyse MALS aux échantillons qui ne peuvent pas être entièrement analysés par SEC-MALS.

La séparation par charge résout les espèces distinctes qui coelute dans SEC.