Une méthode d'extraction multi-omics pour l'analyse approfondie des cultures synchronisées de l'alga verte Chlamydomonas reinhardtii

Les études à l’échelle des systèmes sont cruciales pour la compréhension approfondie des fonctions biologiques. Cependant, plusieurs échantillons indépendants sont nécessaires pour différentes plates-formes d’omique, introduisant une grande variabilité des données. Cette méthode offre une stratégie robuste et à haut débit pour l’extraction simultanée de chlorophylle, lipides, métabolites, protéines et amidon à partir d’un seul échantillon de l’algue verte modèle, Chlamydomonas reinhardtii.

Pour l’extraction de chlorophylle, lipide et métabolite, disposer les tubes des granulés de cellules chlamydomonas récoltés dans de l’azote liquide. Resuspendez la pastille dans chaque tube avec un millilitre de tampon d’extraction de 20 degrés. Pour éviter l’évaporation du tampon d’extraction de faible viscosité, vortexez rapidement les tubes jusqu’à ce que les cellules soient bien homogénéisées dans le mélange d’extraction et aliquot la solution en tubes de microcentrifugeuse de deux millilitres.

Sonicate les cultures dans un bain de sonication dans l’eau glacée pendant 10 minutes avant l’incubation sur un shaker orbital à 1000 rotations par minute pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 650 microlitres de tampon d’extraction deux et vortex brièvement les échantillons avant la centrifugation. Pour aliquot les fractions, transférer 500 microlitres de la phase lipidique mtbe supérieure dans un tube étiqueté 1,5 millilitre.

Utilisez une pipette de 200 microlitres pour éliminer la phase lipidique et transférer 650 microlitres de la phase de métabolite polaire et semipolaire inférieure dans de nouveaux tubes étiquetés. Aspirer l’excès de volume pour enlever la phase inférieure restante et congeler les granulés solides dans de l’azote liquide pour un stockage de 80 degrés. Pour la détermination des métabolites polaires, résusquez la pastille séchée de la phase polaire dans la solution de pyridine hydrochlorure de méthoxyamine pour la méthoxymisation des groupes carbonyles et chauffez les échantillons à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes.

À la fin de l’incubation, dérivation des échantillons avec du n-méthyl-n-trifluoracetamide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius selon les protocoles standard. Utilisez la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse de l’heure de vol pour analyser les métabolites primaires. Pour la détermination des métabolites non polaires, resuspendez la pastille séchée de la phase non polaire dans un mélange de sept à trois volumes à l’acétyltrile de volume à l’isopropanol et sédimenter les granulés par centrifugation.

Séparez ensuite les échantillons sur une colonne de phase C8 inversée sur un système de chromatographie liquide ultraperformance. Pour la détermination de la teneur en chlorophylle, mélanger 100 microlitres de la phase MTBE avec 900 microlitres de 90% de méthanol pour la méthode vierge ainsi que les échantillons expérimentaux. Mesurez ensuite l’absorption sur un spectrophotomètre à des longueurs d’onde de 655 et 652 nanomètres pour distinguer la chlorophylle a et la chlorophylle b et calculer la teneur en chlorophylle a et b et la teneur totale en chlorophylle.

Pour l’extraction des protéines, dissoudre la pastille de phase inférieure dans 200 microlitres de tampon protéique et incuber l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifuger l’échantillon et transférer le supernatant contenant des protéines dans un nouveau tube. Mesurer la concentration en protéines à l’aide de l’analyse bradford.

Pour digérer la protéine, réduire 15 microgrammes de l’échantillon en dithiothreitol millimolaire pendant 30 minutes, suivi de l’alkylation avec 10 millimolar iodoacetamide pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’alkylation, mélanger la solution Trypsin/Lys-C à un rapport protéine/protéase de 25 pour une et incuber l’échantillon pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Diluer l’échantillon six fois en 50 millimolaires tris Hcl pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, terminer la digestion avec de l’acide trifluoroacétique à une concentration finale de 0,5 à 1% Après la digestion, concentrer les échantillons à la quasi-sécheresse, laissant deux à cinq microlitres de solution dans un concentrateur sous vide sans chauffage. Resuspendez l’échantillon dans le tampon de chargement. Analyser les mélanges de peptides par spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution relié à un système de chromatographie liquide nano-pression.

Pour séparer les peptides, chargez quatre microlitres d’échantillon sur une colonne hybride de surface chargée de phase inverse de 20 centimètres avec un diamètre intérieur de 75 micromètres et une taille de particule de 1,7 micromètre. Utilisez des paramètres hors ligne partiels de boucle avec un gradient isocratique réglé à 3% du tampon B, maintenu pendant 14 minutes avant que la boucle ne soit déplacée vers la position en ligne avec la colonne, après quoi le gradient sera augmenté linéairement pendant 50 minutes jusqu’à ce que 20% tampon B soit atteint. Un changement dans le volume cellulaire peut être observé à mesure que les cellules se développent en taille tout au long de la phase de lumière, suivie par la libération des cellules fille à partir de la fin de la phase de lumière à partir de 10 heures.

Une fois que toutes les cellules de fille ont été libérées, un décalage dans le volume de cellules peut être observé, pendant que les cellules de fille nouvellement libérées sont disposées pour commencer le prochain cycle. Basé sur l’analyse de spectrométrie de masse de chromatographie de gaz de la fraction polaire, dans cette expérience représentative, 65 métabolites ont été annotés. L’analyse de la spectrométrie de masse chromatographie liquide de la phase neutre contenant des lipides a mené à l’identification de 204 espèces distinctes de lipides couvrant diverses classes de lipides.

L’analyse des composants principaux peut être utilisée pour visualiser les changements mondiaux dans les métabolites et les lipides à travers le cycle cellulaire avec une séparation des phases de lumière et d’obscurité ainsi que des phases semi-cycliques observées pour les données métabolomiques et lipidomiques. Ici, un aperçu de l’enrichissement fonctionnel de 2 463 protéines enrichies identifiées est montré. Le reste de la pastille après extraction des protéines peut être utilisé pour la quantification reproductible de l’amidon, comme l’indique le faible écart type entre les différentes répliques.

Il est important d’éviter le séchage de la phase organique supérieure de chlorophylle, car cela peut influencer les niveaux de chlorophylle dans le solvant, affectant le facteur de normalisation pour les échantillons. Diverses procédures analytiques peuvent être mises en œuvre pour la caractérisation biochimique des espèces moléculaires extraites.