Établissement et caractérisation de trois lignées cellulaires résistantes à l'adénocarciane pulmonaire résistante à l'afatinib PC-9 développées avec des doses croissantes d'Afatinib

L’étude de nouveaux mécanismes de résistance acquis contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques plus efficaces et plus sûres chez les patients atteints d’un cancer résistant aux agents cancéraux et résécable. Malheureusement, les cas où la résistance aux médicaments ne s’est pas développé ne sont généralement pas signalés. Cette méthode d’escalade de la dose stepwise est considérée comme la technique la plus fiable pour obtenir des cellules de résistance acquise.

Pour déterminer la concentration appropriée de résistance à l’afatinib, culture pc-9 cellules dans le milieu de croissance dans un plat de 10 centimètres de culture cellulaire traitée à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Resuspendez les cellules PC-9 à une concentration moyenne de quatre fois 10 à 4 par millilitre de concentration moyenne de croissance, et placez les cellules à 50 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une microplaque de 96 puits. Après une incubation d’une nuit dans l’incubateur de culture cellulaire, traiter les cellules avec 50 microlitres de solution d’afatinib par puits, à six répétitions des concentrations indiquées, et après une incubation de 96 heures dans l’incubateur de culture de réforme, ajouter 15 microlitres de colorant MTT à chaque puits.

Après quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, ajouter 100 microlitres de solution solubilisation/arrêt à chaque puits, et remettre la plaque à l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 570 nanomètres sur un lecteur de microplaque. Pour une exposition continue à l’afatinib, culture pc-9 cellules dans les plats P-100 contenant 10 millilitres de milieu de croissance jusqu’à ce que les cellules atteignent la sous-confluence.

Transférer les cultures subconfluentes dans trois nouveaux plats P-100 de neuf millilitres de milieu de croissance par plat de culture initial, et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, ajouter 0,1 nanomolaire, soit 1/10 de la concentration inhibitrice semi-maximale de l’afatinib, à chaque ensemble de trois plats de culture. Lorsque les cellules traitées à l’afatinib deviennent subconfluentes, utilisez une pipette d’un millilitre pour bien mélanger les cultures et transférez un millilitre de cellules de chaque plat à neuf millilitres de milieu de croissance frais dans les nouveaux plats P-100.

Ajouter des concentrations d’afatinib de 10 % à 20 % plus élevées aux nouvelles cultures, augmentant la concentration d’afatinib par escalade de la dose stepwise chaque fois que les cultures atteignent la sous-confluence sur une période de 10 à 12 mois. Quand une concentration d’afatinib d’un micromolaire est atteinte, exécutez l’essai de MTT comme démontré pour confirmer que les cellules ont développé l’afatinib-résistance. Déterminer la courbe de croissance des lignées cellulaires, la culture parentale PC-9 et les trois lignées cellulaires résistantes à l’afatinib dans le milieu de croissance dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.

Resuspendez les cellules de chaque culture à une concentration moyenne de cinq fois 10 à 3 par millilitre de concentration moyenne de croissance, et placez 12 répliques de 100 microlitres de chaque population cellulaire par puits dans une microplaque de 96 puits. Effectuez ensuite l’analyse MTT les jours zéro, un, deux, trois, cinq et sept de la culture comme démontré, et tracer les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Pour identifier les altérations du récepteur du facteur de croissance épidermique, ou expression de l’ADN génomique EGFR, par l’analyse inverse de la chaîne de polymése transcriptase, isoler l’ADN génomique de la culture cellulaire d’intérêt à l’aide d’un kit de purification de l’ADN selon les instructions du fabricant.

Mesurer la concentration de concentrations de 25 nanogrammes-microlitres de l’ADN génomique isolé sur un spectrophotomètre. Ensuite, amplifiez 50 nanogrammes d’ADN génomique à l’aide d’un mélange maître vert SYBR, et analysez les résultats à l’aide d’un système de détection de réaction en chaîne de transcriptase inverse à base de fluorescence. Pour identifier les altérations de l’expression génomique de l’ADN EGFR par séquençage, amplifiez l’ADN génomique à l’aide d’amorces spécifiques pour les exons EGFR 19 à 21.

Ensuite, purifier les produits PCR amplifiés à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant, et séquencer les amplicons. Pour identifier des changements dans l’expression épidermique de protéine de récepteur de facteur de croissance par l’analyse occidentale de tache, traitez les cellules avec l’afatinib pendant 24 heures. Après 24 heures, laver les cultures cellulaires deux fois avec cinq millilitres de PBS glacé par culture par lavage.

Lyse les cellules dans le tampon d’essai de radioimmunoprecipitation, complété avec le cocktail inhibiteur de protéase de 1% et le cocktail d’inhibiteurs de phosphatase deux et trois pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, recueillir les lysates par centrifugation. Utilisez l’analyse de l’acide bicinchoninique pour déterminer la concentration en protéines des échantillons de lysate.

Ajustez les échantillons de protéines à 0,5, ou un microgramme par concentration de microlitres, dans un tampon d’échantillon de 4 X, et faites bouillir les échantillons à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour l’analyse occidentale des taches des échantillons, assemblez des plaques de verre et des entretriers nettoyés à l’éthanol, et chargez le moule avec un gel polyacrylamide de 8 % avec les suppléments expérimentaux appropriés. Pendant que le gel est polymérisant, ajoutez la solution de gel d’empilage à un moule approprié, insérez le peigne, et permettez au gel d’empilage de polymériser pendant 20 à 30 minutes à température ambiante.

Lorsque les deux gels sont polymérisés, placez-les dans l’appareil d’électrophoresis et remplissez le réservoir d’un tampon en marche. Chargez ensuite un volume de 20 à 30 microlitres de chaque échantillon de protéines dans chaque puits et exécutez le gel à 180 volts. Arrêter l’électrophorèse après environ 60 minutes, une fois que le front de teinture s’écoule du gel, et laver le gel avec tris tamponné salin, complété par du tween, pendant une à deux minutes.

Transférer les protéines sur une membrane de fluorure polyvinylidene par ballonnement semi-sec pendant une heure et demie à un courant constant de 300 milliampes. Bloquez la membrane avec du lait sec non gras dilué avec une solution saline tris-tamponnée plus tween pendant une heure à température ambiante. Ensuite, sondez la membrane avec les anticorps appropriés d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, lavez les membranes avec trois lavages de 10 minutes de solution saline fraîche tamponnée par lavage avant d’exposer la membrane à l’anticorps secondaire approprié pendant une à une heure et demie à température ambiante. Lavez ensuite la membrane cinq fois avec de la solution saline fraîche tamponnée par lavage et exposez la membrane à une solution améliorée de chimioluminescence pour la visualisation du signal à l’aide de films. Ici, la diminution observée dans la prolifération cellulaire des cellules parentales PC-9 en réponse à l’augmentation des concentrations d’afatinib est illustrée, confirmant que les cellules PC-9 sont sensibles à l’exposition à l’afatinib.

Cependant, aucune des trois lignées cellulaires résistantes à l’afatinib ne démontre une suppression de la prolifération cellulaire sous exposition à l’afatinib. Les lignées cellulaires résistantes à l’afatinib présentent des courbes de croissance significativement plus lentes que les cellules parentales PC-9. Les cellules résistantes à l’afatinib expriment des niveaux significativement plus élevés d’ADN génomique EGFR et d’expression des protéines EGFR que les cellules parentales PC-9.

Le séquençage EGFR démontre que les cellules PC-9 présentent 15 suppressions de paires de base dans l’exon 19 d’EGFR, et le type sauvage EGFR dans l’exon 20. Cependant, les cellules de la lignée cellulaire résistantes à l’afatinib présentent une amplification de type sauvage EGFR exon 19. Les cellules résistantes à l’afatinib trois cellules contiennent les mêmes 15 suppressions de paire de base dans l’exon 19 d’EGFR que dans les cellules PC-9, mais une mutation ponctuelle dans T790M est observée dans l’exon 20 d’EGFR.

La croissance cellulaire peut devenir assez lente lorsque la concentration de l’inhibiteur est proche de la valeur IC-50. Ne discutez pas de culture, car la cellule continuera à proliférer progressivement. Ces stratégies ont été élaborées pour imiter les conditions dans lesquelles les patients atteints de cancer développent une résistance cliniquement pertinente pour évaluer les mécanismes de résistance acquis et pour développer des stratégies thérapeutiques sûres et efficaces.