Name: Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez la modification génétique des cellules CAR-T par CRISPR/Cas9 pour améliorer l'efficacité et réduire la toxicité des thérapies anticancéreuses. Cette méthode optimise la production cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de K12CA090628 (SSK), du National Comprehensive Cancer Network (SSK), du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), de la Predolin Foundation (SSK), du Mayo Clinic Office of Translation to Practice (SSK) et le Mayo Clinic Medical Scientist Training Program Robert L. Howell Physician-Scientist Scholarship (RMS).

Ce protocole suit les lignes directrices du Conseil d'examen institutionnel (CISR) de la clinique Mayo et du Comité de biosécurité institutionnelle (BAC).
1. Production de cellules CART19
<ol><li>Isolement cellulaire, stimulation et culture ex-vivo<ol>
<li>Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une hotte de culture cellulaire en utilisant l'équipement de protection individuelle approprié. Récoltez les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) des cônes normaux de sang de donneur de de--identifié recueillis pendant l'apheresis car ceux-ci sont connus pour être une source viable de PBMCs.13
</li>
		<li>Pour isoler les PBMC, ajouter 15 ml d'un milieu de gradient de densité à un tube de séparation de gradient de densité de 50 ml. Diluer le sang du donneur avec un volume égal de saline tamponnée par phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum bovin fœtal (SGF) pour éviter le piégeage cellulaire.<ol>
<li>Ajouter le sang dilué du donneur du cône dans le tube de séparation, en prenant soin de ne pas perturber l'interface entre le sang et le milieu de gradient de densité. Centrifugeuse à 1200 x g pendant 10 min à RT.</li>
			<li>Décant le supernatant dans un nouveau 50 ml conique, laver avec PBS 2% FBS en apportant jusqu'à 40 ml, centrifugeuse à 300 x g pendant 8 min à RT, aspirer supernatant, resuspendre dans 40 ml de tampon, et les cellules de comptage.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isoler les lymphocytes T des PBMC via un kit de perles magnétiques de sélection négative à l'aide d'un séparateur cellulaire entièrement automatisé selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Pour la culture des lymphocytes T isolés, préparer le milieu cellulaire T (TCM) qui se compose de 10% de sérum HUMAIN AB (v/v), 1% pénicilline-streptomycine-glutamine (v/v), et milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum. Stérilisez le milieu en filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 m, puis avec un filtre à vide stérile de 0,22 m.</li>
		<li>Le jour 0 (le jour de la stimulation des lymphocytes T), lavez les perles CD3/CD28 avant la stimulation des lymphocytes T. Pour laver, placez le volume requis de perles (utiliser suffisamment de perles CD3/CD28 pour un rapport de 3:1 perles:T cellules; notez la concentration de perles peut être variable) dans un tube stérile de 1,5 mL microcentrifuge et resuspend dans 1 ml de TCM.</li>
		<li>Placer en contact avec un aimant.</li>
		<li>Après 1 min, aspirer le MTC et resuspendre dans 1 ml de TCM frais pour laver les perles.</li>
		<li>Répétez cette procédure pour un total de trois lavages.</li>
		<li>Après le troisième lavage, resuspendre les perles dans 1 ml de ML de MTC.</li>
		<li>Comptez les lymphocytes T.</li>
		<li>Transférer les perles aux lymphocytes T à un rapport de 3:1 perles:cellules.</li>
		<li>Diluer les cellules jusqu'à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.</li>
		<li>Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfection et transduction des lymphocytes T<ol>
<li>Effectuez des travaux lentiviraux en utilisant les précautions BSL-2MD, y compris les hottes de culture cellulaire, l'équipement de protection individuelle et la désinfection des matériaux usagés avec de l'eau de Javel avant l'élimination.</li>
		<li>Acquérir une construction CART19 dans un vecteur lentiviral. REMARQUE : La construction CART19 utilisée ici a été conçue puis synthétisée de novo à l'aide d'un fournisseur de synthèse de protéines disponible dans le commerce. La construction de la RCA a ensuite été clonée en lentivirus de troisième génération sous le contrôle d'un promoteur EF-1. Le fragment de région variable à chaîne unique est dérivé du clone FMC63 et reconnaît le CD19 humain. La construction CAR19 possède un domaine costimulatoire 4-1BB de deuxième génération et une stimulation CD3MD (FMC63-41BBz). 12 Ans, états-unis
</li>
		<li>Effectuer la production de lentivircomme tel que décrit précédemment. 12 Ans, états-unis<ol>
<li>En bref, pour produire le lentivirus, utilisez des cellules 293T qui ont atteint 70-90% de confluence.</li>
			<li>Autoriser l'incubation de 30 min à température ambiante des réactifs de transfection, y compris 15 g du plasmide lentiviral d'intérêt, 18 g d'un vecteur d'emballage gag/pol/tat/rev, 7 g d'un vecteur d'enveloppe VSV-G, 111 oL du réactif précomplexe, 129 oL de l'emballage réactif de transfection, et 9,0 ml du milieu de transfection avant d'ajouter aux cellules 293T. Puis la culture des cellules transfectées à 37 oC, 5% CO2.</li>
			<li>Récolte, centrifugeuse (900 x g pour 10 min), filtre (filtre en nylon de 0,45 M) et supernatant concentré à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pour 18 h ou 112 700 x g pour 2 h.</li>
			<li>Congeler à -80 oC pour une utilisation future.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Le jour 1, resuspendre doucement les lymphocytes T pour briser les rosettes des lymphocytes T qui avaient été stimulées à 1 x 106/mL le jour 0.</li>
		<li>En vertu des précautions appropriées de BSL-2MD pour tous les travaux lentiviraux, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux lymphocytes T stimulés à une multiplicité d'infection (MOI) de 3,0.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansion des cellules CAR-T<ol>
<li>Pendant la phase d'expansion, continuer à incuber les lymphocytes T transductés à 37 oC, 5 % CO2. Comptez les cellules CAR-T les jours 3 et 5, et ajoutez du MTC frais et préréchauffé à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T de 1 x 106/mL.</li>
		<li>Enlever les perles des lymphocytes T transductés 6 jours après la stimulation (Jour 6) à l'aide d'un aimant. Récoltez, suspendez et placez les lymphocytes T dans des tubes coniques de 50 ml dans un aimant pendant 1 min. Puis recueillir le supernatant (contient les cellules CAR-T), et jeter les perles.</li>
		<li>Placez les cellules CAR-T collectées en culture à une concentration de 1 x 106 cellules/mL pour reprendre l'expansion.</li>
		<li>Le jour 6, évaluer l'expression de surface de la RCA par cytométrie d'écoulement. REMARQUE : Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour détecter l'expression de surface de la RCA, comme la coloration d'un anticorps secondaire à adsorbe croisé s'il y a de la chèvre igG (H-L) ou en tachant avec un peptide spécifique CD19, conjugué à un fluorochrome. Ici, prenez un aliquot (environ 100 000 lymphocytes T) de la culture et lavez-le avec un tampon d'écoulement préparé avec la saline tamponnée de phosphate de Dulbecco, 2 % de sérum bovin fœtal et 1 % d'azide de sodium. Tainer les cellules avec l'anticorps anti-CAR et laver deux fois. Tainer les cellules avec une tache vivante/morte et un anticorps monoclonal CD3 (OKT3). Laver les cellules et resuspendre dans le tampon d'écoulement. Acquérir sur un cytomètre pour déterminer l'efficacité de la transduction.</li>
	</ol></li>
	<li>Cryoconservation des cellules CAR-T<ol>
<li>Pour récolter et cryoconserver les cellules CAR-T 8 jours après la stimulation (Jour 8 de l'expansion des lymphocytes T), récoltez les cellules de la culture.</li>
		<li>Faites tourner vers le bas pendant 5 min à 300 x g.</li>
		<li>Resuspendre dans le milieu de congélation à 10 millions de cellules par ml par flacon dans le milieu de congélation composé de 10% de sulfoxure de diméthyle et 90% de sérum bovin fœtal.</li>
		<li>Congeler dans un récipient de congélation pour obtenir un taux de refroidissement de -1 oC/min dans un congélateur de -80 oC, puis transférer à l'azote liquide après 48 h.</li>
		<li>Avant leur utilisation pour des expériences in vitro ou in vivo, décongeler les cellules CAR-T dans la MTC chaude.</li>
		<li>Laver les cellules pour diluer et enlever le sulfoxide de diméthyle et resuspendre à une concentration de 2 x 106 cellules/mL en TCM chaud. Reposez-vous toute la nuit à 37 oC, 5 % CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Production GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Pour perturber GM-CSF, utilisez un ARN guide (gRNA) ciblant l'exon 3 de l'homme GM-CSF (CSF2) sélectionné par l'intermédiaire de gARN de dépistage précédemment signalés pour avoir une efficacité élevée pour le gène CSF2 qui code pour la cytokine humaine GM-CSF. 14 (en) REMARQUE : Une construction lentivirale de troisième génération de troisième génération de troisième génération de troisième génération de catégorie de recherche commercialement synthétisée contenant ce gRNA (sous un promoteur de U6) a été employée. La construction contient un gène de résistance à la puromycine. La séquence de l'ARNc est GACCTGCCTACAGACCCCCCGCC. 12 Ans, états-unis
</li>
	<li>Pour produire le lentivirus, utilisez des cellules 293T qui ont atteint 70-90% de confluence.</li>
	<li>Autoriser 15 g du plasmide lentiviral d'intérêt, 18 g d'un vecteur d'emballage gag/pol/tat/rev, 7 g d'un vecteur d'enveloppe VSV-G, 111 l du réactif précomplexe, 129 oL du réactif de transfection et 9,0 mL du milieu de transfection pour incuber pendant 30 min à la pièce te mperature.</li>
	<li>Ajouter des réactifs de transfection aux cellules 293T. Puis la culture à 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Récolte, centrifugeuse (900 x g pour 10 min), filtre (filtre en nylon de 0,45 m) et supernatant concentré à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 13 028 x g pour 18 h ou 112 700 x g pour 2 h et congeler à -80 oC pour une utilisation future.</li>
	<li>Le jour 1, resuspendre doucement les lymphocytes T pour briser les rosettes.</li>
	<li>Dans un laboratoire approuvé par le BSL-2MD, ajouter le virus congelé ou fraîchement récolté aux lymphocytes T stimulés pour générer des cellules CAR-T. Transduce les lymphocytes T avec le lentivirus CAR19 et GM-CSF ciblant le lentivirus CRISPR. Ajouter le lentivirus CAR19 à un MOI de 3. Puisque la titration du lentivirus de CRISPR n'était pas faisable, utilisez des particules de virus générées à partir d'une préparation plasmide de 15 ug pour transduire 10 x 106 lymphocytes T.</li>
	<li>Voir les étapes restantes de la stimulation, de l'expansion et de la cryoconservation des lymphocytes T, telles qu'il est discuté à l'étape 1.
</li>
	<li>Pour les lymphocytes T édités par lentiCRISPR porteurs de résistance à la puromycine, traiter les cellules avec du dihydrochlorure de puromycine à une concentration de 1 g de puromycine par 1 ml le jour 3 et le jour 5.</li>
</ol>3. Efficacité des perturbations GM-CSF et évaluation fonctionnelle de GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Efficacité des perturbations GM-CSF : suivi des indels par décomposition (TIDE) séquençage et analyse<ol>
<li>Pour séquencer l'exon de l'intérêt pour le gène GM-CSF, utilisez les amorces suivantes. Utilisez une séquence d'apprêt vers l'avant pour GM-CSF (CSF2) de TGACTACAGAGAGGCACAGA, et une séquence d'amorce inversée de TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Extraire l'ADN de jusqu'à 5 millions de cellules CAR-T avec un kit d'extraction génomique. Pour la réaction pcR, utilisez 25 L d'un mastermix Taq par réaction avec une concentration finale de chaque amorce dans la réaction PCR de M, 0,1-0,5 g d'ADN de modèle, et un volume total de la réaction PCR porté à 50 'L avec de l'eau sans nucléane.</li>
		<li>Voir les conditions de cyclisme PCR décrites dans le tableau 1.</li>
		<li>Exécuter des échantillons de PCR sur un gel d'agarose de 1-2% à 100 V pendant 30 min et extraire à l'aide d'un kit d'extraction de gel.</li>
		<li>Séquence AMPlicons PCR. Calculez la fréquence de modification de l'allele en téléchargeant des données brutes dans un logiciel TIDE approprié. 15 Annonces
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Production GM-CSF et évaluation fonctionnelle de GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>Pour déterminer la production de cytokine des cellules CAR-T, incuber les cellules cart19 de type sauvage et GM-CSFk/o CART19 avec le CD19 exprimant la lignée de cellules lymphoblastiques aigues DE la leucémie NALM6 à un rapport de 1:5 pour 4 h à 37 oC, 5% CO2 en présence de monensine c'est-à-contre, c'est anti-humain CD49d, CD28 anti-humain et CD107a anti-humain.</li>
		<li>Récolte des cellules de la culture pour la cytométrie de flux. Laver les cellules avec un tampon de cytométrie d'écoulement. Tainer les cellules avec un kit de coloration vivant/mort. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min. Fixer les cellules avec un milieu de fixation et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Après le lavage, tacher les cellules intracellulairement avec le milieu de perméabilisation en combinaison avec l'anticorps monoclonal anti-humain IFNMD, l'anti-humain GM-CSF, le MIP-1, l'IL-2 anti-humain et le CD3 antihumain et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min. Laver et resuspendre les échantillons. Acquérir des échantillons sur un cytomètre de débit et analysé pour le pourcentage d'expression intracellulaire GM-CSF.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK est un inventeur de brevets dans le domaine de la thérapie à cellule T CAR qui sont sous licence à Novartis (en vertu d'un accord entre Mayo Clinic, Université de Pennsylvanie, et Novartis). Ces études ont été financées en partie par une subvention de Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS et SSK sont des inventeurs de brevets liés à ce travail. Le laboratoire (SSK) reçoit des fonds de Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys et Actinium.

Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour employer la technologie DE CRISPR/Cas9 pour induire des modifications secondaires dans les cellules de CAR-T. Plus précisément, cela est démontré à l'aide de la transduction lentivirale avec un vecteur viral qui contient du gRNA ciblant le gène d'intérêt et Cas9 pour générer des cellules GM-CSFk/o CART19. Nous avions précédemment montré que la neutralisation de GM-CSF améliore CRS et NT dans un modèle de xénogreffe. 12 Comme nous l'a...

La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est très prometteuse dans le traitement du cancer. 1 Fois , 2 Deux thérapies cellulaires CAR-T ciblant le CD19 (CART19) ont récemment été approuvées aux États-Unis et en Europe pour l'utilisation dans les malignités des cellules B après avoir démontré des résultats frappants dans des essais cliniques multicentriques. 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Les obstacles à une utilisation plus répandue des cellules CAR-T sont une activité limitée dans les tumeurs solides et les toxicités associées, y compris le syndrome de libération de cytokine (SRC) et la neurotoxicité (NT). 3 (en) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 Pour améliorer l'indice thérapeutique de la thérapie cellulaire CAR-T, des outils d'ingénierie génomique tels que les nucléases de doigts de zinc, taleNs et CRISPR sont utilisés pour modifier davantage les cellules CAR-T dans le but de générer des cellules CAR-T moins toxiques ou plus efficaces. 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis (
Dans cet article, nous décrivons une méthode pour générer des cellules CAR-T éditées CRISPR/Cas9. L'objectif spécifique de cette méthode est de modifier génétiquement les cellules CAR-T pendant la fabrication des cellules CAR-T via CRISPR/Cas9 pour générer des cellules CAR-T moins toxiques ou plus efficaces. La raison d'être de l'élaboration de cette méthodologie repose sur les leçons tirées de l'expérience clinique de la thérapie cellulaire CAR-T, ce qui indique un besoin urgent de nouvelles stratégies pour augmenter la fenêtre thérapeutique de la thérapie cellulaire CAR-T et étendre l'application à d'autres tumeurs et est soutenue par les progrès récents dans la biologie synthétique permettant des modifications multiples des cellules de CAR-T qui ont commencé à entrer dans la clinique. Alors que plusieurs outils d'ingénierie génomique sont en cours de développement et d'application dans différents contextes, tels que les nucléases de doigts de zinc, taleNs, et CRISPR, notre méthodologie décrit la modification CRISPR/Cas9 des cellules CAR-T. 10 Ans et plus , 11 CRISPR/Cas9 est un mécanisme de défense bactérienne à base d'ARN qui est conçu pour éliminer l'ADN étranger. CRISPR s'appuie sur les endonucalases pour censer une séquence cible identifiée à l'aide d'un ARN guide (gRNA). L'édition CRISPR des cellules CAR-T offre plusieurs avantages par rapport à d'autres outils d'ingénierie génomique. Il s'agit notamment de la précision de la séquence gRNA, la simplicité de concevoir un gRNA ciblant le gène d'intérêt, l'efficacité élevée d'édition de gènes, et la capacité de cibler plusieurs gènes puisque plusieurs gARN peuvent être utilisés en même temps.
Plus précisément dans les méthodes décrites ici, nous avons utilisé un lentivirus codant L'ARN guide CRISPR et Cas9 pour perturber un gène pendant la transduction cararie des lymphocytes T. En sélectionnant une technique appropriée pour modifier les cellules CAR-T, nous suggérons que la technique décrite ici est un mécanisme efficace pour générer des cellules CAR-T de qualité de recherche, mais parce que l'effet à long terme de l'intégration permanente de Cas9 dans le génome est inconnu, nous proposer cette méthodologie pour développer des cellules CAR-T de qualité de recherche de preuve de concept mais pas pour produire de bonnes pratiques de fabrication catégorie cellules CAR-T.
En particulier, ici nous décrivons la génération du facteur stimulant de colonie de macrophage de granulocyte (GM-CSF) knock-out des cellules de CAR-T de BUT-T ciblant CD19 humain. Ces cellules CAR-T ont été générées par transduction avec des particules lentivirales codant un ARN guide spécifique à GM-CSF (nom de gène CSF2) et Cas9. Nous avons précédemment constaté que la neutralisation de GM-CSF améliore CRS et NT dans un modèle de xénogreffe. 12 cellules GM-CSFk/o CAR-T permettent l'inhibition de GM-CSF pendant le processus de fabrication, réduisant efficacement la production de GM-CSF tout en améliorant l'activité antitumorale et la survie des cellules CAR-T in vivo par rapport aux cellules cartumanes de type sauvage. 12 Ainsi, ici nous fournissons une méthodologie pour générer des cellules CAR-T éditées CRISPR/Cas9.

<table><tbody><tr><td>Anticorps monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>cytomètre</td></tr><tr><td>en flux diméthylsulfoxyde</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (concentrateur de particules magnétiques)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’isolement de cellules T humaines&nbsp ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>sélection négative billes magnétiques ; 17951RF comprend pointes et tampon</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris Anti-Humain CD107a&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de fixation (Medium A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Construction : Nom : CSF2 CRISPR guide RNA 1 ; Espèce : Humain, Vecteur : pLentiCRISPR v2 ; Résistance : Ampicilline ; Numéro d’exemplaire : High ; Préparation du plasmide : Livraison standard : 4 &mu ; g (Gratuit de frais)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>commande personnalisée</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td>Sérum AB humain de <td>Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ; Donneurs masculins ; type AB ; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Anticorps monoclonal (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes Aqua fixable, pour excitation 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Solution Monensin, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Humain CD28 Clone CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Humain CD49d Clone 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-Humain MIP-1&beta ; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Conteneur de congélation</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, clone G5&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>lignée cellulaire de leucémie lymphoblastique aiguë</td></tr><tr><td>Eau libre Nucléase</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes de filtration sous vide Olympus, 500 mL, membrane PES, 0,22 uM, stérile</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtre stériles jetables à débit rapide Nalgene avec membrane CN 0,45 uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit Milieu (1X), Liquide</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Souris Anti-Humain IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100X), Liquide</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de perméabilisation (Medium B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Kit d’ADN génomique PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de puromycine</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Humain GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Séparateur de cellules entièrement automatisé</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium, 5 % (p/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de crispr/cas9 pour éliminer gm-csf dans les cellules car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

La thérapie cellulaire du récepteur d'antigène chimérique T (CAR-T) est une nouvelle option de traitement de pointe et potentiellement révolutionnaire pour le cancer. Cependant, il y a des limites significatives à son utilisation répandue dans le traitement du cancer. Ces limitations incluent le développement des toxicités uniques telles que le syndrome de dégagement de cytokine (CRS) et la neurotoxicité (NT) et l'expansion limitée, les fonctions d'effecteur, et l'activité antitumorale dans les tumeurs pleines. Une stratégie visant à améliorer l'efficacité du CAR-T et/ou à contrôler les toxicités des cellules CAR-T consiste à modifier le génome des cellules CAR-T elles-mêmes lors de la fabrication des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons l'utilisation de l'édition de gène CRISPR/Cas9 dans les cellules DE CAR-T par transduction avec une construction lentivirale contenant un ARN de guide au facteur de stimulation de colonie de macrophage de granulocyte (GM-CSF) et cas9. À titre d'exemple, nous décrivons CRISPR/Cas9 pare-t-il de GM-CSF. Nous avons montré que ces cellules GM-CSFk/o CAR-T produisent effectivement moins de GM-CSF tout en maintenant la fonction critique des lymphocytes T et entraînent une activité antitumorale accrue in vivo par rapport aux cellules carturiennes de type sauvage.

La figure 1 montre la réduction de GM-CSF dans les cellules GM-CSFk/o CART19. Pour vérifier que le génome des lymphocytes T a été modifié pour koiller GM-CSF, le séquençage TIDE a été utilisé dans les cellules GM-CSFk/o CART19 (figure 1A). La coloration de la surface des cellules CAR-T vérifie que les lymphocytes T expriment avec succès le récepteur de surface de la RCA in vitro en gating sur des cellules CD...

Ici, nous présentons un protocole pour modifier génétiquement les cellules CAR-T via un système CRISPR/Cas9.

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Notre protocole décrit la modification génétique des cellules CAR-T lors de leur fabrication via la technologie CRISPR pour générer des produits plus efficaces et moins toxiques. Un avantage de cette technique est que la production de cellules CAR-T et la manipulation génétique peuvent toutes deux se produire dans une cellule avec une bonne efficacité. Rosalie Sterner, doctorante en médecine, Michelle Cox, technologue et étudiante aux cycles supérieurs, et Reona Sakemura, stagiaire postdoctorat, de mon laboratoire, démontreront la procédure.Après avoir isolé les cellules T des cellules mononucléaires périphériques récoltées, commencez à les cultiver en préparant d’abord le milieu des cellules T, puis en le stérilisant en le filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 micromètre, puis à l’aide d’un filtre à vide stérile de 0,22 micromètre. Le jour de la stimulation des lymphocytes T ou du jour zéro, avant la stimulation, lavez les perles CD3/CD28 en plaçant le volume requis de perles dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et en réutilisant en un millilitre de TCM. Placez le tube en contact avec un aimant pendant une minute.Ensuite, aspirez le TCM et resuspendez dans un millilitre de TCM frais pour laver les perles à nouveau et répéter pour un total de trois lavages. Et enfin, resuspendez les perles dans un millilitre de TCM. Après avoir compté les cellules T, transférer les perles aux cellules T à un rapport de trois à une perle aux cellules.Ensuite, diluer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pendant 24 heures. Après l’acquisition d’une construction CART19 dans un vecteur lentiviral, effectuez la production de lentiviral en couveant d’abord le plasmide lentiviral, vecteur d’emballage, vecteur d’enveloppe, réagent précomplexant, réagent de transfection et milieu de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuer des travaux lentiviraux en utilisant bsl2 +précautions, y compris les hottes de culture cellulaire, l’équipement de protection individuelle, et la désinfection des matériaux utilisés avec de l’eau de Javel avant l’élimination.Après l’incubation, ajouter ces réhabilités de transfection aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius et 5%CO2. À 24 et 48 heures après la transfection, la récolte, la centrifugeuse, le filtre et le concentré contenant des virus supernatants par ultracentrifugation et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Le premier jour, résuspendez doucement les cellules T qui ont été stimulées à un million de cellules par millilitre le jour zéro afin de briser les rosettes des cellules.Selon les précautions appropriées bsl2+, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux cellules T simulées à une multiplicité d’infection de 3,0. Continuer à couver les t-cells transduced à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Les jours trois et cinq, comptez les cellules CAR-T et ajoutez du TCM frais préchauffé à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T d’un million de cellules par millilitre.Six jours après la simulation, retirer les perles des cellules T transduites en récoltant et en réutilisant les cellules. Transférer les cellules dans des tubes coniques de 50 millilitres et placer les tubes dans un aimant pendant une minute. Après avoir recueilli le supernatant contenant des cellules CAR-T et jeté les perles, remettre les cellules en culture à une concentration d’un million de cellules par millilitre dans un flacon de culture.Utilisez un échantillon de cellules pour la cytométrie du débit afin d’évaluer l’expression de surface des DRC. Incuber le reste pour reprendre l’expansion, puis récolter et cryo-préserver les cellules au huitième jour comme décrit dans le manuscrit. Pour perturber le facteur stimulant de la colonie de macrophages granulocytes, utilisez un ARN guide tel que décrit dans le manuscrit.Incuber les réhésifs transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez-les aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de la culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pour produire un lentivirus. À 24 et 48 heures, récolter et concentrer le supernatant contenant des virus par ultracentrifugation dans des tubes ultracentrifugeuses de 50 millilitres et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.Puis, le premier jour, résuspendez doucement les T-cells pour briser les rosettes. Dans un laboratoire approuvé par BSL2+, pour produire des cellules CAR-T, ajoutez le lentivirus CAR19 et le lentivirus CRISPR ciblant le GMCSF aux cellules T simulées. Le troisième jour et le cinquième jour pour les cellules T éditées avec succès par lentiCRISPR portant la résistance de puromycine, traitent des cellules avec le dihydrochlorure de puromycine à une concentration d’un microgramme de puromycine par millilitre.Le séquençage des marées a été utilisé pour confirmer une réduction de GM-CSF dans les cellules CART19 à élimination directe GM-CSF avec une efficacité de perturbation d’environ 71 % Les parcelles de surface des cellules CAR-T entachées sur des cellules CD3 positives vivantes montrent que cart19 et GM-CSF knockout CART19 de type sauvage réussissent et expriment de la même manière le récepteur de surface CAR in vitro. D’autre part, la coloration intracellulaire de GM-CSF par cytométrie d’écoulement également fermée sur les cellules CD3-positives vivantes démontre l’expression diminuée de GM-CSF dans les cellules de KNOCKOUT comparées aux cellules cart19 de type sauvage confirmant le succès fonctionnel du KO. Un soin particulier doit être pris pendant les étapes de transduction de cette procédure car elles sont les plus critiques pour le développement des cellules CAR-T génétiquement modifiées.La méthodologie décrite peut potentiellement être appliquée à une variété de gènes pour modifier les cellules CAR-T via CRISPR/CAS9 pour aider à générer un produit moins toxique et plus efficace. La technologie CRISPR/CAS9 fournit les stratégies pour cibler directement le génome des cellules CAR-T afin de concevoir des solutions aux lacunes cliniques actuelles.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

La vidéo décrit un processus de création de cellules CAR-T génétiquement modifiées par le biais du système CRISPR-Cas9. L’infection des lymphocytes T par des lentivirus CRISPR et CAR entraîne des modifications du gène cible et la synthèse d’un récepteur antigénique chimérique ou CAR, conduisant finalement à la formation de cellules CAR-T génétiquement modifiées.

Modification génétique des cellules CAR-T à l’aide d’un système CRISPR-Cas9

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la...

Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Études classiques de perte de la fonction des gènes à l’aide d’animaux knock-out ont souvent été coûteux et long. Axée sur l’électroporation de mutagenèse induite par CRISPR somatique est un outil puissant pour comprendre les fonctions de gènes in vivo. Nous rapportons ici une méthode pour analyser les phénotypes d’élimination directe dans les cellules en prolifération du cervelet.

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Nous présentons ici un protocole d’édition de gènes dans les cellules T humaines primaires utilisant la technologie CRISPR Cas pour modifier les cellules CAR-T.

Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR

De nouvelles stratégies pour modéliser fidèlement les mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) sont nécessaires pour mieux étudier la biologie des cellules souches hématopoïétiques et les hémopathies malignes. Ici, un protocole pour modéliser les mutations hétérozygotes de gain de fonction dans les HSPC en combinant l’utilisation de CRISPR / Cas9 et la double transduction du donneur rAAV est décrit.

Ingénierie des mutations hétérozygotes oncogéniques de gain de fonction dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines

Nous décrivons ici une méthode permettant de modifier sélectivement l’expression des gènes dans le plexus choroïde tout en évitant tout impact dans d’autres zones du cerveau.

Knockdown ciblé des gènes du plexus choroïde

L’article décrit un protocole pour l’application d’un modèle in vitro d’épuisement afin de réaliser un dépistage CRISPR knock-out à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur antigénique chimérique de donneur sain.

Réalisation d’un criblage CRISPR in vitro à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur d’antigène chimérique

Nous avons développé un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 pour les cellules CAR T primaires. En réduisant la transmission d’ADNgDNA par la digestion enzymatique et le pulldown des cassettes d’ARNsg, cette approche minimise les artefacts PCR, assurant une détection précise des sgRNA et une identification robuste des cibles géniques fonctionnelles.

Améliorer les écrans CRISPR-Cas9 dans les cellules CAR T : une méthode affinée pour la préparation des bibliothèques

Découvrez la modification génétique des cellules CAR-T par CRISPR/Cas9 pour améliorer l'efficacité et réduire la toxicité des thérapies anticancéreuses. Cette méthode optimise la production cellulaire.

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

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