Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique
23 août 2019
Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique. les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.
Isoler les cellules progénitrices musculaires humaines qui régulent la régénération musculaire squelettique nous permet d’étudier les processus qui sous-tendent le processus de régénération tout en conservant la variabilité du donneur. Cette technique permet d’obtenir de grands rendements de cellules progénitrices musculaires humaines à partir de petites quantités de tissus et de leur analyse phénotypique à l’aide d’un petit nombre de cellules. Cette méthode est spécifiquement conçue pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines afin de suivre leurs capacités de prolifération et de différenciation et de relier ces données au processus de régénération musculaire squelettique.
L’aspect le plus difficile de cette technique assez simple est de s’assurer que chaque étape est effectuée reproductiblement pour optimiser le rendement et la pureté des cellules. Il y a plusieurs étapes qui doivent être accomplies pour l’isolement réussi des cellules. Plusieurs étapes sont plus faciles à comprendre si elles sont observées visuellement.
Pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines des tissus de biopsie, placez le tissu musculaire dans une boîte de Pétri stérile dans des conditions stériles, et utilisez un scalpel stérile pour hacher le tissu en morceaux en cubes d’un millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBS, et permettre aux tissus de se déposer par gravité avant d’aspirer soigneusement le supernatant sans déranger le tissu. Après avoir lavé les fragments une deuxième fois comme nous venons de le démontrer, remplacez le PBS par 10 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco à faible teneur en glucose.
Enlever le supernatant après que les tissus ont été réglés, et resuspendre les morceaux en trois millilitres de milieu de digestion. Placez les tissus à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, avec trituration des fragments musculaires toutes les 10 minutes avec une pipette sérologique d’un millilitre. À la fin de l’incubation, ajouter 83 microlitres de milieu de digestion supplémentaire et 24 microlitres de solution Dispase aux échantillons, et triturer les tissus toutes les cinq à 10 minutes avec une pointe de pipette à alésage large jusqu’à ce qu’une boue uniforme soit atteinte.
Une boue uniforme est importante pour la récupération maximale des cellules progénitrices musculaires humaines. Continuez la digestion si le lisier ne passe pas par une pointe standard de pipette de 1000 microlitres. Isoler les cellules pax7-positives, tacher et la porte des cellules selon le protocole.
Trier le CD56, CD29 double positif cellules progénitrices musculaires humaines sur un cytomètre d’écoulement avec une buse de 100 micromètres à une pression de 20 livres par pouce carré dans des tubes de collecte contenant un coussin de 300 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Puis ensemencer les cellules progénitrices du muscle humain triées en plaques de 24 puits recouvertes de collagène contenant un milieu de croissance préchauffé à une concentration de 3,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre de concentration carrée. Pour effectuer des analyses de confluence, chargez la plaque sur un cytomètre d’imagerie et sélectionnez Créer un nouveau scan et la catégorie plaque, profil de plaque et application ID.Under de la plaque, sélectionnez Confluence et Confluence 1, et sélectionnez un puits à afficher.
Localisez un plan de mise au point dans lequel les cellules apparaissent blanches par rapport à l’arrière-plan, et sélectionnez Registre Manuel. Utilisez la souris pour mettre en évidence tous les puits qui doivent être scannés et sélectionnez Démarrer l’analyse. Toute la zone du puits sera automatiquement scannée.
Sélectionnez les paramètres d’analyse qui sont optimaux pour le type de plaque et de cellule, et sélectionnez Analyse de démarrage. Utilisez le cytomètre d’imagerie pour mesurer la confluence au départ. Ensuite, pour compter les cellules sur le cytomètre d’imagerie, remplacer le milieu dans chaque puits par 200 microlitres de solution de coloration.
Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, remplacer la solution de coloration par 100 microlitres de F12 de jambon frais. Retournez la plaque au cytomètre d’imagerie, et sous application, sélectionnez Viabilité cellulaire et Live Dead Total. La chaîne Live sera une image à champ lumineux, la chaîne Dead montrera la coloration propidium iodée, et le canal Total sera la coloration Hoechst 33342.
Sous configuration focus, cliquez sur Enregistrer auto. Sous le canal Total, réglez le canal en bleu. Utilisez Find Focus pour mettre les noyaux au point, et cliquez sur Set Offset pour sélectionner la mise au point.
Sous le canal Dead, réglez le canal en rouge et utilisez Find Focus pour mettre les cellules mortes au point. Cliquez sur Définir Offset pour sélectionner la mise au point et sélectionnez Démarrer l’analyse pour démarrer l’analyse. Sélectionnez ensuite les paramètres d’analyse qui conviennent au type de plaque et de cellule, et sélectionnez Démarrer l’analyse pour commencer l’analyse.
Lorsque l’analyse est terminée, vérifiez visuellement que l’analyse a correctement compté les cellules. Si l’analyse et l’analyse sont satisfaisantes, retournez la plaque à l’incubateur, rescan ou modifiez les paramètres d’analyse. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être identifiées par les premiers événements de gating basés sur la zone de dispersion latérale et avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivies en sélectionnant seulement les cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables.
Les cellules qui sont positives pour les marqueurs de surface des cellules CD56 et CD29 représentent alors la population de cellules progénitrices musculaires humaines. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent également être identifiées par leur expression Pax7. En effet, Pax7 est enrichi dans la population totale après FACS et est maintenu par de multiples passages.
Ici, un balayage représentatif de confluence est montré. Les contours verts ont été générés par le cytomètre d’imagerie et montrent comment le cytomètre d’imagerie a déterminé la confluence en fonction des paramètres d’analyse sélectionnés. L’hétérogénéité et le dénombrement des noyaux sont fréquents entre les donneurs.
La découverte et la caractérisation précise de cette hétérogénéité est une application clé du cytomètre d’imagerie. Les mesures de confluence et le dénombrement des noyaux des donneurs uniques, cependant, sont fortement corrélés. Les cellules progénitrices musculaires humaines différenciées pour former des myotubes peuvent être distinguées par leur expression embryonnaire de chaîne lourde de myosine.
Il est important d’être cohérent lors de la sélection des paramètres de gating sur le cytomètre d’écoulement afin d’isoler la même population de cellules de chaque donneur. Une fois isolées, les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être utilisées à des fins multiples, y compris l’identification des exigences métaboliques uniques de prolifération et de différenciation des cellules progénitrices musculaires humaines. L’isolement des cellules progénitrices musculaires humaines a permis de discrimination des différences dans l’expression des marqueurs de surface cellulaire sur les cellules progénitrices musculaires humaines et souris.
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Aperçu
Cet article présente des techniques permettant d'isoler et de caractériser des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (hMPCs) à partir de tissu de biopsie musculaire squelettique. Ces méthodes permettent aux chercheurs d'étudier la myogenèse humaine et la régénération du muscle squelettique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Médecine régénérative
Contexte
- Les cellules progénitrices musculaires humaines jouent un rôle essentiel dans la régénération du muscle squelettique.
- La mise en isolement de ces cellules permet l'étude des processus régénératifs tout en tenant compte de la variabilité entre donneurs.
- Les techniques d'isolement cellulaire doivent être reproductibles afin de garantir un rendement et une pureté optimaux.
- L'observation visuelle des étapes d'isolement peut améliorer la compréhension.
Objectif de l'étude
- Isoler des cellules progénitrices musculaires humaines pour des recherches sur la régénération musculaire.
- Analyser les capacités de prolifération et de différenciation de ces cellules.
- Mettre les résultats en relation avec le processus global de régénération du muscle squelettique.
Méthodes utilisées
- Isolation de cellules souches myogéniques humaines à partir d'un prélèvement biopsique de tissu musculaire squelettique.
- Caractérisation des cellules isolées.
- Analyse phénotypique à l'aide de faibles quantités de cellules.
- Suivi des capacités de prolifération et de différenciation.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules hMPC à partir d'échantillons tissulaires minimes.
- La caractérisation des cellules démontre leur potentiel pour des applications de recherche.
- La reproductibilité de la méthode assure des résultats fiables.
- Des connaissances approfondies sur le processus régénératif du muscle squelettique sont obtenues.
Conclusions
- Les techniques présentées sont efficaces pour isoler et étudier les hMPC.
- Ces méthodes peuvent approfondir la compréhension de la régénération musculaire.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur ces résultats pour explorer des applications thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
L'isolement et la caractérisation de cellules progénitrices musculaires humaines (hMPCs) à partir de biopsies musculaires squelettiques permettent une détection mécanistique des risques lors de la validation de cibles dans la régénération musculaire. Cette approche soutient le criblage phénotypique et le développement de tests en fournissant un système pertinent pour la maladie, avec une hétérogénéité des donneurs reflétant la variabilité clinique. La méthode améliore la confiance prédictive des modèles précliniques en reliant la capacité d'expansion cellulaire aux résultats de régénération du muscle squelettique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées aux voies de régénération du muscle squelettique.
- Valeur opérationnelle : Contribue à l'atténuation des risques biologiques par la validation fonctionnelle de la prolifération et de la différenciation des PCMh.
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en reliant les phénotypes cellulaires aux processus régénératifs.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit un système standardisé et reproductible pour la préparation d'échantillons biologiques validés destinés à des analyses en aval.
- Valeur opérationnelle : Permet des mesures quantitatives de la confluence et du nombre de noyaux par cytométrie d'imagerie afin de normaliser les tests.
- Valeur scientifique : Facilite l'extensibilité des tests et la réutilisation des plateformes grâce à des protocoles cohérents d'isolement et de mise en culture.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Offre un système pertinent pour l'étude de la variabilité de la capacité d'expansion entre donneurs, apportant des informations pour l'alignement des biomarqueurs translationnels.
- Valeur opérationnelle : Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en maintenant l'expression de Pax7 et le potentiel de différenciation en myotubes.
- Valeur scientifique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en identifiant les mécanismes sous-jacents à l'hétérogénéité du potentiel régénératif.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la continuité du processus de découverte, depuis la validation de la cible jusqu'à l'identification de composés précurseurs et l'évaluation préclinique, en fournissant des phénotypes cellulaires quantifiables et stratifiés selon les donneurs.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant le suivi de la prolifération et de la différenciation des hMPC isolées.
- Criblage : Assure la préparation et la reproductibilité des tests grâce à une digestion tissulaire standardisée, un tri FACS et un ensemencement sur plaques revêtues de collagène.
- Analytique : Produit des analyses quantitatives de la confluence et des décomptes de noyaux permettant la comparaison entre donneurs et l'évaluation des différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce au maintien de la capacité de différenciation myogénique et de l'expression de la chaîne lourde de myosine embryonnaire dans les myotubes formés.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place un protocole d'isolement et de caractérisation réutilisable, applicable à plusieurs échantillons de donneurs et à diverses conditions expérimentales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la corrélation entre l'expansion cellulaire et la capacité régénérative.
- Valeur opérationnelle : Normalisation et reproductibilité du rendement cellulaire et de la pureté grâce à des étapes optimisées de digestion et de tri.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions « aller/ne pas aller » en permettant une évaluation stratifiée selon les donneurs de la fonctionnalité des cellules progénitrices musculaires.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation des cibles de régénération fondée sur les risques, à l’aide de métriques de capacité d’expansion informées par l’hétérogénéité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de tissus primaires, la cytométrie en flux et la cytométrie d'imagerie pour l'isolement et l'analyse de cellules viables.
- Dépend d'une infrastructure stérile de culture tissulaire, d'un équipement de tri cellulaire activé par fluorescence et de plateformes d'imagerie automatisées.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de sélection (gating) pour CD56/CD29 et Pax7 afin d'assurer une identification cohérente des hMPC entre différents donneurs.
- Exige des adaptations en fonction de la qualité du tissu du donneur et de la taille de la biopsie afin de maintenir l'efficacité de l'isolement.
- Les limites pratiques incluent la variabilité dépendante du donneur en termes de rendement cellulaire et de cinétiques d'expansion, nécessitant des tailles d'échantillons plus importantes pour assurer une puissance statistique adéquate.
