Name: Analyse cytométrique de flux des espèces réactives doxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de souris. Cette méthode permet d'évaluer l'impact des manipulations génétiques sur le métabolisme cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par le Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l'American Society of Hematology Scholar Award (SMS), l'American Cancer Society RSG (SMS) et le Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Fox Chase Cancer Center.
REMARQUE: Le flux de travail du protocole est divisé en 4 parties telles qu'elles sont présentées à la figure 1 et les réactifs requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.
1. Isolement de moelle osseuse (BM)
REMARQUE: Des souris de leucémie de MLL-AF9 ont été produites comme décrit précédemment11.
<ol><li>Récupérer les cellules mononucléaires de moelle osseuse, comme décrit précédemment12,13,14,15, de type sauvage C57.Bl6 souris (qui expriment le marqueur congénique CD45.2) ainsi que de C57. Souris Bl6-SJL (qui expriment le marqueur congénique CD45.1) qui ont été transplantées avec des cellules leucémiques exprimant MLL-AF9 (CD45.2). REMARQUE: BM peut être récupéré à partir de souris soit en écrasant12,13 ou en rinçant les os14,15. Pour les expériences présentées ici, BM a été récupéré à la fois des souris saines et la leucémie via le rinçage.</li>
</ol>2. La coloration fluorogénique mitochondriale de teinture de ROS
<ol><li>Une fois que les cellules mononucléaires de moelle osseuse ont été récupérées de souris saines et/ou de leucémie, tachez un aliquot de cellules avec Le bleu de Trypan et comptez utilisant un hémocytomètre pour déterminer le nombre de départ des cellules totales de BM.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en F-PBS (PBS complété par 2% de sérum bovin fœtal et un cocktail pénicilline/streptomycine de 1%) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Aliquot 200 L de suspension cellulaire par tube en 9 tubes de commande monocolore étiquetés comme suit : Aucune tache, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (pour les HSPC sains seulement), CD45.2-APC (pour les cellules leucémiques seulement), CD34-FITC, colorant mitochondrial ROS et tache de cellules vivantes/mortes. REMARQUE: (Facultatif) Un contrôle positif pour l'induction du ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 105 cellules dans 200 L avec 20 M de Bisulfite de sodium de Menadione (MSB) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. Un deuxième contrôle pour inverser l'induction MSB-négociée de ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 105 cellules dans 200 L avec 20 M M de MSB plus 100 M N-acetyl-L-cystéine (NAC) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %.</li>
	<li>Aliquot les cellules restantes dans un tube (tube expérimental) et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans F-PBS avec une tache de cellule vivante /morte selon les instructions du fabricant. Incuber sur la glace pendant 30 min. Assurez-vous d'ajouter des taches vivantes/mortes au tube de commande d'une seule couleur.</li>
	<li>Ajouter 1,0 ml de F-PBS à température ambiante (RT) aux tubes monocolores et expérimentaux tachés du colorant vivant/mort. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.</li>
	<li>Resuspendre 50 g du colorant ROS mitochondrial dans 13 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour obtenir une solution de stock de 5 mM.</li>
	<li>Diluer le colorant ROS mitochondrial jusqu'à une concentration finale de 5 M dans RT F-PBS avec ou sans Verapamil (50 M).</li>
	<li>Aspirez le lavage de la tache de cellule vivante/morte. Ajoutez 200 ll de tache mitochondriale de colorant ROS contenant du Verapamil à chaque tube expérimental ainsi que le tube de contrôle monocolore de teinture ROS mitochondrial.</li>
	<li>Vortex à mélanger et incuber pendant 10 min à 37 oC dans l'obscurité.</li>
	<li>Ajoutez 1,0 ml de RT F-PBS aux tubes mitochondriques de contrôle unicolore et d'expérimentation souillés par ROS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et laver les cellules avec un supplément de 1,0 ml de RT F-PBS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.</li>
</ol>3. Staining d'anticorps de lignée
<ol><li>Préparer les cocktails d'anticorps énumérés dans le tableau 1. REMARQUE: Ces cocktails d'anticorps ont été optimisés précédemment14,15,16.</li>
	<li>Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant bM sain et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #1 à chaque tube. Vortex à mélanger. Préparez également les tubes de commande unicolore. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.</li>
	<li>Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant la leucémie BM et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #2 à chaque tube. Vortex à mélanger. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.</li>
	<li>Laver avec 1,0 ml de F-PBS froid et centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 500 L de F-PBS froid et filtrer les cellules dans un tube cytomètre d'écoulement à l'aide d'un filtre de 40 m pour exclure les agrégats.</li>
</ol>4. Acquisition et analyse de la cytométrie de flux
REMARQUE: Plusieurs sous-ensembles de tiges et d'ancêtres hématopoïétiques sont rares, comme les cellules souches hématopoïétiques à long terme. Ainsi, idéalement 3-5 millions d'événements devraient être rassemblés pour chaque tube expérimental pendant l'acquisition de cytométrie de flux pour l'analyse suffisante du ROS mitochondrial dans les divers sous-ensembles de HSPC.
<ol><li>Utilisez le tube de commande sans tache pour définir les parcelles de dispersion vers l'avant (FSC-A) et latérales (SSC-A) en fonction de la taille et de la complexité de la population cellulaire analysée.</li>
	<li>Utilisez les tubes de contrôle sans taches et monocolores pour compenser le cytomètre d'écoulement.</li>
	<li>Portez les débris extérieurs de la parcelle de dispersion vers l'avant et latérale(figure 2A,B, premier panneau à partir de la gauche).</li>
	<li>Portez les doublets à l'aide d'un double discriminateur tel que le discriminateur avant (Figure 2A,B, deuxième panneau à partir de la gauche).</li>
	<li>Suivez la stratégie de gating proposée dans la figure 2A,B pour sélectionner les cellules vivantes, les cellules basses de lignée et les divers sous-ensembles de HSPC et de leucémie.</li>
	<li>Pour chaque population d'intérêt, analyser l'intensité médiane de fluorescence (IMF) du canal TRPE (axe X) dans une parcelle d'histogramme pour évaluer les différences dans le signal ROS mitochondrial(figure 3A-C, panneaux gauches). Les niveaux de ROS mitochondrial peuvent être évalués au niveau unicellulaire en comparant la coloration mitochondriale de ROS par rapport aux marqueurs spécifiques de lignée dans une parcelle de dispersion.</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
<li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+cell+state+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).</li>
<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
<li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li>
<li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li>
<li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FFOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776(2008).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
<li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les colorants fluorogéniques qui ont été développés pour la détection de ROS sont fréquemment évalués dans les cellules fixes par microscopie ou dans les cellules vivantes par cytométrie de flux22. L'évaluation cytométrique de flux du ROS mitochondrial dans les cellules de BM utilisant les colorants fluorogenic mitochondriaux de ROS a deux avantages principaux : 1) C'est une technique rapide et simple qui convient à l'analyse de cellules vivantes et 2) elle permet de distinguer et d'analyser rare ...

Les espèces réactives d'oxygène (ROS) sont des molécules fortement réactives dérivées de l'oxygène moléculaire. L'emplacement cellulaire le plus bien défini de la production de ROS est les mitochondries, où les électrons qui passent par la chaîne de transport d'électrons (ETC) pendant la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont absorbés par l'oxygène moléculaire menant à la formation d'un spécifique type de ROS appelé superoxydes1. Grâce aux actions d'une série d'enzymes, appelées dismutases de superoxyde ou SODs, les superoxydes sont convertis en peroxydes d'hydrogène, qui sont ensuite neutralisés en eau par des enzymes telles que la catalase ou les peroxidases de glutathion (GPX). Les perturbations dans les mécanismes de régulation ROS peuvent conduire à la production excédentaire de ROS, souvent appelé stress oxydatif, qui ont des conséquences cellulaires nocives et potentiellement mortelles telles que les dommages aux macromolécules (c.-à-d. ADN, protéines, lipides). En outre, le stress oxydatif est lié à plusieurs pathologies, telles que le diabète, les maladies inflammatoires, le vieillissement et les tumeurs2,3,4. Pour maintenir l'homéostasie redox et prévenir le stress oxydatif, les cellules possèdent une variété de mécanismes ros-régulateur5.
Les niveaux physiologiques de certains ROS sont nécessaires pour l'hématopoiesis embryonnaire et adulteapproprié 6. Cependant, l'excès de ROS est associé aux dommages d'ADN, à la différenciation cellulaire et à l'épuisement de la tige hématopoïétique et de la piscine d'ancêtre. Il existe également des preuves que les altérations de la biologie du redox peuvent différer entre la leucémie et les cellules saines. Par exemple, les niveaux de ROS ont tendance à être plus élevés dans les cellules de leucémie myéloïde aigue (LAM) par rapport à leurs homologues en bonne santé et d'autres études ont suggéré que les cellules souches de leucémie maintiennent un faible niveau stable de ROS pour la survie7,8. Fait important, les stratégies de capitalisation thérapeutique sur ces différences redox se sont avérées prometteuses dans plusieurs contextes de cancer humain9,10. Par conséquent, les essais qui permettent l'évaluation des niveaux de ROS dans les modèles de souris peuvent améliorer notre compréhension de la façon dont ces espèces contribuent à la physiologie cellulaire et la pathogénie de la maladie ainsi que potentiellement fournir une plate-forme pour évaluer l'efficacité de de nouvelles thérapies anticancéreuses ciblant le redox.

<table><tbody><tr><td>Heat inactivated FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>Milieu</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Média</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>15 mL tube conique</td><td>BD falcon</td><td>352096</td><td>Fournitures de culture tissulaire</td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>BD falcon</td><td>352098</td><td>Tissu Fournitures de culture</td></tr><tr><td>40 &mu ; Passoires à cellules m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Fournitures de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751</td><td>Fournitures de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Menadione sodium Bisulfite</td><td>Sigma aldrich</td><td>M5750</td><td>Pro-oxydant</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma aldrich</td><td>A7250</td><td>Anti-oxydant</td></tr><tr><td>CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>anticorps</td></tr><tr><td>CD4 Clone PE-Cy5 RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD8 Clone PE-Cy5 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD19 Clone PE-Cy5 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>B220 Clone PE-Cy5 RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Gr1 Clone PE-Cy5 RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108410</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Ter119 Clone PE-Cy5 Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD48 Clone PE-Cy5 HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD117&nbsp ; Clone APC-Cy7 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Sca1 peacific Clone Blue D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD150 Clone APC TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD34 FITC clone RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>CD45.2 Clone APC 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>MitoSOX Rouge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Colorant</td></tr><tr><td>Mitotracker Vert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Colorant</td></tr><tr><td>Colorant Jaune vif/mort Colorant ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>L34967</td><td>Colorant</td></tr></tbody></table>

analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de murine et la leucémie entraînée mll-af9

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Nous présentons une approche cytométrique de flux pour analyser le ROS mitochondrial dans diverses populations vivantes de cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM) provenant de souris en bonne santé ainsi que de souris atteintes de LAM entraînées par MLL-AF9. Plus précisément, nous décrivons un processus de coloration cellulaire en deux étapes, par lequel les cellules saines ou la leucémie BM sont d'abord tachées d'un colorant fluorogénique qui détecte les superoxydes mitochondriaux, suivie de coloration avec des anticorps monoclonaux fluorochrome-liés qui sont utilisés pour distinguer diverses populations hématopoïétiques saines et malignes. Nous fournissons également une stratégie pour l'acquisition et l'analyse des échantillons par cytométrie de flux. L'ensemble du protocole peut être réalisé dans un délai aussi court que 3-4 h. Nous soulignons également les variables clés à considérer ainsi que les avantages et les limites de la surveillance de la production de ROS dans le compartiment mitochondrial des sous-populations vivantes de tige sémino-tige et de leucémie et progénitrice utilisant des colorants fluorogènes par cytométrie de flux . En outre, nous présentons des données que l'abondance mitochondriale de ROS varie parmi les sous-populations saines distinctes de HSPC et les progéniteurs de leucémie et discutons des applications possibles de cette technique dans la recherche hématique.

Présenté est une méthode pour analyser ROS dans les mitochondries de multiples populations saines et MLL-AF9-exprimant l'ancêtre de leucémie. La figure 1 affiche une vue schématique du flux de travail du protocole, qui se compose de 4 étapes principales : 1) l'isolement de BM des souris ; 2) Tacher les cellules BM avec un colorant fluorogénique qui reconnaît le ROS mitochondrial, en particulier les superoxydes; 3) coloration d'anticorps de marqueur de surface pour délimiter diverses populati...

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Les espèces réactives d’oxygène ou ROS, sont des espèces d’oxygène hautement réactives qui sont produites par les cellules, et influencent leur comportement. Bien que l’excès ros peut également causer des ravages cellulaires répandus, et dans les cas graves, la mort cellulaire. Ainsi, le maintien de l’homéostasie ROS est d’une importance fondamentale pour la fonction cellulaire et la survie.Le protocole présenté ici, se concentre sur la mesure d’un type spécifique de ROS, qui est généré par les mitochondries, principalement comme un sous-produit métabolique dans les populations vivantes, normales ou saines de tige hématopoïétique et de cellules progénitrices, ainsi que dans les cellules leucémiques du modèle de souris du cancer du sang, la leucémie myéloïde aiguë ou la LAM. Ce protocole peut également être utilisé pour évaluer comment la manipulation génétique, comme la suppression ou la surexpression des gènes, affecte le ROS mitochondrial dans plusieurs populations hématopoïétiques saines et malignes. Et en conséquence, potentiellement fournir des informations perspicaces sur l’état redux et peut-être le métabolisme des cellules.Cette technique autorise l’analyse métrique de régler le flux d’une sonde protogénique pour surveiller la production mitochondriale de ROS dans les sous-populations vivantes saines et malignes de tige hématopoïétique et d’ancêtre. Ce protocole est simple et peut être complété en quelques heures. En outre, il convient à l’analyse des cellules vivantes et permet de distinguer et d’analyser ros mitochondrial dans la population de cellules souches dans la moelle osseuse, en utilisant la marque de surface de la coloration.Après avoir recueilli des cellules de moelle osseuse mononucléaire à partir de souris sauvages serrées et de souris leucémiques MLL-AF9, selon le manuscrit, aliquot 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun des neuf tubes de contrôle de couleur unique. Aliquot les cellules restantes dans d’autres tubes expérimentaux, 200 microlitres chacun. Ensuite, placez dans une centrifugeuse deux tubes expérimentaux contenant respectivement des cellules de moelle osseuse et des cellules leucémiques, et un tube de contrôle.Centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, décanter le surnatant, et re-suspendre les cellules à température ambiante F-PBS avec une tache de cellule vivante / morte, selon les instructions du fabricant. Incuber sur la glace pendant 30 minutes.Ensuite, ajoutez 1 millilitre de température ambiante F-PBS aux trois tubes tachés vivants/morts, et un seul tube de contrôle de couleur pour la coloration mitochondrique de teinture ROS. Placer les tubes dans la centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, obtenez une solution de stock de teinture ROS mitochondriale de 5 millimolaires en suspendant 50 microgrammes de colorant ROS mitochondrial dans 13 microlitres de DMSO.Ajouter ensuite 13 millilitres de F-PBS à température ambiante au colorant ROS mitochondrial de 13 microlitres pour les diluer jusqu’à une concentration finale de cinq micromolaires. Si nécessaire, ajouter 13 microlitres de Verapamil de 50 millimules à la solution pour inhiber les pompes à efflux mitochondriales. Obtenez les tubes de la centrifugeuse et aspirez le lavage de la tache de cellule vivante/morte.Ajouter 200 microlitres de F-PBS dans le contrôle des taches vivantes/mortes et les garder dans la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à commencer l’analyse. Ajouter 200 microlitres de la tache mitochondriale de colorant ROS contenant verapamil, à chaque tube expérimental, ainsi que le tube mitochondrial de contrôle de coloration ROS. Vortex pour mélanger et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité.Ajoutez ensuite 1 millilitre de température ambiante F-PBS aux tubes de commande et expérimentaux. Centrifugeuse cinq minutes à 300 fois G à température ambiante. Aspirez le supernatent et lavez les cellules avec un millilitre supplémentaire de température ambiante F-PBS.Centrifugeuse à nouveau pendant cinq minutes à 300 fois G, à température ambiante. Tout d’abord, préparer deux cocktails d’anticorps pour les cellules saines et leucémie de moelle osseuse. Aspirez le supernatant du tube expérimental contenant des cellules saines de moelle osseuse, et ajoutez 200 microlitres du cocktail d’anticorps numéro un au tube.Vortex à mélanger. Préparez également les tubes de contrôle de couleur unique en ajoutant 200 microlitres de F-PBS et un microlitre de l’anticorps correspondant. Incuber pendant 60 minutes sur la glace dans le noir.Aspirer le supernatant du tube expérimental contenant de la moelle osseuse leucémie, et ajouter 200 microlitres du cocktail anticorps numéro deux, au tube. Vortex à mélanger. Incuber pendant 60 minutes sur la glace dans le noir.Après cela, laver tous les tubes avec 1 millilitre de F-PBS froid et centrifugeuse pendant cinq minutes à 300 fois G à température ambiante. Suspendre à nouveau les cellules dans 500 microlitres de F-PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans chaque tube de cytomètre d’écoulement à l’aide d’un filtre de 40 micromètres pour exclure les agrégats.Tout d’abord, insérez-en un sans tube de contrôle des taches dans la machine de cytométrie d’écoulement et commencez l’acquisition pour compenser la machine de cytométrie d’écoulement. Répétez l’répétition pour d’autres tubes de commande. Ensuite, lisez les tubes expérimentaux pour installer les portes.Analyser la taille et la complexité de la population cellulaire, d’abord pour un HSPC sain, définir la zone de dispersion vers l’avant et les populations de parcelles latérales de dispersion. Appuyez sur le bouton Square Gate, pour enlever les débris extérieurs de la parcelle de dispersion avant et latérale. Ensuite, sur une zone de dispersion vers l’avant et une parcelle de hauteur, utilisez un double discriminatoire pour sortir les doublets.Sélectionnez les cellules vivantes, les cellules basses de lignée, et les divers HSPC sains. Pour chaque population d’intérêt, analyser l’intensité médiane de fluorescence du canal TRPE dans une parcelle d’histagramme, afin d’évaluer les différences dans le signal ROS mitochondrial. Répétez la même procédure d’analyse de taille, de gating et d’histogramme pour les populations de leucémie.Des cellules de moelle isolées des souris saines ont été souillées avec un colorant vivant/mort et un colorant mitochondrial de ROS, et plus tard tachées avec des anticorps reconnaissant des marqueurs de lignée : plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 et CD150. En outre, les cellules de moelle osseuse des souris de leucémie ont également été souillées avec CD45.2 pour discriminer entre les cellules leucémiques de MLL-AF9 des cellules saines de moelle osseuse de destinataire souillées avec CD45.1. Une comparaison de la coloration mitochondrique de ROS, entre le LSK négatif sain de CD48, et les progéniteurs myéloïdes, montre que les progéniteurs myéloïdes affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondrique de ROS.En outre, les progéniteurs élevés de leucémie de c-Kit affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondrique de ROS, comparés aux cellules basses leucémiques intermédiaires de c-Kit, au LSK négatif sain de CD48 et aux progéniteurs myéloïdes. Les cellules à faible leucémie intermédiaires C-Kit ont également affiché une valeur significativement plus élevée par rapport aux cellules LSK négatives CD48, mais pas aux progéniteurs myéloïdes. Les colorants ROS mitochondriaux sont très réactifs et des étapes de lavage appropriées sont nécessaires pour s’assurer que tout excès de colorant a été enlevé avant de commencer les étapes suivantes.Il existe plusieurs colorants fluorogènes ROS chimiquement distincts qui peuvent être utilisés dans ce protocole, pour atteindre un peu de connaissance du statut redux dans les cellules hématopoïétiques vivantes. Cette technique a été largement utilisée dans la littérature, et peut fournir des aperçus utiles sur les voies métaboliques et de signalisation qui sont différemment régulées dans les cellules leucémiques, si on les compare à leurs homologues normaux.

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Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

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Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

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Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

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Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

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Analyse cytométrique de flux des espèces réactives doxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9 (Vidéo) | JoVE Journal

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