Name: Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse combinatoire de miR-143 et miR-506 pour réguler le cycle cellulaire et l'angiogenèse dans les cellules de cancer du poumon. Cette méthode utilise la transfection cellulaire, l'extraction d'ARN et la PCR quantitative.

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<ol><li>Schafer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veternary+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review.</a> Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).</li>
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<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Les auteurs aimerait remercier John Caskey à Louisiana State University pour son aide sur l’analyse de la voie des données de séquençage de l’ARN et l’Université du Texas Southwestern Medical Center, McDermott prochaine génération séquençage central pour effectuer l’analyse de données et de séquençage des RNA. Cette recherche a été financée par le collège de pharmacie, Université de la Louisiane Monroe fonds de démarrage et les National Institutes of Health (NIH) par le biais de l’Institut National de générale Medical Science subventions 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 de P20-15 s 1.

miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.
<p class="jove_co...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

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Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique1. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire2. Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression3. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire4et CDK1 activation est essentielle pour la division cellulaire avec succès5. Plusieurs inhibiteurs de CDK ont été développés et évalués dans des essais cliniques au cours des dernières décennies, indiquant le potentiel du ciblage cdk2 dans le traitement du cancer. En fait, trois inhibiteurs de CDK ont été approuvés pour le traitement du cancer du sein récemment6,7,8,9,10. Ainsi, cdk2, et en particulier, la CDK1 et CDK4/6, sont d’un grand intérêt dans la régulation de la progression du cancer cell.
miARN (miRs) est petites, non codantes RNAs et régulateurs post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, régulation environ 30 % de tous les gènes humains11. Leur activité est basée sur la répression traductionnelle ou dégradation des ARN messagers (ARNm)12. Illustrant leur signification biologique, plus de 5 000 miARN ont été identifiées et une molécule de miRNA seul peut régler plusieurs gènes11,13. Plus important encore, miRNA expression a été associée à différentes maladies et les statuts de la maladie, y compris le cancer13. En fait, les miARN ont été caractérisées comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur, ayant la capacité à promouvoir ou à supprimer la tumeur développement et la progression de14,15. L’expression relative des miARN dans les tissus malades peut réguler la progression de la maladie ; ainsi, la tradition exogène des miARN a potentiel thérapeutique.
Cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer et plus grande que 60 % de tous les cancers du poumon non à petites cellules16,les cancers du poumon17, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 20 %18. L’utilisation de miR-143-3 p et p miR-506-3 a été récemment évaluée afin de cibler les cycles cellulaires de cellules du cancer du poumon11. miR-143 et miR-506 ont des séquences qui sont complémentarité CDK1 et CDK4/CDK6, et les effets de ces deux miRs sur cellules A549 ont été analysés. Les détails expérimentaux sont présentés et discutés dans cet article. L’expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l’apoptose ont été évalués à l’aide de différents protocoles expérimentaux et h après transfection. Nous avons utilisé des méthodes PCR (RT-qPCR) quantitatives en temps réel ainsi que l’analyse de microarray de mesurer l’expression de gènes spécifiques et séquençage de RNA de prochaine génération a servi à déterminer le gène global dysrégulation11. Cette dernière méthode identifie l’abondance relative de transcription de chaque gène avec la sensibilité élevée et de la reproductibilité, tandis que des milliers de gènes peuvent être analysés d’une seule analyse expérimentale. En outre, apoptotic analyse suite à un traitement miRNA a été réalisée et est décrite ici. Bio-informatique complété l’analyse de la voie. Présentées ici sont protocoles utilisés pour l’analyse de la thérapeutique potentielle de la combinatoire miR-143 et miR-506.
L’objectif principal du présent protocole est d’identifier les effets des miARN dans les cellules, en mettant l’accent sur le cycle cellulaire. La variété des techniques présentées ici qui s’étend de l’analyse de l’expression génique prétraduction (à l’aide de qPCR) chargé d’élaborer et de nouvelles techniques d’analyse de gène au niveau des protéines, telles que l’analyse microarray. Il est à espérer que ce rapport est utile pour les chercheurs intéressés à travailler avec les miARN. Par ailleurs, la méthodologie d’analyse en cytométrie en flux du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules est présenté.

<table><tbody><tr><td>-80 &deg ; C Congélateur</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96 puits</td><td>plaque CELLTREAT Scientific&nbsp ;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à micropuits à 96 puits&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 Cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp ; CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938c</td><td></td></tr><tr><td>Silencieux Ambion Contrôle négatif n° 1 siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de réseau d’anticorps, 2 réactions</td><td>Full Moon Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à champ clair&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Microscopique&nbsp ;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à champ clair&nbsp ; &nbsp ;</td><td>New Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Cycle Antibody Array, 2 lames</td><td>Full Moon Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD bioscience</td><td>Étapes 5.14 ; 6.13 : Utilisé pour calculer la distribution de la population en fonction de la phase du cycle cellulaire et pour calculer la distribution de la population pour l’analyse de apoptose&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Système temps réel CFX96</td> Module <td></td>optique <td>BioRad</td><td>CFX96</td></tr><tr><td>Système d’imagerie tactile Chemidoc Système d’imagerie</td><td></td>tactile <td>BioRad</td><td>Chemidoc</td></tr><tr><td>Incubateur de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Facteur de croissance réduit Matrice de membrane basale</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>AmScope&nbsp ;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L de glucose, sans pyruvate de sodium, avec L-glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)</td><td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td><td>Eppendrof</td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, absolu (200 proof), moléculaire Niveau de biologie,&nbsp ;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Mélange de nutriments (Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine, Corning</td><td>Corning</td><td>45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur Flowcytometer</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal - Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sérum bovin (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes avec bouchons à pression standard</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II Water Jacket Incubateur CO2 Solution d’héparine</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5000 U/mL)</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse horixontal</td><td>Benchtop système de laboratoire</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-143-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-506-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire recombinant humain (VEGF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)</td><td>Donneurs individuels</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td>Results : Used for bioinformatics Pathway</td><td></td></tr><tr><td>Analysis Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free</td><td>Distilled Water Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>Teinture de chargement 10X</td><td>ward’s science+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Medium M199 (avec Earle&prime ; sels de sodium, L-glutamine et bicarbonate de sodium)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Appareil photo numérique</td><td>AmScope&nbsp ;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity Software</td><td>Étape 5.15 : Logiciel alternatif pour l’analyse des distributions</td><td></td>de population du cycle cellulaire</tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UP sybr green master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT Scanner de microréseaux</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG. Nous avons utilisé la longueur d’onde du laser d’excitation à 543 nm.</td><td></td></tr><tr><td>q Couvercle adhésif optique PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Kits d’ARN rapides</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A à partir de pancréas bovin</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>Étape 7.33 : Logiciel</td><td></td>d’analyse de microréseaux</tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube Tubes à centrifuger 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger SpectraTube 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBS, 20x liquide</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse matchine à température contrôlée</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugeuse à température contrôlée matchine</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite Flacons traités pour la culture cellulaire</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96 puits à jupe complète</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso kit de synthèse d’ADNc (100 passages)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Échelle à ADN ultra basse gamme</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR réfrigérateur de laboratoire à porte pleine standard</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de mirna combinatoire des traitements pour réguler le cycle cellulaire et l’angiogenèse

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.
miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse
Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe entre miRs individuels et a...

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Cette méthode aidera à comprendre et à effectuer les techniques de laboratoire nécessaires pour identifier l’activité de deux microARN dans les cellules cancéreuses du poumon in vitro. Le cancer du poumon est la principale cause de décès lié au cancer dans le monde. Ici, nous présentons des techniques allant des méthodologies de laboratoire de base aux protocoles plus complexes, tels que l’analyse de l’expression des gènes et le microARN protéique anticorps, spécifiquement utilisé pour identifier l’effet des actions de microARN.Les méthodes suivantes nous aideront à répondre aux questions clés concernant l’effet de deux microARN, microARN 143 et microARN 506, sur la régulation du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses pulmonaires. Nous présentons différentes techniques de laboratoire, comme la transfection cellulaire, l’extraction de l’ARN, l’analyse quantitative en temps réel du PCR et du microARN. Nous espérons que notre présentation contribuera à la réalisation réussie de ces analyses.Tout d’abord, placez les cellules d’culture dans un flacon approprié suffisant pour l’extraction de l’ARN et des protéines, pour effectuer l’expression des gènes à l’aide de qPCR ou d’analyse de micro-réseau. Puis incuber pendant la nuit avec des médias complétés par 10 pour cent FBS et 1 pour cent streptocotomycine pénicilline. Le lendemain, préparez l’échantillon de microARN à la transfection en diluant le microARN 143 et le microARN 506 dans les médias à une concentration de 100 nanomolaires chacun.Sortez le flacon de l’incubateur et retirez les supports. Laver avec 1x PBS. Tous les contrôles non traités ne contiendront que des supports incomplets avec des cellules.Incuber les cellules avec des supports de transfection pendant six heures dans un incubateur. Après six heures, retirez les supports et remplacez-les par quatre millilitres de supports frais et complets. Récolter les cellules après 24 heures et 48 heures par trypsinisation.Ensuite, lavez-les deux fois avec 1x PBS dans chaque tube et retirez le surnatant. Afin d’effectuer l’extraction de l’ARN à un moment ultérieur, congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius. L’extraction de l’ARN a été effectuée à l’aide d’un kit d’ARN, suivant les instructions du fabricant.Tout d’abord, retirer les tubes de moins 80 degrés Celsius et laisser décongeler. Ajouter 300 microlitres de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane cellulaire. Ajouter un volume égal d’éthanol 100 % ultra pur.Ensuite, bien mélanger et placer dans la colonne séparée. Centrifugeuse et enlever le flux à travers. Ajouter 400 microlitres de lavage et de tampon et centrifugeuse pour enlever le tampon.Ajouter 5 microlitres de DNAse 1 avec 75 microlitres tampon de digestion VNA dans chaque échantillon, et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, lavez l’échantillon avec 400 microlitres tampon de préparation de l’ARN. Ensuite, lavez-les deux fois avec le tampon de lavage d’ARN.Maintenant, ajoutez de l’eau sans nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillez l’ARN. Mesurer la concentration d’ARN. À ce stade, deux microgrammes d’échantillon d’ARN peuvent être envoyés pour le séquençage de l’ARN.Préparer l’ADND selon le protocole décrit dans la section texte, à l’aide du thermocycleur. Préparez des solutions d’amorce avant et arrière avec de l’eau sans RNAse DNAse à une concentration de 10 micromolaires. Préparez un mélange maître pour que chaque gène soit détecté en fonction du nombre d’échantillons.Pour chaque échantillon cDNA, la quantité de réaction est selon le tableau décrit dans le texte. Placez chaque échantillon dans leurs puits respectifs. Pour qPCR, il est toujours bon de préparer un document Excel avec 96 plaques de puits, afin de garder une trace des échantillons.Pour chaque échantillon et gène analysé, effectuer leur réaction en triplicates, ou du moins en double. Sceller la plaque de plastique avec un scellant en plastique transparent et optiquement transparent. Évitez de toucher la fine couche de plastique avec les doigts, car cela peut produire un faux signal.Faites tourner rapidement la plaque pour mélanger tous les reagents au fond de leurs puits. Ensuite, exécutez la plaque d’échantillon à l’aide d’une machine PCR quantitative en temps réel. Obtenez les valeurs CT générées par la machine qPCR et analysez l’expression relative des gènes.Transfect les cellules comme décrit dans la section précédente de cette vidéo. Récoltez les cellules de chaque échantillon dans des tubes stériles séparés de 15 millilitres pour la trypsinisation. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, par centrifugation à 751G pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant.Suspendez et brisez la palette en ajoutant 200 microlitres glacés 1x PBS à travers une pipette. Ajouter deux millilitres d’éthanol glacé à 70 pour cent, laisser tomber au tube, tout en vortexant doucement le tube pour fixer les cellules. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante et les placer en quatre degrés Celsius pendant une heure.Retirer les tubes de quatre degrés Celsius et de centrifugeuses. Ajouter 2 ml de PBS et vortex glacés, puis retirer le supernatant par centrifugation. Ajouter 500 microlitres de 1x PBS contenant de l’iodure de propidium et de la ribonuclease A avec une concentration de 50 et 200 microgrammes par millilitre, respectivement, dans chaque échantillon, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Transférez des échantillons dans des tubes appropriés, à l’protection de la lumière, et exécutez sur le cytomètre d’écoulement. Cette expérience est d’identifier l’expression de toutes les protéines de la voie du cycle cellulaire modifiées par le traitement par microARN. Recueillir des échantillons de protéines selon la procédure décrite dans la section transfection, et quantifier avec l’analyse BCA.Retirez les glissières de moins quatre degrés Celsius une heure avant l’expérience pour amener à la température ambiante et pour éliminer l’humidité. Prenez 70 microgrammes d’échantillons de protéines et préparez des diapositives d’échantillons selon les instructions du fabricant, qui sont également décrites étape par étape dans la section texte. Ici pour noter, le lavage approprié des glissières avec de l’eau déionisée ultra-pure est une autre étape importante, car cela aidera à réduire l’arrière-plan des diapositives.En outre, il est très essentiel dans cette expérience de ne pas assécher les diapositives de l’échantillon jusqu’à l’étape finale. Enfin, numérisez la diapositive à l’aide d’une machine à micro-tableau et analysez les données. L’analyse qPCR des échantillons traités par microARN a eu lieu pour déterminer l’expression génétique de CDK1, CDK4 et CDK6.Ces gènes régulent le cycle cellulaire des cellules normales et cancéreuses, et ont été ciblés comme un moyen d’inhiber la progression tumorale. Les données ont démontré l’effet downregulatory de ces gènes dus au traitement avec le microARN 143 et 506. Les données de distribution de cycle cellulaire de la cytométrie de flux ont démontré une augmentation de population dans la phase G0 et G1, et une diminution de population dans la phase de S due à l’effet du traitement combinatorial du microARN 143 et 506.L’analyse spécifique du micro-tableau du cycle cellulaire a détecté des changements d’expression des protéines d’environ 60 gènes. La carte thermique représentée indiquait une downregulation au niveau protéique de plusieurs gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire et à la prolifération, tels que CDK2, Helen 1 et 3, RE2F1. En revanche, les protéines couramment reconnues par leur effet inhibiteur cultivé ont été régulées.Bien que les résultats soient semi-quantitatifs et qu’une analyse plus approfondie soit nécessaire, l’analyse des micro-réseaux donne un aperçu rapide de l’activité de la voie. Nous croyons qu’après avoir regardé cette vidéo, vous serez en mesure d’effectuer des expérimentations fondamentales, ainsi complexes, en laboratoire qui vous aideront à identifier l’activité microARN dans les cellules.

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La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Cette vidéo décrit le protocole d’extraction d’ARN à partir de cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN. Cette approche peut être utilisée pour identifier une activité de traitement combinatoire des miARN dans l’arrêt du cycle cellulaire et l’angiogenèse.

Dosage de l’extraction d’ARN : une méthode pour extraire de l’ARN de cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN

miARN ou microARN sont des régulateurs clés de la progression du cycle cellulaire. Cette vidéo décrit une analyse du cycle cellulaire basée sur la cytométrie en flux de cellules cancéreuses du poumon transfectées avec des miARN, afin d’étudier l’effet des miARN sur la régulation du cycle cellulaire. L’inhibition de la prolifération en arrêtant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer.

Analyse du cycle cellulaire : une approche pour étudier la régulation du cycle cellulaire des cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN

Cette vidéo décrit la technique permettant d’étudier l’expression des protéines dans les cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN en utilisant des microréseaux d’anticorps pour mesurer l’expression de gènes spécifiques. Dans le protocole présenté, nous effectuons des microréseaux d’anticorps pour l’identification de l’activité d’un traitement combinatoire par miARN dans l’arrêt du cycle cellulaire et l’angiogenèse.

Microréseaux d’anticorps : une technique pour étudier l’expression protéique de cellules cancéreuses du poumon traitées par des miARN

Cette vidéo démontre l’administration in vivo d’inhibiteurs de miARN en tant qu’agents thérapeutiques contre la croissance tumorale dans des modèles murins orthotopiques. L’administration intratumorale d’inhibiteurs de miARN synthétiques ou antagonistes leur permet de se lier et d’inhiber les miARN endogènes, provoquant ainsi une régulation positive de l’ARNm et la suppression de la croissance tumorale.

Modélisation du traitement intratumoral avec des inhibiteurs de miARN : une méthode d’analyse de l’effet des inhibiteurs de miARN sur la croissance tumorale dans un modèle murin

Un protocole pour in vitro induction de transition endothéliales-mésenchymateuse (EndMT), qui est utile pour étudier les voies de signalisation cellulaires impliqués dans EndMT, est décrite. Dans ce modèle expérimental, EndMT est induite par le traitement avec le TGF-β dans les cellules endothéliales MS-1.

Analyse moléculaire de Transition endothéliales-mésenchymateuses induite par le Transforming Growth Factor-β de signalisation

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Découvrez l'analyse combinatoire de miR-143 et miR-506 pour réguler le cycle cellulaire et l'angiogenèse dans les cellules de cancer du poumon. Cette méthode utilise la transfection cellulaire, l'extraction d'ARN et la PCR quantitative.

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

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