Caractérisation des protéines par chromatographie d'exclusion couplée à multi-angle Light Scattering (SEC-MALS)

SEC-MALS est une méthode quantitative pour déterminer le poids moléculaire, la taille et la conformation des macromolécules en solution. Il peut identifier les oligomers et les complexes, et caractériser des échantillons difficiles, comme les glycoprotéines et les protéines membranaires. SEC-MALS est une méthode absolue.

Il s’appuie sur la physique fondamentale, et ne dépend pas de la collaboration contre les normes moléculaires, la conformation de la molécule, ou la façon dont nous interagissons avec le milieu de séparation. SEC-MALS peut être appliqué à de nombreux systèmes qui sont séparés par sec. Des peptides et des petits polymères aux protéines, nucléocapsidés, polysaccharides, polymères synthétiques, particules virales et petits virus.

Il est important de vérifier que votre système et vos tampons ne sont pas à la hauteur des recommandations du fournisseur concernant la faible teneur en particules. Consultez le représentant du support technique du fournisseur pour en être sûr. Commencez cette procédure par la préparation du système SEC-MALS tel que décrit dans le protocole texte.

À l’aide de chaque reagent de qualité PLC, préparer un litre de solution saline tamponnée de phosphate avec du chlorure de sodium de 50 à 100 millimlaires. Filtrer le tampon à 0,1 micron à l’aide d’un filtre en mousse de polyéther en bouteille, ou similaire. Filtrer les 50 à 100 premiers millilitres de tampon dans une bouteille de déchets afin d’éliminer les particules des filtres secs.

Filtrez ensuite le reste jusqu’à une bouteille propre et stérile qui a déjà été lavée avec de l’eau filtrée et déionisée et conservée pour empêcher la poussière d’entrer. Rincer la colonne pendant la nuit à un débit de 0,5 millilitres par minute pour équilibrer la colonne dans le tampon et supprimer les particules. Utilisez le mode de flux continu du FPLC et assurez-vous que le flux ne s’arrête pas tant que toutes les séries SEC-MALS ne sont pas terminées.

Placez la cellule d’écoulement DRI en mode purge pendant la chasse d’eau pendant la nuit. Au début de la chasse d’eau, rampez graduellement le débit pour empêcher l’effet d’excrétion de la colonne, causé par un changement soudain de pression dans la colonne. Éteignez la purge avant de commencer les séries d’échantillons.

Vérifiez la propreté du système en tapant légèrement le tube en aval de la colonne pour libérer les particules accumulées. Observez le signal dans le détecteur à 90 degrés sur l’écran avant de l’instrument MALS. Vérifiez que le bruit de pointe à pointe n’est pas supérieur à 50-100 microvolts.

Vérifiez également que l’indice réfractif, ou signal RI, est stable à moins de 1 fois dix pour les unités d’index moins sept réfractives. Effectuez une injection vierge pour vérifier que l’injecteur est propre des particules. Un blanc est simplement le tampon en cours d’exécution préparé dans un flacon frais et stérile.

Si le pic de particules n’est pas plus d’un millilitre de volume, et pas plus de cinq millivolts au-dessus de la ligne de base, alors le système est prêt pour les échantillons. Sinon, effectuez des injections vierges supplémentaires jusqu’à ce qu’elles soient propres ou effectuez l’entretien pour nettoyer l’injecteur. Maintenant, préparez au moins 200 microlitres de BSA à un à deux milligrammes par millilitre dans le tampon CSC.

Filtrer la protéine à 02 microns à l’aide d’un filtre à pointe de seringue. Jeter les premières gouttes de filtrate, afin d’éliminer les particules des filtres secs. Sinon, centrifugez l’échantillon à 10 000 fois G pendant quinze minutes pour permettre la précipitation d’agrégats non solubles et d’autres grosses particules.

Ensuite, injectez 100 microlitres de la solution BSA dans la boucle. Ouvrez une nouvelle expérience à partir de la méthode dans le menu logiciel MALS. Ensuite, sélectionnez la méthode en ligne à partir du dossier méthodes système de diffusion de lumière.

Si un détecteur DLS est présent, sélectionnez la méthode en ligne à partir de la diffusion de la lumière avec le dossier QELS. Définissez les paramètres de l’échantillon et de la phase mobile dans la section configuration. Dans la vue de pompe générique, réglez le débit à celui utilisé dans le FPLC.

Ensuite, accédez à la vue de la pompe générique, à la branche solvant, au champ de noms et sélectionnez PBS. Dans la vue injecteur, branche d’échantillon, entrez le nom sous le nom de BSA. Réglez dn/dc à 0,185, réglez A2 à 0 et réglez le coefficient d’extinction uv à 0,667 millilitres par milligramme centimètre.

Dans la section procédures, vue de collecte de base, sélectionnez la gâchette de la case à cocher sur l’auto-injection. Réglez la durée de l’exécuter à 70 minutes, de sorte que les données sont collectées pour l’ensemble de l’allusion, jusqu’à ce que le volume total de perméation de la colonne SEC soit atteint. Démarrez l’expérience dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton exécuter.

Il commencera à lire les données après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS. Zéro le signal DRI en cliquant sur le bouton auto-zéro sur le panneau avant de l’instrument. Travailler dans le logiciel FPLC, naviguer dans le manuel, exécuter des instructions manuelles, définir la marque, et insérer le nom de la protéine et la course.

Passez de la charge manuelle à la valve d’injection pour injecter, sous la trajectoire d’écoulement, la valve d’injection. Inclure un signal d’impulsion en insérant une impulsion de 0,5 seconde sous l’impulsion de la boîte IO numérique. Cela déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS.

Maintenant, injectez l’échantillon dans la boucle. Cliquez sur exécuter dans le logiciel FPLC pour démarrer l’exécution de l’expérience. Effectuez l’analyse étape par étape, sous la section procédures du logiciel MALS.

Vérifiez que les pics apparaissent à peu près au même volume d’allusion aux UV, mals et RI en vérifiant la vue de collecte de base. Dans la vue de base, définissez la ligne de base pour tous les signaux. Dans la vue pics, définissez les pics à analyser en cliquant et en faisant glisser la souris.

Sélectionnez les 50% centraux de chaque pic. Sélectionnez d’abord le pic monomère, puis le pic de dimère. Sous chaque pic, vérifiez les valeurs correctes du dn/dc et du coefficient d’extinction à 280 nanomètres pour bsa.

Dans les procédures, afficher l’alignement, sélectionnez la région centrale des pics en cliquant et en faisant glisser la souris. Cliquez sur aligner les signaux, puis d’accord. Dans les procédures, la bande élargissant la vue, choisissez le central 50% du pic monomère.

Assurez-vous que le détecteur d’index réfractif est spécifié comme instrument de référence. Cliquez ensuite sur effectuer l’ajustement, et appliquer pour faire correspondre les signaux uv et de diffusion de la lumière au signal d’index réfractif. Zoomez sur les pics pour vérifier qu’ils se chevauchent très étroitement dans le central 50 à 70%, puis cliquez bien.

Dans les procédures, vue de normalisation, sélectionnez le pic un. Entrez 3,0 nanomètres que la valeur RG, cliquez sur normaliser, puis cliquez bien. Voir le graphique des résultats dans la vue graphique EASI.

Sélectionnez la masse molaire de l’affichage tomber vers le bas en haut de la fenêtre. Utilisez le contrôle, cliquez et faites glisser pour zoomer dans la région de pointe. Pour afficher les résultats de masse molaire moyenne de poids tabulé final pour les pics de monomère et de dimère, naviguez vers les résultats de pointe, les moments de masse molaire, MW, et sélectionnez pour les résultats, résumé du rapport.

La pureté est rapportée sous des résultats de pointe, fraction de masse. À partir du menu du fichier, sélectionnez enregistrer comme méthode et enregistrez les données BSA analysées comme méthode standard pour les mesures futures de tous les types de protéines. Les paramètres de normalisation et d’élargissement de la bande déterminés pour bsa seront reportés dans l’analyse.

Voici les analyses SEC-MALS de BSA, à l’aide d’une colonne d’exclusion de la taille des pores Angstrom de 200 angstrom. Les traces de chromatogramme sont normalisées jusqu’au pic monomère et compensées pour plus de clarté. Les artefacts communs qui peuvent être ignorés sont soulignés, y compris un pic de particules près du début du signal de diffusion de la lumière, ainsi que le sel et les pics d’air dissous près du volume total de perméation dans le signal de l’indice réfractif.

Le chromatogramme présente une excellente séparation monomère-dimer-trimer, et le signal de diffusion de la lumière montre un signal élevé au bruit. Les valeurs moyennes de masse molaire de poids monomère et de dimère présentent une homogénéité élevée. Voici des exemples d’analyses SEC-MALS de mauvaise qualité.

Dans cet exemple, une séparation inadéquate sur une colonne d’exclusion de taille de pore de 75 Angstrom entraîne un pic de particules entre huit et neuf minutes, qui n’est pas bien séparé des protéines. Ici, il y a un rapport signal/bruit insuffisant, et de vastes particules adjacentes aux protéines sont apparentes dans le signal de diffusion de la lumière. Les clés des bons résultats sec-MALS sont la sélection d’une colonne appropriée, s’assurant que le système est calibré avec un faible bruit de diffusion de lumière, et pré-filtrant ou centrifugant les échantillons pour enlever les particules.

Après SEC-MALS, des échantillons de protéines peuvent être analysés plus en détail pour l’affinité contraignante, le bioliza, la résonance plasmon de surface, la calorimétrie isothermale de titration, la phorométrie bioleridique, la thermophoresis microscale, ou le gradient de composition, la diffusion de lumière multi-angle. La structure protéique peut être déterminée par cristallographie aux rayons X, erreur cryo-électron ou NMR.