Name: Un modèle de xénogreffe dérivé du mélanome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Apprenez à établir des modèles de xénogreffe dérivés de patients pour la recherche sur le mélanome. Cette méthode permet d'étudier la biologie tumorale et la réponse thérapeutique avec une meilleure fidélité clinique.

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Les auteurs remercient le Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility et Research Supply Center. Cette étude a été financée en partie par des subventions de la U54 (CA224070-01), du SPORE (CA174523), du P01 (CA114046-07), de la Dr Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation et de la Melanoma Research Foundation.

Les protocoles animaux suivants suivent les lignes directrices du comité d'éthique des animaux de l'Institut Wistar et les lignes directrices sur les soins aux animaux.
1. Collection de tissu de tumeur de mélanome
<ol><li>Recueillir le tissu tumoral (appelé passage 0) des patients de mélanome par l'une des méthodes suivantes de chirurgie ou de biopsie.<ol>
<li>Pour les tissus d'excision chirurgicale, maintenir un minimum de 1 g de tissu (métastases et lésions primaires) dans les milieux de stockage de transport (RPMI 1640 - 0,1 % de fongicie et 0,2 % de gentamicine) à 4 oC ou sur la glace.</li>
		<li>Pour les tissus de biopsie chirurgicale, maintenir moins de 1 g de tissu (souvent des biopsies perforées de métastases sous-cutanées [s.c.] et de métastases de ganglions lymphatiques [LN]) dans les supports de stockage de transport à 4 oC ou sur la glace.</li>
		<li>Pour les tissus de biopsie de base, laver un cylindre (noyau) de tissu d'environ 10 mm x 1 mm (souvent, biopsies hépatiques) dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de support de stockage de transport à 4 oC ou sur la glace.</li>
		<li>Pour les tissus fins d'aspiration d'aiguille (AFN), gardez une très petite quantité de tissu (moins de 1 mm) prélevée directement sur le patient dans une aiguille et une seringue à 4 oC ou sur de la glace.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Livrer le tissu dans les supports de stockage de transport à 4 oC ou sur la glace le même jour ou avec l'expédition de nuit après l'excision chirurgicale ou la biopsie. Traiter le tissu dans 1-2 h de la livraison.</li>
</ol>2. Traitement de tissu de tumeur pour l'implantation de souris
<ol><li>Excision chirurgicale ou traitement chirurgical des tissus de biopsie<ol>
<li>Transférer le tissu dans un plat stérile Petri et séparer le tissu tumoral du tissu normal environnant autant que possible.</li>
		<li>Enlever le tissu nécrotique (habituellement identifié comme tissu pâle-blanchâtre situé au centre dans la tumeur) de la tumeur restante autant que possible.</li>
		<li>Utilisez un scalpel pour subdiviser un morceau de tumeur initial en morceaux à peu près égaux (3 mm x 3 mm) pour l'implantation chirurgicale de la souris (Figure 2).</li>
		<li>Optionnellement, si suffisamment de tissu tumoral est disponible, congelez le tissu pour les essais en aval (séquençage de l'ARN [RNASeq], séquençage de l'exome entier [WES], etc.).</li>
		<li>Faire une boue tumorale en haletant le tissu tumoral en utilisant une technique de lame croisée avec deux lames de scalpel. Émincer les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former une boue, qui est maintenant prêt pour l'implantation chirurgicale de souris.</li>
		<li>Alternativement, si le tissu tumoral est trop dur pour la dissociation mécanique, utilisez une procédure de dissociation de digestion pour former la boue gel-like et une suspension unicellulaire pour l'implantation et/ou l'injection.<ol>
<li>Émincer les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former la boue.</li>
			<li>Mettre la boue dans un tube de 50 ml avec la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS)-/- (sans Caet Mg) ; puis, centrifugeuse et granule à 220 x g pendant 4 min à 4 oC.</li>
			<li>Resuspendre la boue dans 10 mL de digest e frais réchauffé (200 U/mL de collagène IV - 5 mM CaCl2 - 50 U/mL DNase en HBSS-/-) par 1 g de tissu tumoral.</li>
			<li>Placer le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min et mélanger vigoureusement toutes les 5 minutes avec une pipette jetable.</li>
			<li>Laver avec jusqu'à 50 ml de HBSS-/-; puis, centrifugeuse à 220 x g pendant 4 min à 4 oC.</li>
			<li>Ajouter 5 ml de TEG préchauffé (0,025% trypsine - 40 g/mL d'éthylène glycol-bis (éthyleté aminoéthyle)-N,N,N',N'-tétraacetic acid [EGTA] - 10 g/mL d'alcool polyvinyl [PVA]) par 1 g de tissu tumoral, resuspendre/secouer doucement et placer le tube à 37 oC pendant 2 min sans mélanger.</li>
			<li>Ajouter au moins 1 volume égal de taches froides (1% d'albumine de sérum bovin [BSA] - 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES] - 1x pénicilline-streptomycine dans les médias L15) pour étancher la trypsine et centrifugeuse à 220 x g pour 4 min à 4 min C.</li>
			<li>Resuspendre l'échantillon dans 10 ml de milieu xantiqueux par 1 g de tissu tumoral et le filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 m pour obtenir une suspension à cellule unique pour l'injection de souris (Figure 2).</li>
			<li>La boue restante sur le dessus de la passoire de cellules peut également être rassemblée pour l'implantation chirurgicale de souris.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>C (en) traitement des tissus de biopsie du minerai
	<ol>
<li>Verser le tissu du cylindre de base dans le tube de transport des tissus dans un plat Petri de 5 cm.</li>
		<li>Enlever l'excès de liquide, gratter le tissu sur le bord de la vaisselle Petri, émincer finement le tissu tumoral, ajouter 100 à 150 l de HBSS-/- sur le tissu tumoral, et rapidement dessiner la suspension du tissu HBSS/tumeur dans la seringue de 1 ml.</li>
		<li>Fixez une aiguille de 23 G à la seringue de 1 ml, passez la suspension du tissu HBSS/tumeur à travers l'aiguille dans un tube de 1,5 ml.</li>
		<li>Redessiner la suspension tumorale dans la seringue avec l'aiguille toujours allumée jusqu'à ce qu'elle puisse passer en douceur à travers l'aiguille.</li>
		<li>Enfin tirer la suspension de la tumeur de nouveau dans la seringue et détacher l'aiguille de 23 G.</li>
		<li>Fixez une aiguille de 27 G et tirez un volume égal (100 à 150 l) de matrice extracellulaire artificielle (voir Tableau des matériaux)dans la seringue.</li>
		<li>Ajoutez un volume égal de matrice extracellulaire artificielle lentement dans le tube de rotation de 1,5 ml avec la tumeur/HBSS-/- suspension, évitant soigneusement la formation des bulles.</li>
		<li>Dessinez une dernière fois dans la seringue et le tissu tumoral de biopsie de noyau est maintenant prêt pour l'injection de souris.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement des tissus FNA
	<ol>
<li>Placer la seringue contenant les échantillons de LAFN (piégés dans l'aiguille) sur la glace.</li>
		<li>Séparez l'aiguille (contenant du tissu FNA) de la seringue et retirez le piston de la seringue, ajoutez 150 à 200 l de HBSS-/- au sommet de la seringue.</li>
		<li>Réinsérer le piston dans la seringue et l'aiguille (contenant du tissu FNA), et pousser le HBSS-/- à travers l'aiguille dans un tube de 1,5 ml. Cette étape enlève la tumeur de FNA de l'aiguille.</li>
		<li>Répétez l'étape 2.3.3 avec la suspension HBSS-/-/FNA deux fois en utilisant la même seringue pour maximiser la récupération du tissu tumoral de l'aiguille.</li>
		<li>Ajoutez un volume égal (100 à 150 l) de matrice extracellulaire artificielle au tube de 1,5 ml contenant la suspension HBSS/FNA.</li>
		<li>Mélangez correctement en élaborant lentement la matrice extracellulaire artificielle/HBSS-/-/suspension de FNA de nouveau dans l'aiguille de 23 G et répétant deux fois.</li>
		<li>Dessinez toute la matrice extracellulaire artificielle/HBSS-/-/FNA volume de nouveau dans la seringue, remplacez l'aiguille 23 G avec une aiguille de 27 G, et l'échantillon de FNA est maintenant prêt pour l'injection de souris.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Implantation et injection de tumeurs chez la souris
<ol><li>Implantation d'excision chirurgicale ou de biopsie chirurgicale REMARQUE : Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stériles par l'autoclacage ou l'utilisation d'instruments jetables pré-stérilisés.<ol>
<li>Raser les cheveux du bas du dos des souris mâles ou femelles de 6 à 8 semaines de NSG, laissant une zone d'environ 1,5 cm x 3 cm sans poils. Anesthésiez les souris à l'aide d'isoflurane et confirmez en serrant doucement le pied comme un test de réactivité. Utilisez un onguent vétérinaire sur leurs yeux pour prévenir la sécheresse.</li>
		<li>Placez les souris individuelles sur un bloc-pression dans le cône nasal de la machine d'anesthésie, frottez la zone rasée avec de la chlorhexidine. Puis arroser avec 70% d'éthanol et laisser s'évaporer.</li>
		<li>Préparer des morceaux ou diviser la boue tumorale dans un plat Petri en monticules individuels pour l'implantation chirurgicale (c.-à-d., en trois monticules égaux si elle doit être implantée dans 3 souris).</li>
		<li>À l'aide de la lame du scalpel, faire une incision d'environ 5 mm de long sur le centre de l'arrière de la souris, prendre une paire de forceps et soulever la peau sur le côté de l'incision opposée de l'opérateur.</li>
		<li>Prenez les ciseaux dans l'autre main et séparer la peau de la couche musculaire en coupant doucement la membrane fasciale avec de petites coupes de ciseaux, créant ainsi une «poche» pour le tissu tumoral.</li>
		<li>Ramassez un morceau de tumeur ou un monticule individuel de tissu de boue de tumeur avec la lame de scalpel et placez doucement le tissu dans la poche créée.</li>
		<li>Administrer 100 l de matrice extracellulaire artificielle sur le monticule de tissu tumoral dans la poche.</li>
		<li>À l'aide de deux paires de forceps, tirez l'incision sur les deux extrémités de sorte que les bords de la plaie se rapprochent les uns des autres, et fermez la plaie en appliquant un ou deux pinces de plaie.</li>
		<li>Les sous-cutanés injectent 1-5 mg/kg méloxicam comme analgésique chez les souris après la chirurgie.</li>
		<li>Sortez la souris du cône nasal et replacez-la dans sa cage d'origine, observez la souris tout en vous réveillant. Ne retournez pas dans une cage avant d'être complètement rétabli.</li>
		<li>Enlever les pinces de plaie après environ 7 jours. Si la guérison n'est pas terminée après 7 jours, laissez le clip de la plaie pendant un ou deux jours supplémentaires. REMARQUE : Si l'utilisation d'une suspension de cellules simples de l'excision chirurgicale ou du traitement chirurgical de tissu de biopsie, elle mélangera avec la matrice extracellulaire artificielle (au rapport de 1:1) pour l'injection de souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injection de FNA ou de tissu de biopsie de base<ol>
<li>Placez une souris NSG sur une grille en acier, maintenez la souris fermement par la queue, et tirez doucement la souris en arrière. Il saisira la grille avec ses pattes avant fermement. Sinon, maintenez une souris dans la main non dominante et laissez la zone du flanc visible.</li>
		<li>Désinfecter la peau du flanc avec des écouvillons de préparation à l'alcool, injecter lentement et régulièrement le contenu de la seringue sous la peau de la souris.</li>
		<li>Sortez l'aiguille et placez la souris dans sa cage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Surveiller la croissance tumorale
<ol><li>Surveillez les souris une fois par semaine pour vérifier s'il y a des tumeurs palpables.</li>
	<li>Une fois que les tumeurs sont àune taille mesurable (environ 50 mm 3), utilisez un étrier pour enregistrer les dimensions tumorales. Utilisez la formule suivante pour calculer les volumes tumoraux : (largeur x largeur x longueur) / 2.</li>
	<li>Récolte de tumeur une fois que le volume de tumeur atteint environ 1,5 cm3 (environ 4-10 semaines). La tumeur est maintenant appelée passage de souris 1 (MP1).</li>
</ol>5. Moissonnez la tumeur pour le tissu bancaire, la réimplantation, et l'expérience/caractérisation
<ol><li>Euthanasiez la souris dans une chambre CO 2, vérifiez les signes vitaux pour confirmer la mort, puis submergez la souris dans une solution Virkon pour stériliser la peau pendant 30 s dans le bio-cabinet.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux incurvés et des forceps chirurgicaux pour soulever la peau adjacente à la tumeur et faire une coupe horizontale.</li>
	<li>Utilisez une technique de séparation émoussée pour mobiliser la peau des deux côtés de la tumeur et sur la tumeur, exposant la tumeur.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux ou une lame de scalpel pour séparer la tumeur du fascia.</li>
	<li>Reséquez la tumeur et transférez la tumeur à un plat stérile de Petri, coupez la tumeur en petits morceaux et enlevez le tissu nécrotique de la tumeur.</li>
	<li>Tissu tumoral de banque pour l'implantation future.<ol>
<li>Prenez 2-3 petits morceaux de tumeur de moins de 10 mm x 10 mm et émincez-les en morceaux de moins de 1 mm x 1 mm.</li>
		<li>Transférer tous les tissus hachés dans un flacon cryogénique de 2 ml, ajouter 1 ml de support de congélation (10 % de DMSO et 90 % de FBS).</li>
		<li>Bien mélanger et placer les flacons cryogéniques dans un contenant de congélation cellulaire à base d'isopropanol pré-réfrigéré sur de la glace sèche.</li>
		<li>Entreposer le contenant dans un congélateur de -80 oC pendantla nuit, puis transférer les flacons cryogéniques dans le stockage d'azote liquide (LN 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tissu de congélation pour les essais en aval (RNASeq, WES, etc.).<ol>
<li>Placer les morceaux de tissu tumoral (3 mm x 3 mm) dans un flacon cryogénique et mettre le flacon cryogénique dans LN2 immédiatement. Conserver les flacons dans un congélateur de -80 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Essais de thérapie PDX
REMARQUE : Il faudra deux phases d'expansion pour faire pousser assez de tissu tumoral pour générer le nombre nécessaire de souris portant pDX pour l'essai de thérapie.
<ol><li>Ramassez un cryovial contenant du tissu PDX en banque de LN2, et placez le cryovial dans un bain d'eau de 37 oC jusqu'à ce que le support de congélation contenant le tissu tumoral commence à peine à fondre.</li>
	<li>Vider le contenu du cryovial dans le HBSS préréchauffé-/- dans un tube de 50 ml, et laver les tissus.</li>
	<li>Pelleter le tissu par centrifugation pendant 5 min à 1 200 tr/min.</li>
	<li>Retirez HBSS-/- de l'échantillon de tumeur par aspiration de vide avec un pipet de Pasteur.</li>
	<li>Faites glisser le tissu PDX du tube de 50 ml dans un plat Petri de 5 cm ou 10 cm et placez-le sur de la glace humide.</li>
	<li>Suivez le protocole d'implantation ci-dessus pour implanter le tissu misené d'un flacon cryogénique dans 5 souris de NSG pour le premier rond de l'expansion de tumeur de PDX.</li>
	<li>Une fois que les tumeurs atteignent 600 à 800 mm3,récoltent 1-2 tumeurs pour obtenir une suspension de cellule simple avec le protocole ci-dessus pour le traitement des tissus tumoraux : dissociation mécanique, procédure de dissociation de la digestion de collagène.</li>
	<li>Cellules de pellet et resuspend dans 6 mL de HBSS-/-/matrice extracellulaire artificielle (rapport 1:1), injection sous-cutanée de 50 souris DeGS, avec 100 l de mélange cellulaire par souris pour le deuxième tour de l'expansion de tumeur de PDX.</li>
	<li>Mesurer la taille de la tumeur avec des étriers toutes les deux semaines.</li>
	<li>Attendez une tumeur de 100 mm3 en 3-5 semaines, randomisez les souris en groupes et commencez le traitement.</li>
	<li>Lorsque la taille de la tumeur atteint le volume maximal approuvé par l'IACUC, arrêtez le traitement.</li>
	<li>Suivez le protocole de tumeur de récolte ci-dessus pour recueillir les morceaux congelés de tumeur de rupture, morceaux de tumeur pour des blocs de paraffine.</li>
</ol>

<ol><li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Genomic+Characterization+of+462+Melanoma+Patient-Derived+Xenografts%2C+Tumor+Biopsies%2C+and+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li>
<li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Paraiso, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+phospho-ERK+activity+allows+melanoma+cells+to+escape+from+BRAF+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+Of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy.</a> British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).</li>
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<li>De La Rochere, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+for+the+Study+of+Immuno-Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology.</a> Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous avons décrit ici générant des modèles de PDX du mélanome avec le tissu patient dérivé des tumeurs primaires et métastatiques, des biopsies de noyau, et des FNAs. Lorsqu'elles sont directement greffées chez des souris DeNS, les tumeurs présentent des propriétés morphologiques, génomiques et biologiques similaires à celles observées chez le patient. Dans le cas où seulement une petite quantité de tissu est disponible pour les investigateurs, comme cela se produit souvent avec des FNA, la technique de PDX permet l'expa...

Les modèles précliniques sont essentiels pour tous les aspects de la recherche translationnelle sur le cancer, y compris la caractérisation des maladies, la découverte de vulnérabilités exploitables propres au cancer par rapport aux cellules normales, et le développement de thérapies efficaces qui exploitent ces vulnérabilités pour augmenter la survie globale des patients. Dans le domaine du mélanome, des dizaines de milliers de modèles de lignées cellulaires ont été fortement utilisés pour le dépistage des médicaments, avec 4 000 euros de contribution de notre seul groupe (série WMXXX). Ces modèles de lignée cellulaire ont été dérivés de patients atteints de mélanome présentant diverses formes de mélanome cutané (c.-à-d. la propagation acraleuse, uveale et superficielle) et de divers génotypes (c.-à-d., BRAFV600-mutant et neuroblastome RAS viral oncogene homolog [ NRAS (En) Q61R-mutant]), qui couvrent le spectre de la maladie présente dans la clinique1,2.
Sans équivoque, la stratégie thérapeutique la plus réussie et ciblée dans le domaine du mélanome est née de 1) la caractérisation génomique des tumeurs des patients identifiant les mutations BRAF dans 50% des mélanomes3 et de 2) l'enquête préclinique tirant parti des modèles de lignée cellulaire du mélanome4. La combinaison d'inhibiteurs BRAF/MEK a été approuvée en 2014 par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des patients dont les mélanomes abritent l'activation des mutations BRAFV600E/K et bénéficie d'un taux de réponsede 5. Malgré cette efficacité initiale, la résistance surgit rapidement dans presque tous les cas en raison des mécanismes intrinsèques et acquis multiples de résistance et de l'hétérogénéité intratumorale. Malheureusement, les modèles de lignées cellulaires ne récapitulent pas l'hétérogénéité biologique représentative lorsqu'ils sont cultivés dans une culture bidimensionnelle dans des récipients en plastique, ce qui masque leur potentiel cliniquement prédictif lorsque les chercheurs tentent de déterminer expérimentalement thérapies qui pourraient être efficaces chez les patients présentant une forme spécifique ou un génotype du mélanome6. Comprendre comment modéliser au mieux l'hétérogénéité intratumorale du patient permettra aux chercheurs de mieux développer des modalités thérapeutiques qui peuvent tuer les sous-populations résistantes à la thérapie qui entraînent l'échec aux thérapies actuelles de norme de soins.
La valeur prédictive limitée des modèles de lignées cellulaires est la façon dont ils sont initialement établis. Des altérations irréversibles se produisent dans le paysage clonal de tumeur quand une suspension unicellulaire d'une tumeur de patients est cultivée sur les navires bidimensionnels et de culture de tissu plastique, y compris des changements dans le potentiel proliférant et invasif, l'élimination de spécifique sous-populations, et l'altération de l'information génétique7. Les xénogreffes chez les souris de ces modèles de lignée cellulaire de mélanome représentent la plate-forme in vivo la plus fréquemment utilisée pour les études précliniques ; cependant, cette stratégie souffre également de la récapitulation pauvre de l'hétérogénéité complexe de tumeur observée médicalement. Pour surmonter cette lacune, il y a eu un intérêt croissant dans l'incorporation des modèles précliniques plus sophistiqués du mélanome, y compris le modèle de PDX. Les modèles de PDX ont été utilisés pendant 30 ans, avec des études séminales dans les patients de cancer du poumon démontrant la concordance entre la réponse des patients aux agents cytotoxiques et la réponse du modèle de PDX dérivé du même patient8. Récemment, il ya eu une volonté d'utiliser des modèles PDX comme l'outil de choix pour les enquêtes précliniques à la fois dans l'industrie et dans les centres universitaires. Les modèles de PDX, en raison de leur récapitulation supérieure de l'hétérogénéité de tumeur dans les patients humains, sont plus médicalement pertinents à employer dans des efforts d'optimisation de thérapie que les xénogreffesdeligne cellulaire 9. Dans le mélanome, il y a d'immenses obstacles qui émoussent la gestion thérapeutique de la maladie avancée10. Des modèles De PDX cliniquement pertinents ont été utilisés pour modéliser la résistance clinique et identifier des stratégies thérapeutiques avec des agents cliniquement disponibles pour traiter les tumeurs résistantes à la thérapie11,12. En bref, le protocole présenté ici pour générer des modèles de PDX exige l'implantation sous-cutanée de tissu frais des mélanomes primaires ou métastatiques (recueillis par biopsie ou chirurgie) dans les souris nulles de NOD/scid/IL2-récepteur (NSG). Différentes variations de l'approche méthodologique sont utilisées par différents groupes; cependant, un noyau fondamental existe13.

<table><tbody><tr><td>1 M Hepes</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>100x PenStrep&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 15140163</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS-/- (sans Ca++ ou Mg++)</td><td>MED</td><td>Cat # MT21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine&nbsp ;</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # T4549-100ML</td><td>10 mL aliquotes stockées à &ndash ; 20oC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 50-118-0313</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV (2 000 u/mL)</td><td>Worthington&nbsp ;</td><td>Cat #4189</td><td>maquillage en HBSS-/- à partir de stock de poudre de collagénase IV (Worthington #4189, u/mg indiqué sur la bouteille et varie avec chaque lot) ; congeler 1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # C6295-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # D4527</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (éthylène glycol bis(2-aminoéthyl éther)-N,N,N' Acide N'-tétraacétique)</td><td>Merck</td><td>Chat # 324626.25</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Chat # 16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Chat # 15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>Chat # BW17518Z</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>HENRY SCHEIN SANTÉ ANIMALE</td><td>Chat # 050031</td><td></td></tr><tr><td>Le média L15 de Leibovitz&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 21083027</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354230</td><td>Matrice extracellulaire artificielle</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td><td>Cat # 025115</td><td>1-5mg/kg, en tant qu’analgésique</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Souris</td><td>The Wistar Institute, élevage d’animaleries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVA (alcool polyvinylique)</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X avec L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# MT10041CM</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather Cat</td><td># 2976-22</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td><td>Cat # 222-01-06</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à plaie</td><td>MikRon</td><td>Cat #427631</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de xénogreffe dérivé du mélanome

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

L'accumulation des preuves suggère que les propriétés moléculaires et biologiques diffèrent dans les cellules de mélanome cultivées dans les vaisseaux traditionnels de culture de tissu bidimensionnels contre in vivo dans les patients humains. Ceci est dû à la sélection de goulot d'étranglement des populations clonales des cellules de mélanome qui peuvent fortement se développer in vitro en l'absence de conditions physiologiques. De plus, les réponses à la thérapie dans les cultures tissulaires bidimensionnelles dans l'ensemble ne reflètent pas fidèlement les réponses à la thérapie chez les patients atteints de mélanome, la majorité des essais cliniques ne démontportant pas l'efficacité des combinaisons thérapeutiques qui se sont avérées efficaces dans Vitro. Bien que le xénogreffedes de cellules de mélanome chez la souris fournit le contexte physiologique in vivo absent des essais bidimensionnels de culture de tissu, les cellules de mélanome employées pour l'engraftment ont déjà subi la sélection de goulot d'étranglement pour des cellules qui pourraient se développer sous conditions bidimensionnelles lorsque la lignée cellulaire a été établie. Les modifications irréversibles qui se produisent à la suite du goulot d'étranglement comprennent des changements dans les propriétés de croissance et d'invasion, ainsi que la perte de sous-populations spécifiques. Par conséquent, les modèles qui récapitulent mieux la condition humaine in vivo peuvent mieux prévoir des stratégies thérapeutiques qui augmentent effectivement la survie globale des patients présentant le mélanome métastatique. La technique de xénogreffe (PDX) dérivée du patient implique l'implantation directe des cellules de tumeur du patient humain à un destinataire de souris. De cette manière, les cellules de tumeur sont uniformément cultivées sous des contraintes physiologiques in vivo et ne subissent jamais le goulot d'étranglement bidimensionnel, qui préserve les propriétés moléculaires et biologiques présentes quand la tumeur était dans le patient humain. Notable, les modèles PDX dérivés de sites d'organes de métastases (c.-à-d. le cerveau) présentent une capacité métastatique similaire, tandis que les modèles PDX dérivés de patients naïfs et de patients ayant une résistance acquise à la thérapie (c.-à-d. la thérapie inhibitrice BRAF/MEK) présentent un affichage sensibilité similaire à la thérapie.

Le tissu tumoral pour les modèles de mélanome PDX peut provenir d'une variété de différentes sources et peut également être traité par la dynamique de croissance des modèles individuels et l'utilisation désirée du tissu DeX. La priorité lors de l'établissement d'un modèle PDX est d'avoir suffisamment de matériel pour la banque pour une utilisation future et l'ADN pour la caractérisation (figure 1).
Une fois que le matériel suffisant est mis en banque, le tissu de ...

Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient récapitulent plus solidement les caractéristiques moléculaires et biologiques du mélanome et sont plus prédictifs de la réponse thérapeutique par rapport aux essais traditionnels fondés sur la culture des tissus plastiques. Nous décrivons ici notre protocole d'exploitation standard pour l'établissement de nouveaux modèles PDX et la caractérisation/expérimentation des modèles PDX existants.

Un modèle de xénogreffe dérivé du mélanome

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Le PDX a révolutionné les études précliniques expérimentales sur le cancer. Nous pouvons maintenant imiter, en laboratoire, ce qui se passe chez les patients. Et maintenant, nous pouvons travailler sur la façon de surmonter la résistance et comment, à long terme, nous pouvons augmenter la survie des patients.La démonstration de la procédure sera Min Xiao. Pour commencer, transférez le tissu précédemment recueilli de mélanome à une boîte stérile de Petri. En travaillant avec des ciseaux chirurgicaux, la lame de scalpel, et des forceps, d’abord enlever le tissu normal du tissu normal autant que possible.Et puis enlever le tissu nécrotique identifié par le tissu blanc pâle-ish situé centralement dans la tumeur. Ensuite, utilisez un scalpel pour subdiviser un morceau initial de tumeur en morceaux à peu près égaux pour l’implantation chirurgicale de souris. Si le tissu tumoral est trop dur pour la dissociation mécanique, utilisez un scalpel pour émincer les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former une boue.Transférer le lisier dans un tube de 50 millilitres avec la solution de sel équilibré de Hank froid sans ions calcium et magnésium. Centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir enlevé le supernatant, re-suspendre le lisier en 10 millilitres de réchauffer, les médias de digestion fraîche par gramme de tissu tumoral.Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes et mélangez vigoureusement toutes les cinq minutes avec une pipette jetable. Laver le lisier à l’aide de jusqu’à 50 millilitres de HBSS, centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius, puis enlever le supernatant. Ajouter cinq millilitres de tampon TEG préchauffé par gramme de tissu tumoral, secouer pour suspendre doucement, et placer le tube à 37 degrés Celsius pendant deux minutes, sans mélanger.Pour étancher la trypsine, ajouter au moins un volume égal de supports de coloration à froid et de centrifugeuse à 220 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir enlevé le supernatant, ajouter 10 millilitres de colorant par gramme de tissu tumoral, et re-suspendre la pastille par pipetting de haut en bas. Filtrez-le à travers une passoire à cellules de 40 micromètres pour obtenir une suspension à cellule unique pour l’injection de souris.Pour implanter l’excision chirurgicale ou le tissu chirurgical de biopsie, rasez d’abord les cheveux du bas du dos des souris anesthésiées de six à huit semaines de NSG, laissant une zone d’environ 1,5 centimètres à trois centimètres sans cheveux. Préparez des morceaux de tumeur, et divisez le lisier de tumeur dans un Petri en monticules individuels pour l’implantation chirurgicale. À l’aide d’une lame de scalpel, faire une incision d’environ cinq millimètres de long au centre de l’arrière de la souris.Avec une paire de forceps, la vie jusqu’à la peau sur le côté de l’incision en face de l’opérateur. Avec des ciseaux dans l’autre main, séparer la peau de la couche musculaire en coupant doucement la membrane fasciale avec de petites coupures de ciseaux, créant ainsi une poche pour le tissu tumoral. Utilisez une lame de scalpel pour ramasser un mandrin tumoral, ainsi qu’un monticule individuel de tissu de boue tumorale, et placez doucement le tissu dans la poche créée.Ajoutez ensuite 100 microlitres de matrice extracellulaire artificielle sur le monticule de tissu tumoral dans la poche. À l’aide de deux paires de forceps, tirez vers le haut de l’incision sur les deux extrémités de sorte que les bords de la plaie s’approchent l’un de l’autre. Appliquez ensuite un ou deux clips de plaie pour fermer la plaie.Injecter subcutanément un à cinq milligrammes par kilogramme d’analgésique. Lorsque la guérison est complètement, après environ sept jours, enlever les clips de la plaie. Surveillez les souris une fois par semaine pour vérifier s’il y a des tumeurs palpables.Une fois que les tumeurs atteignent un volume désiré, utilisez des forceps chirurgicaux pour soulever la peau adjacente à la tumeur de la souris euthanasiée et faire une coupe horizontale à l’aide de ciseaux incurvés. Utilisez une technique de séparation émoussée pour mobiliser la peau des deux côtés de la tumeur et sur la tumeur, exposant la tumeur. Utilisez des ciseaux et une lame de scalpel pour séparer la tumeur du fascia.Découpez la tumeur et transférez-la dans une boîte de Pétri stérile. Couper la tumeur en petits morceaux et enlever le tissu nécrotique de la tumeur. Pour banquer le tissu tumoral pour l’implantation future, prenez deux à trois petits morceaux de tumeur et hachez-les en morceaux plus petits qu’un par un millimètre.Transférer tous les tissus hachés dans une vile cryogénique de deux millilitres. Ajouter un millilitre de congélation des médias et bien mélanger. Placer les flacons dans un contenant de congélation cellulaire pré-refroidi à base d’isopropanol sur de la glace sèche, conserver le contenant dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant la nuit, puis transférer les flacons dans un entrepôt d’azote liquide.Pour casser le tissu de gel pour des analyses en aval, placez les morceaux de tissu de tumeur dans un flacon cryogénique, mettez la vile cryogénique dans l’azote liquide immédiatement, et stockez les flacons dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius. Quand trois méthodes différentes de tissu de tumeur croissant ont été comparées, la suspension simple de cellules de tumeur avec l’utilisation de la digestion enzymatique était la plus réussie. En plus de permettre une croissance tumorale plus rapide, il était également suffisant pour une tumeur initiale d’être étendue à 10 à 20 souris, tandis que le mandrin tumoral et la méthode du lisier ne peuvent être étendus qu’en cinq à 10 souris.Les modèles de xénogreffe patients-dérivés du mélanome reflètent souvent la sensibilité de drogue que le patient a montrée en thérapie. Une xénogreffe dérivée du patient de mélanome qui a au commencement répondu à un inhibiteur de BRAF, mais finalement rechuté, a également montré la sensibilité initiale à l’inhibition de protéine de BRAF, plus l’inhibiteur de kinase de MEK, mais les tumeurs ont finalement rechuté. Il est essentiel de prendre soin lors de la préparation des tissus PDX pour les opérations bancaires, car cela assurera le succès dans les futures expansions PDX, essais thérapeutique, ainsi que la caractérisation.Avec le matériel de PDX, le séquençage d’ARN simple de cellules, le séquençage exome entier, et la caractérisation protéomique, sont parmi les nombreuses méthodes que notre laboratoire tire parti pour disséquer la résistance de thérapie. La technique PDX permet aux chercheurs d’étudier la résistance à la thérapie à l’aide de cellules tumorales qui récapitulent mieux la biologie tumorale chez un patient humain par rapport aux modèles de cancer traditionnels cultivés sur du plastique. Cet avantage permet des idées plus prédictives.Les chercheurs devraient toujours prendre soin et utiliser le niveau de biosécurité deux précautions lors de la manipulation des tissus tumoraux dérivés d’un patient humain.

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