Test standardisé et évolutif pour étudier perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Cet essai in vitro démontre la germination angiogénique dans une plate-forme à haut débit et évolutive. Cela pourrait être utilisé pour trouver de nouvelles cibles dans l’angiogenèse. Cet essai d’angiogenèse combine des micro-environnements cellulaires complexes qui incluent des gradients et de la perfusion avec une plate-forme compatible avec le criblage à haut débit.

L’angiogenèse joue un rôle important dans la santé et la maladie. Comprendre les mécanismes qui se produisent pendant l’angiogenèse pourrait nous aider à comprendre comment les cancers se développent et comment les tissus réparent. Cette méthode pourrait donner un aperçu des mécanismes pendant les maladies cardiovasculaires et la régénération des tissus.

Dans les deux cas, l’angiogenèse joue un rôle important. Pour la première fois utilisation de cette plate-forme microfluidique, vous devez être conscient de la loi des volumes et comment pipette. Vous pouvez confirmer les étapes en regardant sous un microscope ou en renversant la plaque à l’envers.

Certaines étapes sont difficiles à comprendre lorsque vous lisez la méthode, par exemple la taille des canaux microfluidiques ou la façon de tenir la plaque. Wendy Stam, technicienne de notre laboratoire, démontrera ces procédures. Pour commencer, transférez la plaque microfludique de 384 puits sur une hotte stérile à écoulement laminaire.

Retirez le couvercle et ajoutez 50 microlitres d’eau ou de saline tamponnée de phosphate à chacun des 40 puits d’observation à l’aide d’une pipette multicanal. Ajouter ensuite 1,5 microlitre de quatre milligrammes par collagène millilitre une solution à l’entrée de gel de chaque unité microfluidique. Assurez-vous que la gouttelette de gel est placée au milieu de chaque puits afin que le gel entre dans le canal.

Après avoir rempli cinq unités microfluidiques, retournez la plaque à l’envers pour inspecter visuellement le remplissage correct des canaux de gel. Placer la plaque microfludique dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 10 minutes pour polymériser le collagène. Ensuite, sortez la plaque de l’incubateur et transférez-la sur une hotte stérile à écoulement laminaire.

Ajouter 50 microlitres de 10 microgrammes par solution de codage de fibronectine milliliter au puits de sortie du canal de perfusion supérieur de chaque unité microfluidique. Appuyez sur la pointe pipette contre le côté du puits pour le remplissage correct du puits sans piéger les bulles d’air. Le canal se remplit et les casseroles liquides sur la prise sans bien remplir la prise.

Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur pendant au moins deux jours. Maintenant, décongelez rapidement les IPSC-ECs congelés pendant moins d’une minute dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et ajoutez lentement 10 millilitres de milieu basal pour diluer.

Dessiner 10 microlitres de la solution et compter les cellules sur un compteur cellulaire. Centrifuger le tube à 100 fois g pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant sans déranger la pastille cellulaire et résusquer dans le milieu basal pour donner une concentration de deux fois 10 à la septième cellule par millilitre.

Ensuite, transférez la plaque microfluidique de 384 puits de l’incubateur à une hotte stérile à écoulement laminaire. Aspirer la solution de codage de la fibronectine à partir de la sortie de perfusion et ajouter 25 microlitres de milieu basal dans les puits de sortie. Ajouter une gouttelette d’un microlitre de suspension cellulaire à chaque entrée de perfusion supérieure bien.

La gouttelette s’aplatit en quelques secondes. Vérifiez au microscope si l’ensemencement est homogène dans un seul canal et entre les canaux. Incuber la plaque de puits microfluidique pendant une à 1,5 heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après cela, vérifiez les cellules pour confirmer qu’elles ont adhéré. Retirer le milieu basal des puits de perfusion du haut. Ajouter le milieu chaud de culture de récipient dans l’entrée supérieure de perfusion et la sortie.

Placez la plaque sur une plate-forme rocker qui est réglée sur un angle de sept degrés et huit minutes d’intervalle de basculement dans l’incubateur. Au premier et au deuxième jour après l’ensemencement, imagez la plaque à l’aide d’un microscope Brightfield avec stade automatisé pour confirmer la viabilité cellulaire. Après deux jours, un monocouche confluent s’est formé contre le collagène un échafaudage.

Tout d’abord, préparer 4,5 millilitres de milieu de germination angiogénique en complétant 4,5 millilitres de milieu basal avec 4,5 microlitres de stock VEGF, 4,5 microlitres de stock PMA, et 2,25 microlitres de stock S1P. Préparer 8,5 millilitres de milieu de croissance des vaisseaux en complétant le milieu basal avec 5,1 microlitres de VEGF et 3,4 microlitres de BFGF. Aspirer le milieu des puits et ajouter 50 microlitres de milieu de culture de récipient frais dans l’entrée supérieure de perfusion et les puits de sortie et l’entrée de gel et les puits de sortie.

Ajouter ensuite 50 microlitres de mélange angiogénique de germes à chacun des canaux de perfusion du fond de l’entrée et des puits de sortie. Remettre la plaque dans l’incubateur sur la plate-forme rocker afin de former un gradient de facteurs de croissance angiogéniques. Un jour et deux jours après l’ajout des facteurs de croissance angiogéniques, utilisez un microscope Brightfield pour imager les puits sur une scène automatisée.

Pour étudier l’anastomose et la stabilisation des germes, ajouter un microlitre de 0,5 milligramme par millilitre d’albumine étiquetée fluorescente à l’entrée de perfusion supérieure. Mélangez ensuite la solution avec une pipette de 50 microlitres. Transférer la plaque au microscope fluorescent avec un stade automatisé et un incubateur réglé à 37 degrés Celsius.

Réglez le microscope à l’objectif 10X et corrigez les paramètres d’exposition. Obtenez des images timelapse chaque minute pendant 10 minutes. Retirez la plaque du microscope et transférez la plaque sur un capot stérile à écoulement laminaire.

Retirez tout milieu des puits et remplacez à la fois le milieu de culture du navire et le milieu de germination angiogénique dans les puits correspondants. Remettre la plaque microfluidique dans l’incubateur pour poursuivre la germination angiogénique. Le sixième jour, répétez l’imagerie pour étudier la perméabilité.

Pour fixer la culture cellulaire, aspirez tous les médias culturels des puits. Ajouter 25 microlitres de 4 % de PFA en PBS à tous les puits d’entrée et de sortie de perfusion. Placez ensuite un côté de la plaque microfluidique sur le couvercle à un léger angle de cinq degrés pour induire le débit.

Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, aspirer le PFA des puits. Lavez deux fois toutes les entrées et les prises de perfusion avec 50 microlitres de HBSS.

Ensuite, aspirez le HBSS des puits. Le paraformaldéhyde est un produit chimique dangereux qui doit être manipulé en portant des gants et ouvert uniquement dans une hotte fumigène. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de surfactant non ionique de 0,2 % à toutes les entrées et sorties de perfusion pour perméabiliser à température ambiante pendant 10 minutes et placez la plaque microfluidique sur le couvercle à un léger angle de cinq degrés.

Aspirez le surfactant non ionique des puits et lavez les canaux de perfusion deux fois en ajoutant 50 microlitres de HBSS à tous les puits d’entrée et de sortie de perfusion. Aspirez le HBSS des puits. Préparez Hoechst 1000 à 2000 pour colorer les noyaux et préparez la Phalloidine 100 à 200 dans HBSS pour la coloration de F-actine.

Dans un tube Falcon, mélanger six millilitres de HBSS, 30 microlitres de F-actine et trois microlitres de Hoechst. Ajouter ensuite 25 microlitres à chaque entrée de perfusion et bien la sortie. Placer la plaque sous un léger angle et incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes.

Lavez-les deux fois avec 50 microlitres de HBSS dans toutes les entrées et points de vente de perfusion. Puis image directe à l’aide d’un microscope fluorescent avec stade automatisé ou stocker la plaque protégée de la lumière à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Dans ce protocole, les micro-vaisseaux ont été continuellement perfusés et exposés à un gradient de facteurs de croissance angiogéniques.

L’ensemencement de l’IPSC-ECs à l’aide de la méthode de pompage passif a donné lieu à des densités d’ensemencement homogènes. Le timelapse d’une gouttelette qui est placée sur le dessus de l’entrée du canal microfluidique montre la gouttelette juste après addition, la gouttelette sur le dessus du tronc d’entrée après addition, jusqu’à ce que le ménisque de gouttelette ait été épinglé par l’entrée qui a eu comme conséquence un écoulement vers la sortie. L’exposition à un gradient des facteurs angiogenic a eu comme conséquence la germination angiogenic directionnelle des micro-vaisseaux dans le gel modelé de collagène un.

Formation claire de cellules de pointe et invasion dans le collagène un gel était visible 24 heures après addition du gradient angiogenic tandis que les cellules de stock comprenant la formation de lumen étaient visibles après 48 heures. Après fixation et coloration, la forme et la longueur de ces pousses ont été identifiées. Cependant, sans ajout de facteurs de croissance, aucune invasion dans le collagène d’un gel n’a été observée.

Avec la formation image confocale, le diamètre de pousse a été déterminé et la formation de lumen a été confirmée. Cette méthode pourrait être utilisée pour dépister de nouveaux inhibiteurs angiogéniques. Cela pourrait aider à trouver de nouveaux traitements contre la rétinopathie diabétique, la polyarthrite rhumatoïde et le cancer.

Nous explorons actuellement comment nous pouvons créer des co-cultures, y compris un modèle de la barrière hémoro-encéphalique et organoïdes vascularisés.