Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [¹¹C]SNAP-7941

La radioétique carbone-11 permet d’utiliser de petits composés pour la tomographie par émission de positons ou la TEP sans changer la molécule. Ceci est essentiel pour étudier les niveaux d’expression des récepteurs. L’avantage de la radioétique carbone-11 est que nous pouvons utiliser le PET pour évaluer directement la cinétique des liaisons snap vers le récepteur hormonal à concentration de mélanine en temps réel.

Snap comme antagoniste des récepteurs hormonaux à concentration de mélanine contribuera à une meilleure compréhension de ce récepteur et de son association avec des conditions métaboliques comme l’obésité et le diabète. Les transporteurs d’efflux exprimés à la barrière céphalo-encéphalique peuvent entraver considérablement l’utilisation des produits radiopharmaceutiques pour l’imagerie d’expression centrale de récepteur. Il est donc important d’évaluer les traces in vitro.

La radiosynthèse automatisée du SNAP s’applique généralement aux composés de faible poids moléculaire radioétiques avec un groupe méthyle facilement évaluable. Une fois établie, cette procédure peut être adaptée à d’autres composés. Sarah Pfaff et Theresa Balber participeront à la démonstration.

Pour commencer la synthèse SNAP carbone-11, installez un module de synthèse automatisé carbone-11 propre avec les réaccents et les matériaux appropriés. Démarrez le processus de synthèse SNAP sur l’ordinateur du module qui commencera par des vérifications du système et le conditionnement. Environ 30 à 40 minutes avant que le module ne soit prêt pour la livraison du C-11, sélectionnez la cible de dioxyde de carbone C-11 sur le cyclotron et démarrez le faisceau à 65 microamperes.

Une fois que le module est prêt pour la livraison fermer la fenêtre intérieure et la porte extérieure. Confirmez que le piège à CO2 s’est refroidi à au moins 40 degrés Celsius et que le piège à méthane a commencé à refroidir. Une fois que le cyclotron a produit environ 120 gigabecquerels de CO2 C-11 cliquez sur OK dans le logiciel du module pour ouvrir le chemin de la cible à travers le piège à CO2.

À l’ordinateur cyclotron commencer à livrer C-11 CO2 au module. Surveillez le transfert d’activité à l’ordinateur du module et assurez-vous qu’il procède à la réduction du CO2 au méthane après trois minutes. Surveillez le processus au fur et à mesure que le méthane qui en résulte est rincé au piège à méthane et converti en iodure méthylique par circulation à travers le four à iode.

À la fin de la séquence de conversion attendre que les sous-produits sont rincés du piège à iodure méthylique à l’échappement, puis confirmer que le réacteur est prêt à recevoir de l’activité en cliquant sur OK. Surveillez le système lorsque l’iodure méthylique est libérée du piège, rincée à travers le four à triflate méthylique et piégée dans le réacteur. Lorsque l’activité dans les plateaux du réacteur confirme que le piégeage est terminé. Attendez que le mélange de réaction réagisse à 75 degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, surveillez le système lorsque le mélange de réaction est refroidi à moins de 35 degrés Celsius et trempé avec 1,5 millilitres d’eau. Surveillez le système lorsque le mélange de réaction est chargé dans la boucle d’injection hplc et est injecté dans la colonne hplc semi-préparatoire. Observez les traces du détecteur UV et gamma au fur et à mesure que la chromatographie progresse.

Lorsque le pic du produit commence à apparaître manuellement commencer à recueillir le produit dans le flacon de collecte du fond rond dans le module. Terminez manuellement la collecte lorsque le signal gamma tombe en dessous d’environ 400 dénombrements par seconde. Observez le niveau de liquide dans la fiole du fond rond lorsque le produit est chargé sur une cartouche d’extraction en phase solide sous pression d’hélium.

Une fois que le flacon est vide et que le liquide est passé à travers la cartouche SPE, cliquez sur OK pour commencer à laver les produits piégés sur la cartouche. Ensuite, surveillez l’activité dans le flacon de collecte des produits car le produit est d’abord écoulé de la cartouche dans le flacon, puis dilué avec 0,9% solution saline. Observez que la solution du produit est transférée sur le flacon du produit par filtre stérile sous pression d’hélium.

Lorsque le transfert est terminé, fermez la vanne de sortie du produit. Lorsque le radiotraceur arrive dans le flacon du produit mesurer le rendement radioactif absolu. Ensuite, utilisez une seringue blindée au plomb pour transférer 100 microlitres du traceur sur un petit flacon pour un contrôle de la qualité.

Apportez l’échantillon de contrôle de la qualité à une zone de travail protégée de contrôle de la qualité. Dessinez 40 microlitres de l’échantillon qc dans une seringue étanche au gaz, chargez-la dans un instrument HPLC préparé équipé d’une colonne analytique et injectez le produit. Effectuez d’autres mesures de contrôle de la qualité pendant l’exécuter HPLC.

Une fois que la course HPLC a terminé intégrer tous les pics dans le chromatogramme du détecteur de radioactivité pour déterminer si la pureté chimique radio SNAP est supérieure à 95%Intégrer les pics dans le chromatogramme UV pour déterminer la pureté chimique du produit. Utilisez la zone sous le pic du produit UV pour calculer l’activité spécifique. Une fois que le produit a été confirmé pour répondre aux exigences d’utilisation, relâchez le traceur radio au laboratoire d’expérimentation cinétique en temps réel.

Au moins 30 minutes avant l’expérience laver le type sauvage préparé ou les cellules transfectées avec DPBS et ajouter deux millilitres de milieu de croissance sans sérum. Pour bloquer les cellules transfectées ajouter 0,98 microlitres d’une solution de 20,4 millimilliles d’hydrochlorure verapamil racemic dans le sulfure de diméthyle. Incuber les cellules sur un plan oblique pendant 30 minutes.

Ensuite, allumez l’instrument d’analyse en temps réel et l’ordinateur associé. Ouvrez le logiciel de contrôle et choisissez une cible. Définissez le nombre de positions à deux, le temps de détection à trois secondes, le délai de détection à deux secondes, et le nom de la première phase à la ligne de base.

Insérez le plat de culture cellulaire dans le support incliné de l’appareil avec le pôle cellulaire sur le côté inférieur. Assurez-vous que le pôle cellulaire est recouvert d’un milieu de culture cellulaire. Démarrez une mesure d’arrière-plan de 10 minutes et définissez le nom de fichier et le chemin.

Réglez l’échelle de temps en minutes et la collecte de nucléides au carbone-11. Configurez le graphique pour afficher les données cibles soustraites en arrière-plan, cible et arrière-plan. Une fois que le traceur radio a été livré et approuvé pour une utilisation, prendre un petit échantillon pour l’analyse.

Calculez le volume nécessaire de solution de traceur radio et préparez une pipette. Dans le logiciel d’instrument, interrompez la course et attendez que la rotation du plat s’arrête. Ouvrez le couvercle de l’appareil, tournez le support à 90 degrés vers la gauche, ajoutez le traceur radio avec la pipette préparée et retournez l’appareil à sa position initiale.

Fermez le couvercle de l’appareil et reprenez immédiatement l’expérience. Laissez l’expérience s’exécuter pendant 20 minutes avant de la terminer. Traiter et analyser les données pour évaluer l’absorption snap dans les cellules.

Maintenant, la procédure peut être répétée pour le plat de culture cellulaire de contrôle traité par DMSO et la lignée cellulaire de type sauvage. Des essais cinétiques en temps réel ont été exécutés avec des cellules non-PGP exprimant des cellules sauvages de type, des cellules PGP-exprimant pré-bloquées avec le verapamil comme inhibiteur de PGP, et des cellules de PGP débloquées. Aucune différence significative n’a été observée entre les cellules non traitées et les cellules traitées par véhicule.

Le CARBONE-11 SNAP s’est rapidement accumulé dans les cellules sauvages tandis qu’aucune accumulation n’a été observée dans les cellules exprimant le PGP. Le prébloquage du transporteur d’efflux PGP avec verapamil a entraîné une accumulation snap dans les cellules PGP comparable à celle des cellules sauvages. En combinaison avec des mesures cinétiques en temps réel, cette mise en place permet une large compréhension de la pharmacocinétique des composés de faible poids moléculaire et est donc très importante pour le développement préclinique des produits radiopharmaceutiques.

Le timing et l’organisation sont les principaux ingrédients d’une radiosynthèse carbone-11 réussie avec des expériences cinétiques ultérieures en temps réel, car la demi-vie du carbone-11 n’est que de 20 minutes. En raison d’une courte demi-vie de carbone-11 de nombreuses parties de cette procédure sont effectuées simultanément. Il est important que toutes les parties concernées comprennent la portée et le moment de leur rôle.

La sécurité des produits et la radioprotection sont essentielles à la préparation des produits radiopharmaceutiques. Toutes les expériences doivent suivre le principe aussi bas que raisonnablement réalisable ou ALARA pour limiter l’exposition aux rayonnements de l’opérateur.