Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains
23 mai 2019
Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.
Dans ce protocole, nous détailler un modèle in vitro de tauopathie humaine. Cette méthode comble un besoin de matériaux qui peut être utile pour le dépistage des médicaments et les études sur les mécanismes de la maladie. Le principal avantage de cette technique est que le paradigme de la culture cellulaire permet une évaluation plus rapide de la toxicité tau et des thérapeutiques tau potentielles par rapport aux études animales Pour commencer cette procédure décongeler le revêtement matricielle membranaire du sous-sol pour les plaques de culture à quatre degrés Celsius.
Faites des aliquots d’un millilitre et rangez-les à moins 20 ou moins 70 degrés Celsius. Ensuite, reconstituer le facteur de croissance fibroblaste de base dans PBS stérile à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Faire des aliquots de 10 microlitres et les stocker à quatre degrés Celsius.
Ensuite, mettez en place une nouvelle bouteille non ouverte de 500 millilitres de DMEM-F12 avec glutamine. Ajouter 10 millilitres de B27, cinq millilitres de N2 et cinq millilitres de pénicilline-streptomycine pour préparer les cellules souches neurales. Placer 50 millilitres du média NSC dans un tube conique et ajouter 10 microlitres du bFGF préparé.
Stockez ce média NSC plus bFGF à quatre degrés Celsius. Tout d’abord, retirez un aliquot de revêtement matriciel membranaire gelé pour les plaques de culture cellulaire du congélateur et il permet de décongeler à quatre degrés Celsius. Ajouter 385 microlitres du revêtement matriciel membranaire décongelé du sous-sol à cinq millilitres de supports DMEM-F12 contenant de la pénicilline-streptomycine.
Si les cellules sont décongelées à partir de stocks gelés de NSC, prenez un flacon de cellules gelées du congélateur et réchauffez-le dans un bain d’eau chauffé à 37 degrés Celsius en déplaçant le flacon dans l’eau. Après cela, vaporiser le flacon avec 70% d’éthanol. Ensuite, sous un capot de culture cellulaire, transférer les cellules à environ 10 millilitres de DMEM-F12 médias contenant de la pénicilline-streptomycine.
Centrifugeuse à température ambiante à 1000 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez les médias et réutilisez les cellules dans les médias du CNS. Diluer les cellules dans les supports du CNS afin d’obtenir la densité d’ensemencement appropriée pour le vaisseau de culture cellulaire utilisé.
Ajouter suffisamment de cellules suspendues dans les supports NSC pour ensemencer les plats de culture enduits de membrane du sous-sol. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient 75 à 80% confluent, en s’assurant de changer les médias tous les deux jours. Pour transduire les neurones avec le lentivirus, utilisez un nombre de litres de 340 000 unités transductibles par cellule.
Diluer les unités transductibles dans les médias de culture cellulaire à la concentration nécessaire, et les ajouter aux cellules. Deux jours après l’ajout du lentivirus, lavez les cellules une fois avec un nouveau média qui ne contient pas de bFGF. Continuer à culturer les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans les médias sans bFGF.
Maintenir les cellules pendant environ huit semaines après la transduction, en s’assurant de changer les médias de culture cellulaire tous les deux jours. Utilisez un microscope léger pour visualiser systématiquement les cellules et assurer la viabilité. Après la transduction, retirer les plats de culture de l’incubateur en s’assurant de garder le couvercle sur eux pour garder la culture bien stérile.
Utilisez un microscope fluorescent capable d’imagerie cellulaire vivante pour visualiser les cellules sous un objectif de 10 X avec une excitation de 514 nanomètres et un filtre à émission de 527 nanomètres. Dans cette étude, les neurones transduced avec le lentivirus tau-RDLM-YFP sont étiquetés fluorescentement avec YFP. Les cultures transduced rdlm sont vues pour afficher des agrégats après transduction.
Ces inclusions tachent positif pour le thioflavine. La différenciation neuronale est confirmée par l’immunolabeling du marqueur neuronal bêta-tubulin III dans les cultures. Il est important de se rappeler que les anticorps secondaires étiquetés fluorescents devraient avoir un spectre d’émission d’excitation qui ne chevauche pas celui de YFP.
Bien que les agrégats tau fluorescence jaune seront visibles en l’absence de coloration, thioflavine devrait également être utilisé pour l’imagerie afin de confirmer que le signal fluorescent est agrégé tau et non des débris cellulaires. Après la génération de cellules tau surexprimant, un certain nombre d’évaluations de la santé neuronale et de l’agrégation tau peuvent être effectuées. Par exemple, nous avons constaté que ces cellules présentent une dégénérescence axonale.
En plus des études de culture cellulaire, nous avons utilisé cette méthode pour examiner la pathotérité exosomale dérivée tau.
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Aperçu
Cette étude décrit un protocole permettant de mettre en place un modèle in vitro de tauopathie humaine en transduisant des cultures neuronales avec des constructions rétrovirales lentivirales codant pour une protéine Tau humaine mutante. Ce modèle permet une évaluation rapide de la toxicité de la protéine Tau et des thérapeutiques potentielles, par rapport aux études traditionnelles sur des animaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Tauopathies
Contexte
- Les tauopathies humaines sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l'agrégation de la protéine tau.
- Les modèles traditionnels impliquent souvent des délais prolongés et ne reflètent pas toujours la pathologie humaine.
- Ce protocole présente un paradigme d'évaluation plus rapide et plus spécifique à l'aide de cultures cellulaires.
- Il remédie aux limites des modèles animaux pour l'étude des interactions de la protéine tau.
Objectif de l'étude
- Développer un modèle de culture neuronale humaine pour l'étude de la pathologie liée à la protéine tau.
- Faciliter le criblage de médicaments pour les maladies associées à la protéine tau.
- Contribuer à la compréhension du rôle de la protéine tau dans la neurodégénérescence.
Méthodes utilisées
- La plateforme utilisée est un système de culture de cellules neuronales humaines.
- Le modèle biologique est constitué de neurones humains transduits avec une protéine tau mutante à l'aide de constructions lentivirales.
- Aucun protocole de multiomique n'est mentionné dans le texte.
- Les cellules sont conservées environ huit semaines après la transduction, avec des changements réguliers de milieu.
- Une microscopie optique et fluorescente est utilisée pour visualiser l'agrégation de la protéine tau.
Résultats principaux
- Les cultures transduites présentaient des agrégats de protéine tau, confirmés par une coloration au thioflavine.
- La différenciation neuronale a été validée par immunomarquage de la bêta-tubuline III.
- Les observations ont révélé une dégénérescence axonale parmi les cellules surexprimant la protéine tau.
- L'étude souligne la viabilité de l'utilisation de ce modèle pour évaluer la santé neuronale liée à la protéine tau.
Conclusions
- La présente étude démontre une approche in vitro fiable pour explorer les tauopathies et évaluer la toxicité de la protéine tau.
- Le modèle développé ouvre des perspectives pour tester des thérapeutiques ciblant la protéine tau.
- Les connaissances acquises peuvent améliorer la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'agrégation de la protéine tau et à la neurodégénérescence.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce modèle de neurone humain in vitro comble un manque critique dans la recherche sur les tauopathies en offrant un système pertinent pour l'évaluation rapide de l'agrégation de la protéine tau et de la neurotoxicité. Il permet une validation précoce des cibles thérapeutiques et une réduction des risques mécanistiques pour les traitements ciblant la protéine tau, réduisant ainsi la dépendance aux études animales longues. Le modèle renforce la confiance prédictive dans l'identification des candidats-médicaments et le tri préclinique pour les programmes de maladies neurodégénératives.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Analyse des mutants pathogènes de la protéine tau dans des neurones humains afin de valider des cibles thérapeutiques et de préciser les mécanismes d'agrégation.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle des cibles grâce à des mesures quantitatives telles que la longueur axonale et les variations du volume lysosomal.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en cours en modélisant la pathologie et les profils de toxicité de la protéine tau propres aux humains.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'essai : Produit des agrégats de protéine tau normalisés et marqués par fluorescence, détectables par YFP et coloration au thioflavine, pour le criblage de composés.
- Résultats quantitatifs : Permet la mesure de la charge d'agrégation et des phénotypes neurotoxiques en tant que variables dépendantes dans des essais de réponse-dose.
- Extensibilité : La transduction lentivirale permet une préparation cohérente et extensible de cultures neuronales pertinentes sur le plan pathologique, destinées au criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Utilise des neurones humains exprimant des mutants pathogènes de la protéine tau pour modéliser les événements précoces de la maladie d’Alzheimer et des tauopathies apparentées.
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les travaux précliniques en fournissant un système cellulaire humain pour des études sur le mécanisme d’action.
- Décisions adaptées au risque : Permet l’évaluation de composés ciblant la protéine tau dans un système présentant des agrégats positifs au thioflavine et une dégénérescence des neurites.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le modèle s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible à l'identification de composés actifs et aux tests d'efficacité préclinique, en soutenant des cycles itératifs de conception, synthèse et évaluation pour les modulateurs de la protéine Tau.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur des mutants de la protéine tau et l'élucidation des voies biologiques par imagerie en temps réel de l'agrégation et des marqueurs de toxicité dans des cellules vivantes.
- Criblage : Fournit des cultures prêtes à l'essai, avec une transduction standardisée et des phénotypes d'agrégation, pour l'évaluation de bibliothèques de composés.
- Analytique : Offre des variables dépendantes quantitatives, telles que la charge d'agrégats fluorescents, la longueur axonale et le volume lysosomal, permettant des comparaisons statistiques.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la validation préclinique en modélisant la pathologie humaine de la protéine tau dans un système réductionniste.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour tester diverses constructions de la protéine tau, inhibiteurs ou approches d'édition génique dans différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la cible en modélisant une tauopathie humaine à l’aide de mutants pathogènes et en validant les agrégats par la positivité au thioflavine.
- Valeur opérationnelle : Offre un système rentable et reproductible, avec des milieux définis, des protocoles de transduction et une durée de culture de huit semaines.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d’aller/arrêt en fournissant des données précoces sur la neurotoxicité et l’efficacité pertinentes pour l’humain.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque des thérapeutiques ciblant la protéine tau, fondée sur des lectures d’agrégation et de dégénérescence des neurites.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules neuronales, transduction lentiviral et microscopie à fluorescence.
- Dépend de l'accès à des cellules souches neurales humaines, à des vecteurs lentiviraux et à un équipement d'imagerie doté de jeux de filtres appropriés.
- Exige une standardisation du titre de transduction (340 000 UT/cellule) et des formulations de milieux entre les différents sites.
- Implique des adaptations pour d'autres mutants de la protéine tau ou des constructions rapporteuses autres que tau-RDLM-YFP.
- Limité par la durée de culture de huit semaines et la variabilité potentielle de l'efficacité de formation des agrégats.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
