Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l'injection intraductale de l'adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d'organe d'événements oncogènes d'une manière contrôlée temporellement.

Ce protocole aidera les chercheurs à générer un nouveau type de modèle de souris pour récapituler le développement du cancer du sein humain à partir de différents sous-ensembles de cellules épithéliales mammaires. Cette technique permet aux chercheurs de générer des modèles de souris atteintes du cancer du sein dans les tissus de stade de développement d’une manière spécifique au type cellulaire et sans avoir besoin d’une reproduction intensive de la souris. Pour commencer cette procédure, générer, maintenir et anesthésier les souris floxées telles que décrites dans le protocole de texte.

Amenez la souris dans une zone séparée de l’endroit où la chirurgie doit être effectuée. Après avoir confirmé l’anesthésie en effectuant une pincée d’orteil, injectez Meloxicam comme analgésie sous-cutanée à une dose de cinq milligrammes par kilogramme pour se préparer à l’intervention chirurgicale. Exposer le site chirurgical mamelon en appliquant plusieurs gouttes de crème d’épilation.

Retirer la crème excessive et les cheveux lâches à l’aide de serviettes en papier souple. Le rasage n’est pas recommandé pour éviter les dommages aux mamelons. Désinfecter le site chirurgical avec des iodophors d’abord suivi de 70% d’alcool et se terminer par une application finale d’iodophors gommage.

Faites ceci dans un mouvement circulaire du centre de la zone de travail vers la périphérie utilisant une éponge de gaze ou un applicateur coton-incliné. Répétez le cycle trois à quatre fois. Utilisez des techniques aseptiques tout au long de l’intervention chirurgicale.

Faire un site d’incision sur la peau à une longueur d’environ un centimètre entre les deux quatrièmes glandes mammaires inguinales. Séparez soigneusement le rabat cutané du péritoine pariétal afin de visualiser l’arbre ductal mammaire. Tenez soigneusement le mamelon avec les forceps des horlogers pour enlever le mamelon extérieur sans couper la peau à proximité à l’aide d’un ciseaux de microdissection.

Chargez environ trois à cinq microlitres du mélange d’injection de Cre-adénovirus dans une seringue Hamilton de 25 microlitres avec une aiguille de moyeu métallique de calibre 33 fixée. Estimer le volume du mélange d’injection dans la seringue en fonction du colorant bleu inclus dans le mélange. Maintenez doucement le bord du rabat cutané à l’huile fine et incurvée et injectez lentement le mélange d’injection d’adénovirus Cre dans le mamelon tout en surveillant la propagation du colorant bleu dans l’arbre ductal mammaire.

Maintenir le taux d’injection le plus lentement possible afin d’éviter les dommages au lumen ductal. Une injection intraductrice réussie est indiquée par des fluides injectés se propageant dans tout l’arbre ductal sans fuite dans le compartiment stroma. Retirez doucement l’aiguille du mamelon pour éviter toute fuite du liquide injecté.

Examiner le côté distal de la glande mammaire ou la zone environnante du mamelon injecté. Le colorant diffusant dans le stroma voisin comme montré ici indique une injection mammaire de garniture de graisse plutôt qu’une injection intraductal réussie. Fermez les plaies chirurgicales dans la peau avec des pinces à plaies.

Retirez la souris de l’anesthésie et placez-la sur un coussin chauffant à l’intérieur d’une cage propre pour la récupération. Surveiller le développement de la tumeur mammaire tel que décrit dans le protocole de texte. Les souris femelles les plus jeunes pour lesquelles l’injection intraductrice peut être effectuée avec succès sont celles à environ trois semaines d’âge.

Bien que pour la plupart des expériences mammaires d’induction de tumeur, les jeunes souris femelles adultes soient employées. L’injection intraductrice avec un plus grand volume du mélange d’injection peut être effectuée chez les souris femelles au début à la mi-gestation pour cibler les cellules alvéolaires. Pour cibler différentes sous-populations de cellules épithéliales mammaires pour l’induction mammaire de tumeur, cre-adénovirus sous le contrôle de différents promoteurs spécifiques de cellules épithéliales mammaires ont été utilisés pour l’injection.

Par exemple, le cré-adénovirus sous le contrôle du promoteur de la kératine 8 a été utilisé pour cibler les cellules épithéliales mammaires luminaires. Le cré-adénovirus sous le contrôle du promoteur de kératine 5 a ciblé la lignée basale menant au marquage génétique des cellules épithéliales mammaires basales seulement. Pour une femelle P53 floxed homozygous souris avec un journaliste ROSA26-YFP, l’injection intraductrice de kératine 8 Cre-adénovirus a conduit au développement de tumeurs mammaires plusieurs mois après l’injection.

En raison de l’inclusion du journaliste conditionnel de R26-Y, les cellules épithéliales de tumeur ont été typiquement marquées par YFP et pourraient être détectées par cytométrie de flux. Les cellules peuvent être enrichies par le tri du flux des cellules positives YFP pour une analyse plus approfondie. Les choses les plus importantes à retenir lors de la tentative de cette procédure sont d’utiliser un petit volume d’injection, injecter lentement, et aussi retirer l’aiguille lentement.

Après cette procédure, on peut surveiller la progression des cellules épithéliales mammaires positives ciblées de YFP aux étapes pré-malignes et cancéreuses par cytométrie d’écoulement ou coloration de co-immunofluorescence de la glande injectée. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour étudier les cellules d’origine du cancer du sein, comment elles réagissent aux différents événements autogéniques et comment elles progressent vers les cellules cancéreuses. L’adénovirus et l’aiguille à injection sont potentiellement dangereux.

Par conséquent, il faut toujours porter des gants et utiliser des aiguilles et des seringues de sécurité lors de l’injection intraductrice.