Name: Modélisation du cancer du sein par injection intraductale dadénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Découvrez la modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris. Cette méthode permet une manipulation spécifique des événements oncogéniques sans élevage complexe.

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Ce travail a été soutenu par national Institutes of Health (NIH) subvention R01 CA222560 et par department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Brigham and Women's Hospital.
1. Génération et entretien de souris floxed
<ol><li>Obtenir le knock-out conditionnel floxed (p. ex., Trp53tm1Brn [appelé Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) ou les lignes de souris knock-in conditionnelles (p. ex., Gt(ROSA)26Sortm1 (Pik3ca-H1047R)Egan) du référentiel du Jackson Laboratory (JAX) ou du NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). En outre, pour faciliter la chasse aux CME qui subissent une recombinaison à médiation crécétique, une ligne conditionnelle de Cre-reporter peut également être obtenue auprès de JAX (p. ex. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [appelé R26Y]).</li>
	<li>Reproduire Des souris homozygous De Race Trp53L/L avec des souris journaliste homozygotes R26Y ou avec des souris homozygous portant les allèles de journaliste R26Y et tout KO conditionnel ou knock-in supplémentaire pour différents modèles de souris, pour obtenir une progéniture hétérozygote F1 masculine et féminine.</li>
	<li>Intercross hétérozygous Hétéros F1 souris mâles et femelles pour obtenir F2 composés souris femelles qui sont homozygous pour chaque allèle (comme des souris expérimentales), ainsi que R26Y-seulement femelles homozygous (comme souris témoins). Génotype F2 souris basées sur les amorces PCR et les conditions de cyclisme énumérées ci-dessous, en mettant en place deux réactions PCR standard de 20 L (à l'aide de Taq 5X Master Mix) dans deux tubes PCR différents, l'un avec les amorces R26Y et l'autre avec le Trp53L d'apprêt. Utilisez des souris adultes (généralement autour de 2 à 4 mois) pour toute la reproduction.<ol>
<li>Pour R26Y, effectuer pcR à 94 oC pendant 3 min, puis à 94 oC pour 30 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pendant 1 min pendant 35 cycles, suivi de 72 oC pendant 3 min, et de maintenir à 14 oC. Utilisez les amorces (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG ATG ATG. REMARQUE: Une seule bande PCR de 250 bp indique un homozygote R26Y, une seule bande PCR de 500 bp indique un type sauvage (WT), et deux bandes PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indiquent un heterozygote R26Y (Figure 1A). Pour Trp53L, effectuer pcR à 94 oC pendant 3 min, puis à 94 oC pour 30 s, 60 oC pour 30 s, et 72 oC pendant 1 min pendant 35 cycles, suivi de 72 oC pendant 3 min, et de maintenir à 14 oC. Utiliser les amorces (i) p53F2-10 1F : CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. REMARQUE : Une seule bande PCR de 370 pb indique un Homozygote Trp53L/L, une seule bande PCR de 288 pb indique un Trp53/ WT, et deux bandes PCR (WT : 288 bp, Trp53L: 370 bp) indiquent un Trp53L / Heterozygote (Figure 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation préopératoire
<ol><li>Autoclave tous les outils chirurgicaux 1 jour avant la chirurgie.</li>
	<li>Préparer 0,1 % de bleu bromophénol dans de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et le conserver à 4 oC. Diluer l'Ad-Cre qui sera utilisé pour l'injection intraductale dans le milieu DMEM avec 0,01 M CaCl2 et bleu bromophénol à un rapport de 1:10 (c.-à-d., le mélange d'injection). REMARQUE : L'Ad-Cre utilisé ici a été obtenu auprès du noyau viral vectoriel de l'Université de l'Iowa, avec un stock de taquet viral de 10à10 pfu/mL.</li>
	<li>Anesthésiez la souris femelle (génération F2 telle que décrite à l'étape 1.2, âge allant de 3 à 4 semaines d'âge à l'adulte) à l'aide d'une chambre isoflurane et appliquez la pommade pour les yeux. Pendant la procédure, anesthésier la souris en permanence en s'assurant qu'elle inhale 1% - 2,5% isoflurane en oxygène. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie au moins toutes les 15 min en effectuant une pincée d'orteil. Surveillez attentivement la souris pour tout changement de la fréquence respiratoire, en ajustant le niveau d'isoflurane en conséquence, si nécessaire.</li>
	<li>Injecter méloxicam comme analgésie sous-cutanée à une dose de 5 mg/kg, avant l'intervention chirurgicale.</li>
	<li>Exposer le site chirurgical mamelon en appliquant plusieurs gouttes de crème d'épilation; enlever la crème excessive et les cheveux lâches à l'aide d'essuie-tout doux. REMARQUE : Effectuez cette étape dans une zone séparée de l'endroit où la chirurgie doit être effectuée. Le rasage n'est pas recommandé afin d'éviter des dommages aux mamelons. Faites preuve de prudence pour éliminer l'agent déplaisé chimique en temps opportun. Laisser l'agent allumé trop longtemps peut entraîner des brûlures chimiques sur la peau</li>
	<li>Désinfecter le site chirurgical avec des iodophors d'abord, suivi de 70% d'alcool, et se terminer par une application finale d'iodophors de gommage. Faites ceci dans un mouvement circulaire du centre de la zone de travail vers la périphérie utilisant une éponge de gaze ou un applicateur coton-vers. Répétez le cycle 3x-4x.</li>
</ol>3. Injection intraductale
<ol><li>Utilisez des techniques aseptiques tout au long de l'intervention chirurgicale.</li>
	<li>Faire un site d'incision sur la peau à une longueur de 1 cm entre les deux quatrièmes GM inguinal (figure 2). Séparez soigneusement le rabat cutané (avec le MG) du péritoine pariétal afin de visualiser l'arbre ductal mammaire.</li>
	<li>Tenez soigneusement le mamelon avec les forceps de l'horloger et retirez le mamelon extérieur sans couper la peau voisine, à l'aide d'un ciseau à micro-dissection.</li>
	<li>Chargez le mélange d'injection Ad-Cre dans une seringue Hamilton de 25 l avec une aiguille de moyeu métallique de 33 G fixée. Estimer le volume du mélange d'injection dans la seringue à partir du colorant bleu inclus dans le mélange. REMARQUE : Utilisez un volume plus faible (p. ex., 3 L) lors de l'injection dans des GM de femelles âgées de 3 à 4 semaines et un plus grand volume (p. ex., 10 L) lors de l'injection dans des GM de femelles qui lactent.</li>
	<li>Tenez doucement le bord de l'aileron de la peau avec une pince fine incurvée et injectez le mélange d'injection Ad-Cre lentement dans le mamelon, en attendant la surveillance de la propagation de la teinture bleue dans l'arbre canalaire mammaire. Maintenir le taux d'injection aussi bas que possible pour éviter des dommages au lumen canalaire. REMARQUE : Le fluide injecté (comme illustré par le colorant bleu bromophenol inclus) se propageant dans l'arbre canalaire entier sans fuite dans le compartiment stromal indique une injection intraductale réussie.</li>
	<li>Retirez délicatement l'aiguille du mamelon pour éviter toute fuite du liquide injecté.</li>
	<li>Examiner le côté distal (c.-à-d., loin du mamelon) du MG ou la zone environnante du mamelon injecté. Notez que le colorant bleu enflé (c.-à-d., colorant diffusant dans le stroma voisin) indique une injection de garniture de graisse mammaire plutôt qu'une injection intraductale réussie.</li>
	<li>Fermez les plaies chirurgicales (à partir de l'étape 3.2) dans la peau avec des pinces de plaie.</li>
</ol>4. Soins postopératoires
<ol><li>Retirez la souris de l'anesthésie et placez-la sur un coussin chauffant à l'intérieur d'une cage propre pour la récupération.</li>
	<li>Administrer méloxicam sous-cutané à 5 mg/kg à nouveau, 24 h après la chirurgie.</li>
	<li>Surveillez l'état général de l'animal et recherchez des signes d'infection sur le site d'incision pendant 5 jours.</li>
	<li>Les pinces de blessure sont enlevées de 7 à 10 jours après la chirurgie.</li>
</ol>5. Suivi du développement de la tumeur mammaire
<ol><li>Surveiller les souris injectées deux fois par semaine par palpation pour tout signe de développement de la tumeur mammaire.</li>
	<li>Une fois que la tumeur est palpable, surveillez la souris quotidiennement et mesurez la taille de la tumeur jusqu'à ce qu'elle atteigne le point final expérimental, tel que déterminé par la taille (par exemple, atteignant 10%-15% du poids corporel de la souris) ou l'état (par exemple, ulcéré ou nécrotique) de la tumeur, ou par le l'état de santé général de la souris (p. ex., comateux, moribond).</li>
	<li>Euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, suivie d'une méthode secondaire (p. ex., dislocation cervicale).</li>
	<li>Isolez les tissus de la tumeur mammaire et analysez-les par cytométrie du débit, immunofluorescence ou profilage d'expression (p. ex., par séquençage de l'ARN [RNAseq] ou microarray), tel que décrit précédemment12.</li>
	<li>Effectuer l'analyse cytométrique du débit en gating pour les cellules négrées de lignée (Lin-: négatif pour les marqueurs de lignée CD45 [marqueur de leucocyte], CD31 [marqueur cellulaire endothélial] et TER119 [marqueur érythrocyte]), et analyser les cellules de la tumeur en fonction de leur l'expression de YFP, CD24 et CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le succès de cette approche pour induire des tumeurs mammaires de différentes sous-populations de MECs repose non seulement sur le choix des promoteurs appropriés de type cellulaire -spécifique (pour conduire l'expression de Cre) mais également sur la procédure d'injection intraductale elle-même. L'idée derrière cette approche est que les virus Injectés Ad-Cre sont conservés dans l'arbre ductal, qui est une structure cachée avec lumen, et donc, seuls les MEC sont exposés aux virus et sont infectés par Ad-Cre. En raison d...

L'objectif global de cette méthode est de développer une nouvelle approche de modélisation du cancer du sein basée sur une injection intraductale d'Ad-Cre dans la souris MG. L'approche génétique basée sur la recombinaison Cre/loxP a été largement utilisée pour modéliser le cancer du sein humain chez la souris. La première génération de modèles de souris à base de Cre/loxP sur le cancer du sein est générée par l'utilisation de souris transgéniques exprimant cre sous le contrôle de promoteurs spécifiques au MEC (p. ex., MMTV-Cre pour les MEC suspicieux et une partie des MEC basiques, Wap-Cre et Blg-Cre pour les progéniteurs luminal et les MEC alvéolaires, K14-Cre pour les cimeaux et une partie des MECs luminal1,2,3,4,5)6, 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Cependant, bien que ces lignes transgéniques Cre permettent le contrôle spatial de l'expression de Cre (c.-à-d., dans différents sous-ensembles de MECs), elles ne permettent pas le contrôle temporel de l'expression de Cre et de la manipulation génétique Cre/loxP-négociée. La deuxième génération de modèles de souris à base de Cancer du sein à base de Cre/loxP utilise des approches inductibles d'activité/expression cre (p. ex., l'utilisation de la fusion des récepteurs Cre-estrogen [CreER], qui ne peut induire la recombinaison Cre/loxP qu'à l'administration du tamoxifène) et en conséquence, ces outils génétiques permettent à la fois des contrôles spatiaux et temporels de l'activation d'événements oncogènes dans les MEC (p. ex., K8-CreER- et K5-CreER-modèles basés)10,11,12 . Dans les deux générations de modèles de souris de cancer du sein, comme les promoteurs utilisés pour conduire l'expression Cre ou CreER (par exemple, Krt8, Krt5) peuvent également être actifs dans les cellules épithéliales d'autres organes (c.-à-d., ils sont de type cellulaire spécifique, mais pas spécifique à l'organe) ou ont une expression qui fuit dans les types de cellules autres que les cellules épithéliales (par exemple, MMTV, qui a une activité qui fuit dans les cellules hématopoïétiques de moelle osseuse), ces approches peuvent conduire au développement de cancers indésirables (s) dans d'autres organes.s). Si ces cancers inattendus causent la létalité chez les souris touchées, le but initial de la modélisation du cancer du sein chez ces souris peut être interdit (p. ex., les événements oncogènes entraînés par MMTV-Crepeuvent entraîner des tumeurs malignes hématopoïétiques et la mort prématurée des souris. , en raison de la fuite du promoteur MMTV dans les cellules hématopoïétiques)4.
Ici nous rapportons une approche de modélisation de cancer du sein chez les souris qui permet la manipulation de type cellulaire- et d'organe-spécifique des événements oncogènes d'une manière temporellement commandée. Cette approche est basée sur une injection intraductale d'Ad-Cre dans les MG de souris (et est, par conséquent, spécifique à l'organe). L'expression de cre peut être contrôlée en utilisant différents promoteurs spécifiques à la sous-population MEC intégrés dans le vecteur adénoviral (par exemple, Krt8 pour les MEC slumineux, Krt5 pour les MEC basiques, réalisant ainsi une spécificité de type cellulaire). L'induction du cancer chez les GM peut être contrôlée temporellement par une injection d'Ad-Cre chez des souris à différents âges, à partir de 3-4 semaines d'âge (pubertal) jusqu'au stade adulte.

<table><tbody><tr><td>Aiguille de calibre 33</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>point style 3 blunt</td></tr><tr><td>7mm Reflex Clip</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adénovirus, Ad-K5-Cre</td><td>Université de l’Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adénovirus, Ad-K8-Cre</td><td>Université de l’Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Préparation à 70 % d’utilisation</td></tr><tr><td>CD31 biotinylé</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45 biotinylé</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinylé TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Lotion décapante</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Hamilton seringue</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0,025 mL</td></tr><tr><td>Iodophores</td><td>Bétadine</td><td></td><td>10 % Povidone-iode</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2.5 %</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Lubrifiant Pommade pour les yeux</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de micro-dissection</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Pince d’horloger</td></tr><tr><td>Pince à épiler de micro-dissection</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Le cancer du sein est une maladie hétérogène, peut-être due à des interactions complexes entre différentes cellules d'origine et des événements oncogènes. Les modèles de souris jouent un rôle déterminant dans l'obtention d'un aperçu de ces processus complexes. Bien que de nombreux modèles de souris ont été développés pour étudier les contributions de divers événements oncogènes et les cellules d'origine à la tumorigénèse du sein, ces modèles ne sont souvent pas de type cellulaire ou d'organe spécifique ou ne peut pas induire l'initiation de la tumorigenesis mammaire dans un manière contrôlée temporellement. Ici nous décrivons un protocole pour produire un nouveau type de modèles de souris de cancer du sein basés sur l'injection intraductale de cre-exprimant l'adénovirus (Ad-Cre) dans les glandes mammaires de souris (MGs). En raison de l'injection directe d'Ad-Cre dans les conduits mammaires, cette approche est spécifique MG, sans aucune induction non désirée de cancer dans d'autres organes. La procédure d'injection intraductale peut être effectuée chez les souris à différents stades de leur développement MG (donc, il permet le contrôle temporel de l'induction du cancer, à partir de 3-4 semaines d'âge). La spécificité de type cellulaire peut être atteinte en utilisant différents promoteurs de type cellulaire spécifique pour conduire l'expression Cre dans le vecteur adénoviral. Nous montrons que les cellules épithéliales mammaires luminaires et basiques (MEC) peuvent être étroitement ciblées pour la manipulation génétique à base de Cre/loxP par une injection intraductale d'Ad-Cre sous le contrôle du promoteur De kératine 8 ou Kératine 5, respectivement. En incorporant un journaliste conditionnel DeC (par exemple, Cre/loxP-inductcible Rosa26-YFP journaliste), nous montrons que les MEC ciblés par Ad-Cre, et les cellules tumorales dérivées d'eux, peuvent être tracés en suivant les cellules reporter-positives après injection intraductale.

Les résultats de génotypage PCR représentatifs pour les allèles R26Y et Trp53L sont présentés à la figure 1.
Bien que, en principe, tous les 10 GM peuvent être soumis à la procédure d'injection intraductale, pratiquement, les deux quatrièmeS inguinalsont sont généralement sélectionnés pour l'injection, en raison de leur accessibilité plus facile et de plus grandes taill...

Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l'injection intraductale de l'adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d'organe d'événements oncogènes d'une manière contrôlée temporellement.

Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Ce protocole aidera les chercheurs à générer un nouveau type de modèle de souris pour récapituler le développement du cancer du sein humain à partir de différents sous-ensembles de cellules épithéliales mammaires. Cette technique permet aux chercheurs de générer des modèles de souris atteintes du cancer du sein dans les tissus de stade de développement d’une manière spécifique au type cellulaire et sans avoir besoin d’une reproduction intensive de la souris. Pour commencer cette procédure, générer, maintenir et anesthésier les souris floxées telles que décrites dans le protocole de texte.Amenez la souris dans une zone séparée de l’endroit où la chirurgie doit être effectuée. Après avoir confirmé l’anesthésie en effectuant une pincée d’orteil, injectez Meloxicam comme analgésie sous-cutanée à une dose de cinq milligrammes par kilogramme pour se préparer à l’intervention chirurgicale. Exposer le site chirurgical mamelon en appliquant plusieurs gouttes de crème d’épilation.Retirer la crème excessive et les cheveux lâches à l’aide de serviettes en papier souple. Le rasage n’est pas recommandé pour éviter les dommages aux mamelons. Désinfecter le site chirurgical avec des iodophors d’ab

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Dans cet article, nous discutons de la façon d’établir un modèle de cancer du sein chez les souris femelles en injectant des cellules cancéreuses du sein dans le coussinet adipeux mammaire. L’exemple de protocole illustre l’injection orthotopique.

Injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire : établissement du cancer du sein chez la souris

Cette vidéo décrit une technique d’injection intracanalaire où nous administrons un mélange d’injection dans les canaux des glandes mammaires de souris.

Injection intracanalaire : administration du mélange d’injection dans les canaux de la glande mammaire de la souris

Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

L'activation de mutations latentes avec l'adénovirus Cre dans les résultats du système canalaire mammaire dans un cancer cliniquement pertinente du sein métastatique. L'incorporation d'un promoteur YFP permet de suivre les cellules tumorales métastatiques distales. Ce modèle est utile pour étudier la métastase latente, l'immunité anti-tumorale, et pour la conception de nouvelles immunothérapies pour traiter le cancer du sein.

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Ici, nous présentons un protocole visant à implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, façon invasive et facile à manipuler, moins et ce modèle murin orthotopique breast cancer avec un environnement approprié coussinets adipeux mammaire peut être utilisé pour étudier divers aspects de la cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Une méthode d’injection intracanalaire de réactifs pour une solution ablative à base d’éthanol dans l’arbre canalaire mammaire de la souris pour l’imagerie in vivo et la prévention du cancer du sein est décrite. L’injection directement dans l’ouverture du mamelon permet de cibler les cellules épithéliales mammaires avec un minimum de dommages aux tissus collatéraux.

Administration intracanalaire et visualisation aux rayons X d’une solution ablative à base d’éthanol pour la prévention et le traitement local du cancer du sein dans des modèles murins

Une procédure pour l’administration d’une solution ablative chimique à l’arbre canalaire mammaire du rat pour le traitement préventif du cancer du sein guidé par l’image est décrite. Les cellules épithéliales mammaires peuvent être ciblées avec un minimum de dommages collatéraux aux tissus par canulation directement dans l’ouverture du mamelon et perfusion intracanalaire d’une solution ablative à base d’éthanol à 70%.

Visualisation aux rayons X d’un traitement ablatif intracanalaire à base d’éthanol pour la prévention du cancer du sein chez le rat

Le présent protocole décrit l’injection intracanalaire de vecteurs viraux via la tétine pour délivrer des gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires.

In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire

Découvrez la modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris. Cette méthode permet une manipulation spécifique des événements oncogéniques sans élevage complexe.

Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

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