Name: En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez une méthode innovante pour le suivi en temps réel de l'activation des récepteurs olfactifs en phase vapeur. Cette technique permet de mesurer la détection et la discrimination des odeurs volatiles in vitro.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC014423 et DC016224) et le Defense Advanced Research Office RealNose le projet. FJ est resté à l’Université Duke avec l’appui financier du programme JSPS pour faire progresser des réseaux stratégiques International accélérer la Circulation des chercheurs talentueux (R2801). Nous remercions Sahar Kaleem pour l’édition du manuscrit.

1. Culture de cellules de Hana3A
<ol><li>Préparer la M10 (milieu essentiel Minimum (MEM) plus 10 % v/v foetale de sérum bovin (FBS)) et M10PSF (M10 plus 100 µg/mL de pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL, amphotéricine B).</li>
	<li>La culture des cellules dans 10 mL de M10PSF dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).</li>
	<li>Diviser les cellules tous les 2 jours à un taux de 20 % : lorsque 100 % confluence des cellules (environ 1,1 x 107 cellules) est observée au microscope à contraste de phase, aspire les médias et laver les cellules doucement avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Aspirer les PBS et ajouter 3 mL d’acide 0.05 % trypsine-éthylène diamine tétraacétique (EDTA, 0,48 mM). Laisser agir pendant environ 1 min, jusqu'à ce que les cellules se dissocient de la plaque.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de M10 à inactiver la trypsine et finit par se détacher les cellules encore attachés à la plaque de pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Transférer le volume (8 mL) dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de M10PSF en pipettant également, haut et bas pour casser n’importe quelle cellule massive. Évitez de créer des bulles dans le tube.</li>
	<li>Transférer 1 mL de la solution de cellules resuspendues dans une nouvelle boîte de Petri de cellule 100 mm et ajouter 9 mL de M10PSF frais. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
</ol>2. préparation des cellules pour la Transfection
<ol><li>Évaluer la confluence, ou le nombre de cellules, par leur observation au microscope à contraste de phase. Au moins 10 % confluence (environ 1,1 x 106 cellules) est nécessaire pour une seule plaque.</li>
	<li>Aspirer les médias et laver les cellules doucement avec 10 mL de PBS. Aspirer les PBS et ajouter 3 mL d’EDTA. Laisser agir pendant environ 1 min à température ambiante, jusqu'à ce que les cellules se dissocient de la plaque.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de M10 à inactiver la trypsine et finit par se détacher les cellules encore attachés à la plaque de pipetage de haut en bas. Transférer le volume (8 mL) dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de M10PSF en pipettant également, haut et bas pour casser n’importe quelle cellule massive. Évitez de créer des bulles dans le tube.</li>
	<li>Selon le nombre de plaques à transfecter, transférer une quantité appropriée de cellules dans un réservoir avec le bon volume correspondant de M10PSF. Une plaque à 96 puits doit être plaquée avec 1/10 d’un plat de confluentes 100 mm 100 % (environ 1,1 x 106 cellules) dilué dans M10PSF pour atteindre un volume total de 6 mL. Pour une plaque à 96 puits commençant par un plat de 100 mm 100 % confluence, ajouter 500 µL de la 5 mL de cellules resuspendues à 5,5 mL de M10PSF frais. Mélanger les cellules et les M10PSF sans générer des bulles d’air.</li>
	<li>Distribuer 50 µL des suspension cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
</ol>3. Transfection de plasmide
<ol><li>Observer la plaque de 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 30 % et 50 %.</li>
	<li>Préparer un mélange de transfection première contenant des plasmides communs à la plaque entière (RTP1S, ou et la protéine Glosensor, voir la Table des matières) suivant les volumes dans le tableau 1. Notez que la quantité d’OR Rho-tag devrait être divisé par le nombre d’ORs si plusieurs ORs. Remarque : Nous avons fortement conseils pour ajouter un contrôle négatif vecteur vide (ici Rho-pCI) et tout contrôle positif (OR connu pour répondre à la substance odorante testée) pour le plan de l’expérience.</li>
	<li>Préparer un mélange de transfection deuxième contenant 500 µL de MEM et 20 µL de réactif de Lipofectamine 2000 (valable pour une plaque à 96 puits, voir Table des matières). Ajouter le deuxième mélange au premier et mélanger doucement en pipettant également de haut en bas et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 5 mL de M10 et mélanger doucement.</li>
	<li>Remplacer le M10PSF dans la plaque à 96 puits précédemment tressée par 50 µL des médias transfection final. Incuber dans un jeu d’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 et vide la chambre du luminomètre durant la nuit suivant la procédure décrite à l’étape 6.</li>
</ol>4. substrat Incubation
<ol><li>Observer la plaque de 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 60 % et 100 %. Préparer une solution de stimulation de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) contenant 10 mM de l’acide piperazineethanesulfonic hydroxyéthyl (HEPES) et 5 mM de D-glucose.</li>
	<li>Diluer 75 µL de réactif au cAMP (voir Table des matières) solution à 2,75 mL de la solution de stimulation. Retirer le support de transfection de la plaque à 96 puits et laver les cellules en ajoutant 50 µL de solution de stimulation douce à chaque puits.</li>
	<li>Enlever la solution de stimulation et ajouter 25 µL de solution de réactif cAMP établie à l’étape 4.2 dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits dans un environnement sombre et sans odeur (par exemple, un tiroir vide propre loin des produits chimiques ou de n’importe quelle source d’odeur) pendant 2 h à température ambiante.</li>
</ol>5. Stimulation de la substance odorante
<ol><li>Tout d’abord, équilibrer la chambre luminomètre avec les molécules odorantes volatiles. Diluer la substance odorante de la concentration désirée dans 10 mL d’huile minérale (Figure 2A). Avant la fin de la période d’incubation de cAMP réactif, ajouter 25 µL de la solution de la substance odorante dans une nouvelle plaque de 96 puits (pas celui contenant les cellules). Incuber cette plaque odorant à température ambiante dans la chambre de luminomètre pendant 5 min (Figure 2B) (aucun enregistrement de luminomètre n’est nécessaire ici).</li>
	<li>Définissez le luminomètre pour enregistrer la luminescence avec 0 s de retard au cours de 20 cycles de mesure de la plaque de 90 s avec 0,7 s d’intervalle entre les cycles.</li>
	<li>Juste avant la lecture de la plaque, retirez la plaque de substance odorante de la chambre. Ajouter 25 µL d’odeur entre les puits de la plaque à 96 puits contenant les cellules (ne pas ajouter la substance odorante dans les puits contenant les cellules) et commencer rapidement la mesure de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 minutes (Figure 2C).</li>
</ol>6. Elimination des odorants restant à l’intérieur le luminomètre
<ol><li>Ouvrez la porte du luminomètre. Insérer le tube relié à la pompe à vide.</li>
	<li>Odorisants vide dans la lecture de chambre longuement (au moins 2 h, de préférence la nuit) entre deux substances odorantes pour éviter la contamination croisée des volatiles odeur d’expérience d’un à l’autre. Remplacez par l’air frais en envoyant de l’air comprimé pendant 5 min avant incubation la prochaine odorant.</li>
</ol>7. analyse de données
<ol><li>Exporter les données depuis le logiciel luminomètre.</li>
	<li>Moyenne de la réplique du même sexe ou pour chaque durée d’enregistrement. Calculer la réponse OR normalisée à tout contrôle éventuel (p. ex., vecteur vide, Figure 3A et article résultats représentatifs) en divisant la valeur du contrôle en moyenne pour l’OR était en moyenne de valeur à chaque temps d’enregistrement (Figure 3B et section résultats représentatifs).</li>
	<li>Normaliser la chaque réponse d’OR à leur activité basale en divisant la réponse d’OR en moyenne à 0 s à chaque enregistrement temps de réponse (voir la Figure 3C et article de résultats représentatifs).</li>
	<li>Calculer l’aire sous la courbe de chaque OR afin d’obtenir une seule valeur de réponse d’OR. Pour ce faire, additionner toutes les valeurs de luminescence de chaque temps d’enregistrement pour chaque OR.</li>
</ol>

Y.F., H. K et H.M. ont déposé une demande de brevet pertinentes à ce travail sur 27 octobre 2016.

La perception des odeurs dépend fondamentalement de l’activation de l’ORs. En conséquence, il faut comprendre leur fonctionnalité pour casser les mécanismes complexes qui le cerveau permet de percevoir son environnement chimique volatile. Cependant, la compréhension de ce processus a été entravée par les difficultés à établir une méthode robuste pour le répertoire de l’OR pour la fonctionnalité contre Odorisants in vitro. d’écran Cellule de surface et hétérologue expression de sor a été partiellement résolue par...

Le sens de l’odorat permet d’interagir avec leur environnement chimique volatile d’émotions et de comportements en voiture, les animaux terrestres. Fondamentalement, le processus de détection d’odeur commence avec la première interaction des molécules odorantes avec le système olfactif, au niveau de l’odorisant récepteurs (ORs)1. Chez les mammifères, les ORs sont individuellement exprimés dans les neurones sensoriels olfactifs (OSNs) situés dans l' épithélium olfactif2. Ils appartiennent à la famille G-protéine a couplé des récepteurs (GPCR) et plus précisément à la sous-famille de type rhodopsine (également appelé classe A). ORs de couple avec le stimulateur G protéine Golf dont l’activation mène à la production d’AMPc suivie de l’ouverture des canaux nucléotide cyclique contrôlé et la génération de potentiels d’action. Il est admis qu’un percept odeur s’appuie sur un modèle spécifique d’activés ORs3,4 et reconnaissance de l’odeur suit donc un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer un combinaison d’ORs. Et par le biais de ce codage combinatoire, on émet l’hypothèse que les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Une des clés pour comprendre la façon dont sont perçus les odeurs est de comprendre comment et qui sor est activés par une odeur donnée.
Pour tenter d’élucider odorant- ou des interactions, des essais fonctionnels in vitro ont joué un rôle essentiel. L’identification des ligands odorant agoniste pour orphelin ORs (dé-orphanization OR) a été un champ très actif pendant les vingt dernières années, grâce à l’utilisation de divers in vitro, ex vivo et des épreuves fonctionnelles in vivo5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
Systèmes de test in vitro sont plus adaptés pour la caractérisation fonctionnelle détaillée de RUP, y compris l’identification des domaines fonctionnels et résidus importants de SRO, ainsi que les applications potentielles de génie. Cependant, outre développement des systèmes in vitro précieux pour ORs a été un défi, en partie en raison de la difficulté avec OSNs culture et expression fonctionnelle d’ORs en cellules hétérologues. Le premier défi a été d’établir des protocoles permettant l’expression en surface cellulaire de SRO fonctionnelle dans le mappage de substance odorante-interactions OR. Un certain nombre de groupes indépendants ont utilisé diverses approches5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Une des premières réalisations a été faite par Krautwurst et coll. dans le tag N-terminal du sor avec une séquence raccourcie de la rhodopsine (Rho-tag) et observé une expression de surface améliorée de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)13. Modifications apportées à l’étiquette associée à la séquence de l’OR est toujours un chemin exploré pour améliorer OR expression et la fonctionnalité de19,21. Saito et al.. alors identifié la protéine du récepteur-transport 1 (RTP1) et RTP2 qui facilitent le trafic d’OR. 22 une version courte de RTP1, appelé RTP1S, a également démontrée pour être encore plus efficace que l’original de protéine23. Le développement d’une lignée cellulaire (Hana3A) qui exprime stablement Golf, REEP1, RTP1 et RTP2 24, associée à l’utilisation de reporters de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) a permis l’identification de la substance odorante-interactions OR. Le mécanisme par lequel la famille RTP de protéines favorise l’expression à la surface cellulaire de SRO reste à déterminer.
Une mise en garde de ces méthodes est qu’ils s’appuient sur la stimulation de la substance odorante en phase liquide, ce qui signifie que les composés malodorants sont préalablement dissous dans un milieu de stimulation et stimulent les cellules en remplaçant le milieu. C’est très distincte de l’état physiologique, où les molécules odorantes atteignent l’épithélium olfactif en phase gazeuse et activer l’ORs par dissolution dans la muqueuse nasale. Pour ressembler plus étroitement à exposition relance physiologiquement pertinents, Sanz et coll.20 a proposé une analyse basée sur la stimulation de la vapeur en appliquant une goutte de solution d’odorants à accrocher sous la face intérieure d’un film plastique sur le dessus du puits de la cellule. Ils ont enregistré les réponses de calcium en contrôlant l’intensité de la fluorescence. Cette méthode a été le premier à utiliser la stimulation odorante phase aérienne, mais elle ne permettait pas une grande projection d’activation de l’OR.
Ici, nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel d’activation in vitro d’OR via la stimulation de vapor phase odorant par le dosage de la Glosensor (Figure 1). Ce test a été utilisé précédemment dans le contexte du liquide odorant stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la chambre suivie du luminomètre est tout d’abord équilibrée avec vaporisé odorante avant plaque lecture (Figure 1A). Molécules odorantes sont solvatés dans la mémoire tampon, baignade Hana3A cellules exprimant l’OR d’intérêt, les RTP1S et les Glosensor de protéines (Figure 1B). Si l’odeur est un agoniste de l’OR, l’OR va passer à une conformation activée lier le Golf, activation de l’adénylate cyclase (AC) et finir par provoquer des taux d’AMPc à augmenter. Ce cAMP montante va se lier à et activer la protéine Glosensor pour générer la luminescence catalysant la luciférine. Cette luminescence est ensuite enregistrée par le luminomètre et permet la surveillance d’activation OR. Cette méthode est d’un grand intérêt dans le cadre de deorphanization d’OR car elle apporte des systèmes in vitro plus près à la perception naturelle des odeurs.

<table><tbody><tr><td>0,05 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05 % Trypsine - EDTA (1x), rouge de phénol - stocker à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de 100 mm&nbsp ;</td>Boîte de culture cellulaire <td>BD Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm x 20 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>Tubes coniques de 17 mm x 120 mm</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>96 puits, avec couvercle LE blanc avec fond transparent Poly-D-lysine revêtu de polystyrène</td></tr><tr><td>Amphotéricine</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Amphotéricine B 250 &micro ; g/mL - conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>centrifugeuse</td><td>Jouan</td><td>C312</td><td>Centrifugeuse avec rotor à godet oscillant pour 15 mL</td></tr><tr><td>Classe II Type A/B3 hotte</td><td>NUAIRE</td><td>NUAIRE NU-407-500</td><td>hotte pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Sérum de veau fœtal - stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Reagent</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP Substrat de protéine luminescente réactif - stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Incubateur 37 &deg ; C; 5 % CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>Incubateur pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 réactif</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000 Réactif 1mg/ml réactif de transfection - conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Luminomètre POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>discontinué</td><td>Lecteur de plaques 96 puits pour la luminescence</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Solvant pour odorisants - conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>Minimum Essential Medium Eagle avec Earle' sels et L-glutamine - se stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>Solution de pénicilline-streptomycine stabilisée avec 10 000 U de pénicilline et 10 mg de streptomycine - se conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F plasmide de protéine luminescente cAMP - stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase</td><td>Leica</td><td>090-131.001</td><td>Microscope à contraste de phase avec objectifs x4, x10, x20</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami lab-100</td><td></td> <td>ng/&micro ; plasmide L - stocker à 4 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

en temps réel en vitro suivi d’activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en phase vapeur

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

La perception olfactive commence par l’interaction des substances odorantes avec les récepteurs odorants (ou) exprimé par les neurones sensoriels olfactifs (OSN). Reconnaissance de l’odeur suit un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer une combinaison d’ORs. Grâce à ce codage combinatoire, les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Ainsi, une odeur à une concentration donnée peut être décrit par un modèle d’activation des RUP, qui est propre à chaque odeur. En ce sens, fissuration des mécanismes que le cerveau utilise pour percevoir l’odeur nécessite la compréhension odorant-interactions OR. C’est pourquoi la communauté de l’olfaction s’est engagée à « l’orphanize » ces récepteurs. Les systèmes in vitro conventionnelles permet d’identifier la substance odorante- ou interactions ont utilisé des milieux cellulaires en incubation avec odorant, qui se distingue par la détection naturelle des odeurs par dissolution de substances odorantes de vapeur dans la muqueuse nasale avant d’interagir avec les ORs. Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel de l’activation d’OR par l’intermédiaire de substances odorantes vapor phase. Notre méthode repose sur la mesure cAMP libération par luminescence à l’aide du test Glosensor. Il comble les lacunes entre les approches in vivo et in vitro et fournit une base pour un capteur chimique volatile biomimétique.

Nous avons projeté la réponse des trois ORs de souris, Olfr746, Olfr124 et Olfr1093 en utilisant une stimulation vapor Cinnamaldéhyde (Figure 3). En même temps, nous avons utilisé une lutte antivectorielle vide (Rho-pCI) pour assurer que les activités induite par l’odeur des RUP testés étaient spécifiques (Figure 3A). L’activation en temps réel des RUP sur relance de vapeur odorante a été surveillé mesure plus de 20 cycles. Les données pour chaq...

Physiologiquement, les odorants récepteurs sont activés par des molécules odorantes inhalés en phase vapeur. Cependant, la plupart des systèmes in vitro utilisent une stimulation de la phase liquide odorant. Nous présentons ici une méthode qui permet un suivi en temps réel in vitro de l’activation des récepteurs odorants lors de la stimulation de la substance odorante en phase gazeuse.

En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Notre protocole permet de mesurer la détection et la discrimination des odeurs volatiles avec un panneau de récepteurs odorants. Cette méthode ouvre la possibilité de développer des biocapteurs à base de récepteurs odorants. Cette technique permet une surveillance in vitro en temps réel de l’activation des récepteurs odorants sur les molécules d’odorant en phase de vapeur.Il comble l’écart entre les approches in vitro et in vivo. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre la cinétique des événements qui conduisent à la perception des odeurs, y compris le rôle des enzymes métaboliques muqueales. Pour commencer, préparez M10 et M10 PSF selon le manuscrit.Les cellules sont cultivés en 10 millilitres de M10 PSF à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Observez le plat de culture sous un microscope à contraste de phase. Quand il atteint 100% confluent, divisez les cellules à une concentration inférieure en aspirant le média et en lavant les cellules doucement avec 10 millilitres de PBS.Puis aspirer le PBS et ajouter trois millilitres de trypsine-EDTA. Laisser réagir pendant environ une minute jusqu’à ce que les cellules se dissocient du plat. Ajouter cinq millilitres de M1

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Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

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Vertical Test Choix labyrinthe en T pour la réponse aux arthropodes odorants

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