Name: Aspect technique de la synthèse automatisée et de lévaluation cinétique en temps réel de 11C SNAP-7941 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez la synthèse automatisée de [11C]SNAP-7941 et son évaluation cinétique en temps réel par imagerie TEP sur cellules exprimant ou non P-gp. Cette méthode optimise l'étude de l'expression des récepteurs.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds scientifique autrichien (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Nous sommes reconnaissants pour le soutien technique de T. Zenz et A. Krcal. En outre, nous remercions K. Pallitsch pour la préparation de l'AgOTf et H. Spreitzer pour la distribution du précurseur.

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</ol>

Nous n'avons rien à divulguer.

La radiosynthèse de [11C]SNAP-7941 a été établie sur un module de synthèse commerciale. En raison de la possibilité d'automatiser entièrement la procédure de préparation, la radiosynthèse prouvée pour être fiable, et des améliorations concernant la protection par rayonnement de l'opérateur ont été réalisées. La préparation du synthétiseur a un impact énorme sur la qualité du radiotraceur, en particulier en termes d'activité molaire. Il est donc essentiel de travailler constamment dans des conditions inertes (p. ex., atmosphère d'hélium) et de rincer toutes les lignes situées avant le vaisseau de réaction (ligne cible, [11C]CH3I cycle de production et réacteur (voir figure 2)). De plus, le chauffage des pièges et des fours respectifs avant le début de la synthèse pour éliminer l'humidité et le carbone atmosphérique augmente avantageusement l'activité molaire. En particulier, la colonne AgOTf, imprégnée de carbone graphitisé, est extrêmement sensible à l'humidité. Même des quantités mineures de toute source d'humidité perturbent la conversion de [11C]CH3I à [11C]CH3OTf. Avant de commencer la synthèse, le piège [11C]CO2 et le piège [11C]CH3I doivent être refroidis à la température ambiante afin de permettre le piégeage ultérieur. En outre, il est recommandé de dissoudre le précurseur peu de temps avant de commencer la synthèse et d'ajouter la base directement dans la solution précurseur.
Le contrôle de la qualité des radiotraceurs de carbone-11 doit être conçu rationnellement pour un flux de travail continu et rapide. Cependant, les paramètres les plus importants pour les études de culture cellulaire sont la pureté radiochimique et l'activité molaire pour obtenir des résultats valides. L'évaluation correcte de l'activité molaire nécessite une méthode HPLC analytique robuste et la courbe d'étalonnage doit couvrir la plage de concentration du produit final. La partie difficile pour les radiotraceurs est d'atteindre une concentration au-dessus de la limite de quantification (LOQ) en raison de petites quantités, qui sont produites pendant la radiosynthèse. Par conséquent, l'art est de trouver l'équilibre entre les activités molaires élevées pour éviter la saturation des récepteurs et des concentrations suffisamment élevées pour être encore en mesure de quantifier le signal non radioactif.
[11C] LE SNAP-7941 a été confirmé comme étant un substrat puissant du transporteur humain De P-gp, car aucune accumulation n'a été observée dans les cellules MDCKII-hMDR1 non traitées ou traitées par véhicule en raison de l'efflux rapide. En revanche, les deux installations expérimentales (MDCKII-WT ou cellules MDCKII-hMDR1 pré-bloquées) ont fourni des résultats similaires (accumulation de [11C]SNAP-7941), soutenant la polyvalence de cet analyse in vitro. Les cellules MDCKII-hMDR1 conviennent parfaitement aux expériences LigandTracer en raison de leur transfection stable, de leur croissance rapide et de leur persistance contre le stress de cisaillement causé par le plat de culture cellulaire rotatif. L'absence d'apport de [11C]SNAP-7941 dans le cerveau du rat et des souris pourrait donc se produire causée par l'efflux par le transporteur P-gp. En raison de la transfection des cellules rénales canines avec la protéine de résistance multimédicament humaine 1 (hMDR-1, P-gp), la valeur prédictive de cette méthode pour la liaison de transporteur d'efflux chez l'homme est élevée, ce qui est favorable en termes d'application clinique future. Cependant, jusqu'ici, la sélectivité contre d'autre transporteur d'efflux n'a pas été vérifiée. Par conséquent, d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées, exprimant différents transporteurs d'efflux importants comme la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) ou la protéine de résistance multiple-1 (MRP-1), pour étudier les interactions avec ces transporteurs. La méthode est en comparaison avec l'accumulation classique ou les essais de transport très simple et donne immédiatement des résultats qualitatifs. En outre, le plus grand avantage est que cette technologie permet d'évaluer l'interaction directe du traceur PET et de la cible en temps réel, contrairement à l'expérience conventionnelle utilisant la quantification indirecte (principalement le déplacement). En outre, le logiciel de radio-analyse en temps réel offre une flexibilité expérimentale (par exemple, correction de la désintégration des nucléides, mesure du temps et des positions, etc.) et, par conséquent, une grande liberté pour les utilisateurs. D'autre part, les limites de la méthode comprennent un faible débit d'échantillon, car un seul plat cellulaire peut être mesuré à la fois. En outre, quelques autres questions techniques et opérationnelles devraient être prises en compte : la technologie décrite est très sensible aux rayonnements de fond; par conséquent, les sources de rayonnement doivent être maintenues à distance et l'accent devrait être mis sur la mesure de fond avant l'expérience. Un autre problème concernant les expériences à des températures plus élevées que la température ambiante, est le chauffage du support incliné: l'évaporation du milieu de culture cellulaire pourrait affecter le détecteur. Au lieu de chauffer, l'ensemble de l'appareil est de préférence placé dans l'incubateur. En outre, la méthode est limitée aux lignées cellulaires adhérentes. Grâce à la rotation du plat de culture cellulaire, les cellules sensibles au stress de cisaillement peuvent se détacher du plat, ce qui peut conduire à des résultats invalides.
Néanmoins, si l'expérimentateur prête attention à ces inconvénients mineurs, la méthode fournit des résultats rapides et fiables pour l'analyse du comportement cinétique des traceurs précliniques.

[11C] SNAP-7941 a été développé comme la première tomographie par émission de positrons (PET)-tracer ciblant le récepteur hormonal à concentration de mélanine 1 (MCHR1) - un récepteur principalement impliqué dans la régulation centrale de l'appétit et de l'apport alimentaire1. L'étiquetage carbone-11 du SNAP-7941, un antagoniste MCHR1 bien caractérisé, a donné l'authentique PET-tracer2,3,4,5. Cependant, la radiosynthèse entièrement automatisée est très difficile en termes d'efficacité du temps et de reproductibilité avec le radionucléide de courte durée carbone-11 offrant une demi-vie de 20 min6. Le temps de synthèse global doit être réduit au minimum, et en règle générale, il ne doit pas dépasser 2-3 demi-vies (c.-à-d. environ 40-60 min pour le carbone-11)7. En particulier, les procédures de synthèse pour les radiotraceurs ciblant les systèmes récepteurs avec des densités d'expression faible doivent être largement optimisées pour obtenir des rendements suffisants et, par conséquent, une activité molaire élevée8. La stratégie synthétique suit souvent la production de radionucléides dans un cyclotron et la libération de [11C]CO2 au synthétiseur. Là, [11C]CO2 est d'abord réduit à [11C]CH4 et a ensuite réagi avec de l'iode pour produire [11C]CH3I via la méthode de phase gaz9,10. D'autres traitements avec des rendements de triflate argent [11C]CH3OTf directement en ligne. Par la suite, cet intermédiaire réactif étiqueté carbone-11 est introduit dans une solution contenant la molécule précurseur. Une radiosynthèse automatisée implique en outre un processus de purification avec RP-HPLC semi-préparatif comprenant la formulation ultérieure du produit approprié pour des études précliniques et cliniques.
Indépendamment de la demi-vie du radionucléide et de l'effort de temps de la radiosynthèse, la pharmacocinétique d'un radiopharmaceutique est la partie la plus critique à évaluer pendant le développement de PET-tracer. En termes de neuroimagerie, l'entrée du cerveau du PET-tracer est la principale condition préalable. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BBB), une « frontière de sécurité » du cerveau, exprime fortement les transporteurs d'efflux qui peuvent décharger de petites molécules (par exemple, PET-tracers) et entraver efficacement leur applicabilité.
Un énorme inconvénient lors de l'évaluation préclinique sont les interactions inattendues envers ces transporteurs d'efflux, qui sont souvent méconnues dans les expériences in vitro et conduisant à l'échec du PET-tracer in vivo, comme observé pour [11C]SNAP-7941. L'imagerie de PET chez les rats a démontré l'accumulation basse de cerveau, qui a augmenté de façon spectaculaire après administration du tariquidar d'inhibiteur de P-gp11. Ces données suggèrent que [11C]SNAP-7941 est un substrat de ce système de transport d'efflux empêchant la liaison de ligand au MCHR1 central. Malheureusement, il existe encore un manque de modèles in vitro adéquats permettant de prédire la pénétration de BBB à un stade précoce du développement du traceur.
Ici, nous décrivons la synthèse automatisée de [11C]SNAP-7941 à l'aide d'un synthétiseur pour les méthylations de carbone-11. L'accent de ce travail est de donner un aperçu sur la façon d'organiser une approche expérimentale consécutive, y compris la synthèse automatisée, le contrôle de la qualité ainsi que l'évaluation in vitro successive avec le nucléide de très courte durée carbone-11.
Tout d'abord, les étapes clés d'une radiosynthèse réussie avec un minimum de temps et un rendement maximal sont décrites. Ensuite, une procédure de contrôle de la qualité fiable est mise en place pour mettre le radiotraceur à la disposition des études cliniques potentielles et répondre aux critères de la Pharmacopoeia européenne12. La quantification de la concentration molaire et le calcul de l'activité molaire respective est une exigence essentielle pour les mesures cinétiques successives.
Enfin, une nouvelle méthode in vitro simple évaluant les interactions de [11C]SNAP-7941 vers le transporteur d'efflux, P-gp (hMDR1), est présentée. Le modèle cinétique proposé utilise un dispositif facile à manipuler qui permet une interprétation immédiate des données et nécessite un minimum d'effort de culture cellulaire13.

<table><tbody><tr><td>Tableau 1 : Liste des matériaux et de l’instrumentation de la radiosynthèse entièrement automatisée du catalyseur [11C]SNAP-7941</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japon</td><td></td><td>Shimalilte Ni réduit, 80/100 mesh</td></tr><tr><td>Iode</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>pour la synthèse de l’ADN, < 10 ppm H2O</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis Acétate</td><td></td> d’ammonium <td>de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>Éthanol glaciaire</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>96</td></tr> %<tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td>0,9 % </td></tr><tr><td>Hydroxyde de tétrabutylammonium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis Cartouche</td><td></td> SPE <td>de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Waters, Milford, MA, États-Unis</td><td></td><td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Colonne RP-HPLC semi-préparative</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm</td></tr><tr><td>Précolonne</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td></td><td>Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm</td></tr><tr><td>Précurseur</td><td>Université de Vienne, Autriche</td><td></td><td>Composé de référence SNAP-acid</td></tr><tr><td></td><td>Université de Vienne, Autriche</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>Trifluorométhanesulfonate d’argent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech, Deerfield, IL, États-Unis</td><td></td><td>80/100 mesh</td></tr><tr><td>PET trace 860 cyclotron</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 cible haute pression</td><td>Air Liquide, Vienne, Autriche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1 % O2</td><td>Air Liquide, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Target gas</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 2 : Liste des matériaux et de l’instrumentation du contrôle de la qualité de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Hitachi LaChrom, L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienne, Autriche)</td><td></td><td>Pompe HPLC</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japon)</td><td></td><td>Détecteur UV</td></tr><tr><td>Radiodétecteur NaI</td><td>Raytest (Straubenhardt, Allemagne)</td><td></td><td>Radiodétecteur NaI</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Allemagne)</td><td></td><td>Colonne HPLC</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (Brême, Allemagne)</td><td></td><td>Chromatographe en phase gazeuse</td></tr><tr><td>Colonne capillaire ID-BP20 ; 12 mx0.22 mmx0.25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australie)</td><td></td><td>Capillaire gazeux</td></tr><tr><td>Wesco, osmomètre Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (Vienne, Autriche)</td><td></td><td>Osmomètre</td></tr><tr><td>g-spectromètre</td><td></td><td></td><td>g-spectromètre logiciel</td></tr><tr><td>de contrôle de chromatographie en phase gazeuse</td><td>VARIAN (Palo Alto, Californie, États-Unis)Galaxie</td><td></td> <td>Version 1.9.302.952</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle du spectromètre gamma</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, États-Unis)</td><td></td><td>Maestro pour Windows Version 6.06</td></tr><tr><td>Spectre Gamma avec rappel du logiciel</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Winplots version 3.21</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle HPLC</td><td>Raytest (Straubenhardt, Allemagne)</td><td></td><td>Gina Star Version 5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW (Weilheim, Allemagne)</td><td></td><td>pH-mètre</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tableau 3 : Liste des matériaux et des instruments pour l’évaluation du comportement cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)</td><td></td><td>Expression de la glycoprotéine P humaine (hMDR1)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)</td><td>Institut néerlandais du cancer (NKI, Amsterdam, Pays-Bas)</td><td></td><td>Wildtype (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>In vitro expériences</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn ;)-Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, États-Unis)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, États-Unis)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Pipettes stériles jetables en plastique</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash ; 25 mL</td></tr><tr><td>Pointes de pipette stériles</td><td>VWR International GmbH, Vienne, Autriche</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 & micro ; L &ndash ; 200 et micro ; L</td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter bouchon à vis, N° fabricant658175</td></tr><tr><td>LigandTracer control Version 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suède.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suède.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suède.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>Logiciel GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé portable</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scepter (Cat.No. PHC00000)</td></tr><tr><td>Capteurs de compteur de cellules</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scepter Sensor 60 &micro ; m (Cat.No. PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [11c]snap-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

La tomographie par émission de positrons (TEP) est une technique essentielle d'imagerie moléculaire qui permet de mieux comprendre les voies et d'utiliser des radioligands ciblés spécifiques pour les enquêtes in vivo. Dans ce protocole, une radiosynthèse télécommandée robuste et fiable de [11C]SNAP-7941, un antagoniste au récepteur hormonal de mélanine-concentration 1, est décrite. La radiosynthèse commence avec le cyclotron produit [11C]CO2 qui est par la suite encore réagi par une transition de phase de gaz à [11C]CH3OTf. Ensuite, cet intermédiaire réactif est introduit à la solution précurseur et forme le radiotraceur respectif. La pureté chimique et la pureté radiochimique sont déterminées au moyen de RP-HPLC, régulièrement mis en œuvre dans le processus de contrôle de la qualité radiopharmaceutique. En outre, l'activité molaire est calculée car il s'agit d'une nécessité pour les enquêtes cinétiques en temps réel suivantes. En outre, [11C]SNAP-7941 est appliqué aux cellules MDCKII-WT et MDCKII-hMDR1 pour évaluer l'impact de l'expression de P-glycoprotéine (P-gp) sur l'accumulation cellulaire. Pour cette raison, la lignée cellulaire exprimante P-gp (MDCKII-hMDR1) est soit utilisée sans ou avec blocage avant les expériences au moyen du substrat P-gp ()-verapamil et les résultats sont comparés à ceux observés pour les cellules de type sauvage. L'approche expérimentale globale démontre l'importance d'une gestion précise du temps qui est essentielle pour chaque étude préclinique et clinique utilisant des traceurs de TEP radio-étiquetés avec des nucléides de courte durée, tels que le carbone-11 (demi-vie : 20 min).

La radiosynthèse entièrement automatisée de [11C]SNAP-7941 a donné 5,7 à 2,5 GBq (4,6 à 2,0 % à eOB, 14,9 à 5,9 % sur la base de [11C]CH3OTf; n - 10) du produit formulé. La synthèse globale a duré environ 40 min, où 15 min ont été nécessaires pour la préparation de [11C]CH3OTf par l'intermédiaire de la méthode de phase de gaz, un autre 5 min ont été nécessaires pour l'étiquetage du précurseur, suivi de 10 min de semi-préparative Purification RP-HPLC et 10 min pour l'extraction et la formulation de la phase solide de la cartouche C18. Ensuite, un petit aliquot (environ 100-200 L) a été livré à la personne responsable du contrôle de la qualité, tandis que le flacon de produit original contenant le traceur prêt à l'emploi a été transmis à l'expérimentateur de l'analyse cinétique en temps réel.
Le contrôle de la qualité a été effectué dans les 10 minutes suivant la fin de la synthèse. L'activité molaire était dans une gamme de 72 - 41 GBq / 'mol (n '10) et la pureté radiochimique a toujours été 'gt; 95%. Tous les autres paramètres (pH, osmolalité, solvants résiduels) remplissaient les critères de libération. Pour l'étude cinétique en temps réel, trois configurations expérimentales différentes ont été choisies : (A) traitées et non traitées (véhicule) cellules MDCKII-WT, (B) non traités ou traités avec des cellules MDCKII-hMDR1 véhicule et (C) la dernière ligne cellulaire avec le blocage avant le temps réel l'exemple cinétique du transporteur à l'aide d'un verapamil. L'application [11C]SNAP-7941 à la lignée cellulaire de type sauvage MDCKII-WT (P-gp non-exprimant) et MDCKII-hMDR1 (P-gp exprimant) montre un comportement cinétique différent, car il y a une accumulation rapide à la lignée cellulaire de type sauvage, alors qu'aucune accumulation n'a été observée pour les cellules MDCKII-hMDR1. Cependant, le blocage du transporteur d'efflux P-gp dans les cellules de MDCKII-hMDR1 avec le verapamil ()-verapamil a conduit à une cinétique comparable en temps réel comme déjà vu pour la lignée cellulaire de type sauvage (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> Figure 1 : Aperçu du flux de travail. Flux de travail de la radiosynthèse, contrôle de la qualité, et performance de la mesure cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941. Les flèches noires indiquent le mode de transport de la radioactivité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> Figure 2 : Schéma radiosynthétique du synthétiseur automatisé. Circuit de commutation du synthétiseur automatisé, à commencer par l'unité de circulation pour [11C]CH3I/[11C]CH3OTf production, réacteur pour introduction de l'activité dans la solution précurseur et purification DePE (SPE extraction en phase solide; Flacon de collecte de pcV et produit). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> Figure 3 : Chromatogrammes représentatifs de la radiosynthèse entièrement automatisée de [11C]SNAP-7841. Le chromatogramme semi-préparatif RP-HPLC est illustré en haut et en analyse après purification sur le fond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> Figure 4 : Préparation de plats de culture cellulaire pour des expériences en temps réel. L'étape 1 comprend l'ensemencement de 2,5 x 105 jusqu'à 1 x 106 selon le type de cellule et leur taux de croissance. Par la suite, le plat de culture est placé dans un plan oblique (environ 30-45 degrés). Par conséquent, l'appareil métallique fourni ou le couvercle d'un plat de culture cellulaire peut être utilisé dans l'incubateur pour stabiliser la position inclinée du plat. Le lendemain (24 h) le plat est ajusté horizontalement, et le milieu frais de culture cellulaire est ajouté pour couvrir complètement la surface cellulaire. Le jour de l'expérience, la viabilité cellulaire et la confluence sont examinées. Selon le protocole expérimental, les cellules sont lavées avec dPBS, le milieu est remplacé par un milieu sans sérum (2 mL), et le plat de culture est repositionné à une position oblique jusqu'au début des expériences. Désormais, les cellules peuvent être traitées avec l'inhibiteur ou le véhicule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> Figure 5 : Mesures cinétiques en temps réel de [11C]SNAP-7941. La cinétique représentative en temps réel de [11C]SNAP-7941 est présentée dans trois configurations différentes : l'utilisation de cellules MDCKII-WT; MDCKII-hMDR1 cellules pré-bloquées avec ()-verapamil comme inhibiteur de P-gp et cellules de MDCKII-hMDR1 sans blocage. L'axe y illustre le taux d'augmentation des cellules MDCKII-hMDR1 et WT prébloquées par rapport aux résultats des cellules MDCKII-MDR1 non traitées ou traitées par véhicule, respectivement (pas d'apport, 0 %). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ici, nous représentons un protocole pour la radioétiquetage entièrement automatisé de [11C]SNAP-7941 et l'analyse de la cinétique en temps réel de ce PET-tracer sur les cellules exprimantes et non-exprimantes P-gp.

Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

La radioétique carbone-11 permet d’utiliser de petits composés pour la tomographie par émission de positons ou la TEP sans changer la molécule. Ceci est essentiel pour étudier les niveaux d’expression des récepteurs. L’avantage de la radioétique carbone-11 est que nous pouvons utiliser le PET pour évaluer directement la cinétique des liaisons snap vers le récepteur hormonal à concentration de mélanine en temps réel.Snap comme antagoniste des récepteurs hormonaux à concentration de mélanine contribuera à une meilleure compréhension de ce récepteur et de son association avec des conditions métaboliques comme l’obésité et le diabète. Les transporteurs d’efflux exprimés à la barrière céphalo-encéphalique peuvent entraver considérablement l’utilisation des produits radiopharmaceutiques pour l’imagerie d’expression centrale de récepteur. Il est donc important d’évaluer les traces in vitro.La radiosynthèse automatisée du SNAP s’applique généralement aux composés de faible poids moléculaire radioétiques avec un groupe méthyle facilement évaluable. Une fois établie, cette procédure peut être adaptée à d’autres composés. Sarah Pfaff et Theresa Balber participeront à la démonstration.Pour commencer la synthèse SNAP carbone-11, installez un module de synthèse automatisé carbone-11 propre avec les réaccents et les matériaux appropriés. Démarrez le processus de synthèse SNAP sur l’ordinateur du module qui commencera par des vérifications du système et le conditionnement. Environ 30 à 40 minutes avant que le module ne soit prêt pour la livraison du C-11, sélectionnez la cible de dioxyde de carbone C-11 sur le cyclotron et démarrez le faisceau à 65 microamperes.Une fois que le module est prêt pour la livraison fermer la fenêtre intérieure et la porte extérieure. Confirmez que le piège à CO2 s’est refroidi à au moins 40 degrés Celsius et que le piège à méthane a commencé à refroidir. Une fois que le cyclotron a produit environ 120 gigabecquerels de CO2 C-11 cliquez sur OK dans le logiciel du module pour ouvrir le chemin de la cible à travers le piège à CO2.À l’ordinateur cyclotron commencer à livrer C-11 CO2 au module. Surveillez le transfert d’activité à l’ordinateur du module et assurez-vous qu’il procède à la réduction du CO2 au méthane après trois minutes. Surveillez le processus au fur et à mesure que le méthane qui en résulte est rincé au piège à méthane et converti en iodure méthylique par circulation à travers le four à iode.À la fin de la séquence de conversion attendre que les sous-produits sont rincés du piège à iodure méthylique à l’échappement, puis confirmer que le réacteur est prêt à recevoir de l’activité en cliquant sur OK. Surveillez le système lorsque l’iodure méthylique est libérée du piège, rincée à travers le four à triflate méthylique et piégée dans le réacteur. Lorsque l’activité dans les plateaux du réacteur confirme que le piégeage est terminé. Attendez que le mélange de réaction réagisse à 75 degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, surveillez le système lorsque le mélange de réaction est refroidi à moins de 35 degrés Celsius et trempé avec 1,5 millilitres d’eau. Surveillez le système lorsque le mélange de réaction est chargé dans la boucle d’injection hplc et est injecté dans la colonne hplc semi-préparatoire. Observez les traces du détecteur UV et gamma au fur et à mesure que la chromatographie progresse.Lorsque le pic du produit commence à apparaître manuellement commencer à recueillir le produit dans le flacon de collecte du fond rond dans le module. Terminez manuellement la collecte lorsque le signal gamma tombe en dessous d’environ 400 dénombrements par seconde. Observez le niveau de liquide dans la fiole du fond rond lorsque le produit est chargé sur une cartouche d’extraction en phase solide sous pression d’hélium.Une fois que le flacon est vide et que le liquide est passé à travers la cartouche SPE, cliquez sur OK pour commencer à laver les produits piégés sur la cartouche. Ensuite, surveillez l’activité dans le flacon de collecte des produits car le produit est d’abord écoulé de la cartouche dans le flacon, puis dilué avec 0,9% solution saline. Observez que la solution du produit est transférée sur le flacon du produit par filtre stérile sous pression d’hélium.Lorsque le transfert est terminé, fermez la vanne de sortie du produit. Lorsque le radiotraceur arrive dans le flacon du produit mesurer le rendement radioactif absolu. Ensuite, utilisez une seringue blindée au plomb pour transférer 100 microlitres du traceur sur un petit flacon pour un contrôle de la qualité.Apportez l’échantillon de contrôle de la qualité à une zone de travail protégée de contrôle de la qualité. Dessinez 40 microlitres de l’échantillon qc dans une seringue étanche au gaz, chargez-la dans un instrument HPLC préparé équipé d’une colonne analytique et injectez le produit. Effectuez d’autres mesures de contrôle de la qualité pendant l’exécuter HPLC.Une fois que la course HPLC a terminé intégrer tous les pics dans le chromatogramme du détecteur de radioactivité pour déterminer si la pureté chimique radio SNAP est supérieure à 95%Intégrer les pics dans le chromatogramme UV pour déterminer la pureté chimique du produit. Utilisez la zone sous le pic du produit UV pour calculer l’activité spécifique. Une fois que le produit a été confirmé pour répondre aux exigences d’utilisation, relâchez le traceur radio au laboratoire d’expérimentation cinétique en temps réel.Au moins 30 minutes avant l’expérience laver le type sauvage préparé ou les cellules transfectées avec DPBS et ajouter deux millilitres de milieu de croissance sans sérum. Pour bloquer les cellules transfectées ajouter 0,98 microlitres d’une solution de 20,4 millimilliles d’hydrochlorure verapamil racemic dans le sulfure de diméthyle. Incuber les cellules sur un plan oblique pendant 30 minutes.Ensuite, allumez l’instrument d’analyse en temps réel et l’ordinateur associé. Ouvrez le logiciel de contrôle et choisissez une cible. Définissez le nombre de positions à deux, le temps de détection à trois secondes, le délai de détection à deux secondes, et le nom de la première phase à la ligne de base.Insérez le plat de culture cellulaire dans le support incliné de l’appareil avec le pôle cellulaire sur le côté inférieur. Assurez-vous que le pôle cellulaire est recouvert d’un milieu de culture cellulaire. Démarrez une mesure d’arrière-plan de 10 minutes et définissez le nom de fichier et le chemin.Réglez l’échelle de temps en minutes et la collecte de nucléides au carbone-11. Configurez le graphique pour afficher les données cibles soustraites en arrière-plan, cible et arrière-plan. Une fois que le traceur radio a été livré et approuvé pour une utilisation, prendre un petit échantillon pour l’analyse.Calculez le volume nécessaire de solution de traceur radio et préparez une pipette. Dans le logiciel d’instrument, interrompez la course et attendez que la rotation du plat s’arrête. Ouvrez le couvercle de l’appareil, tournez le support à 90 degrés vers la gauche, ajoutez le traceur radio avec la pipette préparée et retournez l’appareil à sa position initiale.Fermez le couvercle de l’appareil et reprenez immédiatement l’expérience. Laissez l’expérience s’exécuter pendant 20 minutes avant de la terminer. Traiter et analyser les données pour évaluer l’absorption snap dans les cellules.Maintenant, la procédure peut être répétée pour le plat de culture cellulaire de contrôle traité par DMSO et la lignée cellulaire de type sauvage. Des essais cinétiques en temps réel ont été exécutés avec des cellules non-PGP exprimant des cellules sauvages de type, des cellules PGP-exprimant pré-bloquées avec le verapamil comme inhibiteur de PGP, et des cellules de PGP débloquées. Aucune différence significative n’a été observée entre les cellules non traitées et les cellules traitées par véhicule.Le CARBONE-11 SNAP s’est rapidement accumulé dans les cellules sauvages tandis qu’aucune accumulation n’a été observée dans les cellules exprimant le PGP. Le prébloquage du transporteur d’efflux PGP avec verapamil a entraîné une accumulation snap dans les cellules PGP comparable à celle des cellules sauvages. En combinaison avec des mesures cinétiques en temps réel, cette mise en place permet une large compréhension de la pharmacocinétique des composés de faible poids moléculaire et est donc très importante pour le développement préclinique des produits radiopharmaceutiques.Le timing et l’organisation sont les principaux ingrédients d’une radiosynthèse carbone-11 réussie avec des expériences cinétiques ultérieures en temps réel, car la demi-vie du carbone-11 n’est que de 20 minutes. En raison d’une courte demi-vie de carbone-11 de nombreuses parties de cette procédure sont effectuées simultanément. Il est important que toutes les parties concernées comprennent la portée et le moment de leur rôle.La sécurité des produits et la radioprotection sont essentielles à la préparation des produits radiopharmaceutiques. Toutes les expériences doivent suivre le principe aussi bas que raisonnablement réalisable ou ALARA pour limiter l’exposition aux rayonnements de l’opérateur.

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