Quantification de l'activité chimiotactique monocyte in Vivo et caractérisation des macrophages dérivés du monocyte sanguin

Cette méthodologie nous permet de quantifier l’activité chimoactique du monocyte sanguin chez les animaux vivants et d’étudier l’effet d’une mauvaise alimentation sur la fonction des monocytes et leurs mécanismes sous-jacents. Les macrophages dérivés des monocytes peuvent être isolés et analysés à l’aide de diverses approches, y compris des techniques unicellulaires et omiques qui fournissent un instantané de la santé du site des monocytes sanguins dans les modèles muraux. La procédure d’aujourd’hui sera menée par le Dr Joo Ahn, professeur adjoint dans mon laboratoire, et le Dr Luxi Wang, postdoc dans mon laboratoire.

Avant de commencer la procédure, nettoyez le capot de culture cellulaire avec un désinfectant et décongelez complètement la solution dérivée de membranes du sous-sol réduite en facteur de croissance sur la glace. Équiper les seringues stériles d’un millilitre de 26 aiguilles de calibre et placer les aiguilles sur la glace. Une fois la solution décongelée, essuyer le dessus du flacon de solution dérivé de la membrane du sous-sol à l’aide d’un écouvillon d’alcool avant de charger 500 micro litres de solution complétés par ou sans attractant de chimio dans chaque seringue d’un millilitre.

Retirez ensuite les bulles d’air de la seringue chargée de solution dérivée de la membrane du sous-sol pour assurer une formation uniforme de bouchons. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, injectez lentement tout un volume de solution dérivée de la membrane du sous-sol sans MCP-1 ajouté à environ 100 micro litres par seconde sous-cutanée dans le flanc droit de la souris anesthésiée. Et l’ensemble des 500 micro litres de solution dérivée de la membrane du sous-sol complété par MCP-1 dans le flanc gauche de l’animal.

Maintenez la seringue en place 20 à 30 secondes après l’injection pour éviter les fuites de la solution et pour permettre à un seul bouchon de gel lisse de se former avant de placer la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Trois jours après l’injection, retirez les poils dorsal d’un animal à injection plug et utilisez des forceps pour saisir la peau autour de la vertèbre lombaire inférieure thoracique et supérieure. Faire une incision de deux millimètres de long dans la peau et couper le long de la ligne médiane de l’arrière de la souris à partir des vertèbres cervicales jusqu’à un centimètre au-dessus de la jonction vertébrale dorloter.

Séparez la peau de la couche musculaire et épinglez la peau sur une plate-forme en mousse de polystyrène. Ensuite, sous un microscope disséquant, saisissez soigneusement la capsule fibreuse qui contient le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol et utilisez des forceps fins pour enlever la capsule fibreuse. Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour nettoyer la fiche.

Transférez ensuite la fiche de gel dérivée de la membrane du sous-sol nettoyée dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté de façon appropriée et pesé. Reweigh le tube pour calculer le poids de la prise de gel membrane-dérivée de sous-sol. Pour la digestion des bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol, utilisez des ciseaux fins propres pour émincer le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol dans chaque tube de micro centrifugeuse et ajouter 800 micro litres de déplacement aux bouchons.

Vortex à la vitesse maximale pendant 10 secondes pour perturber les bouchons et placer les tubes de micro centrifugeuse à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un mélangeur thermo à 1400 rotations par minute pour dissoudre complètement les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol. À la fin de l’incubation, sédimenter les fragments de bouchon par centrifugation à deux reprises et réutiliser les granulés dans 300 microlitres de PBS. Transférer 50 microlitres de chaque suspension cellulaire dans de nouveaux tubes de micro centrifugeuse et étiqueter les cellules dans les nouveaux tubes avec 0,5 microlitres de calcine.

Après une incubation de 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone, comptez le nombre de fluorescents verts vivants positifs et morts cellules non fluorescentes sur un compteur de cellules automatisées. Pour une seule cellule d’analyse des taches occidentales, ajouter un millilitre de suspension cellulaire unique diluée à une puce de tache occidentale à cellule unique réhydratée au fond d’une boîte de Pétri de 10 centimètres. Après cinq à 15 minutes, examiner la puce sous microscopie brightfield.

Environ 15 à 20 % des micro puits devraient être occupés par une seule cellule et moins de deux pour cent des puits devraient contenir deux cellules ou plus. Si la puce a été correctement chargée, inclinez le plat à 45 degrés et lavez la puce trois fois avec un tampon de suspension pour enlever les cellules non capturées. Après le dernier lavage, soigneusement et charger la puce dans la cellule électrophoresis d’un instrument occidental à cellule unique, gel-côté vers le haut, et couvrir l’ensemble de la puce de tache occidentale à cellule unique avec tampon de lyse en cours d’exécution.

Initier la lyse cellulaire et exécuter l’instrument selon les paramètres d’expérience appropriés. À la fin de la course, rincer la puce à l’aide de deux lavages de 10 minutes avec tampon de lavage frais par lavage à température ambiante. Après le deuxième lavage, ajouter 80 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt à la chambre de sondage anticorps et abaisser le gel-côté de puce vers le bas de sorte que la solution d’anticorps s’évacue à travers la puce.

Après deux heures à température ambiante, laver la puce trois fois dans le tampon de lavage et une fois dans l’eau sur un shaker. Incuber la puce avec un anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez la puce trois fois avec un tampon de lavage et faites tourner la puce sur une essoreuse à glissière pour enlever tout tampon de lavage restant.

Pour dépouiller la puce de tache occidentale à cellule unique, placez un support à tube de 15 millilitres dans un bain d’eau de 60 degrés Celsius avec l’eau juste un centimètre au-dessus de la grille. Dans une hotte de fumée, ajouter 40 millilitres de tampon de décapage et 320 microlitres d’éthanol bêta-morcepta à une boîte. Placer la puce dans une boîte de Pétri de 10 centimètres à l’intérieur de la boîte et sceller la boîte avec Parafilm.

Placez ensuite la boîte à l’intérieur de la grille du tube dans le bain d’eau. Après 90 minutes, transférer délicatement la puce dans une nouvelle boîte de Pétri et laver brièvement la puce une fois avec un tampon de lavage avant d’ajouter 15 millilitres de tampon de lavage frais à la boîte de Pétri pour un lavage de 15 minutes sur le shaker. Dans cette expérience représentative, les cellules recrutées dans chaque prise ont été comptées à un, trois, et cinq jours après injection.

En soustrayant le nombre de cellules dans les fiches chargées par le véhicule du nombre de cellules dans les prises chargées MCP-1, le nombre de cellules spécifiquement recrutées en réponse à l’attracteur de chimio a ensuite été calculé. Un recrutement et une accumulation spécifiques accélérés de cellules mcp-1 ont été observés au cours de la période de cinq jours, avec des taux augmentant de 31 000 cellules par jour après un jour d’injection à jusqu’à 136 000 cellules par jour, cinq jours après l’injection. L’analyse des taches occidentales à cellules simples a ensuite été utilisée pour identifier les différents types de cellules recrutés dans les bouchons dérivés de la membrane du sous-sol, en fonction de leur expression de marqueurs cellulaires immunitaires spécifiques d’intérêt.

Par exemple, le pourcentage de monocytes dans les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol chargés mcp-1 était faible au premier jour et a atteint un sommet au troisième jour avant de retocher au cinquième jour, tandis que le nombre de macrophages a augmenté régulièrement tout au long de la période d’étude. Pour les bouchons chargés MCP-1, le pourcentage de monocytes plus de macrophages dans la population cellulaire isolée était le plus élevé au troisième jour, ce qui indique qu’après trois jours, la grande majorité des cellules recrutées par les chimiotaxis dépendants mcp-1 étaient des monocytes et des macrophages. Même si le nombre total de monocytes plus macrophages est généralement plus élevé au cinquième jour par rapport au troisième jour, le nombre de cellules au troisième jour reflète plus précisément le sang périphérique de la chimiotaxis monocyte et le recrutement, et donc le troisième jour est recommandé pour les analyses de bouchons membrane-direct sous-sol.

L’acquisition réussie de cellules individuelles pour l’analyse en aval dépend de l’exactitude de l’injection et de l’enlèvement complet des bouchons. La cytométrie d’écoulement, le ballonnement occidental unicellulaire, le séquençage de l’ARN en vrac ou à cellules simples et d’autres procédures omiques peuvent être utilisés pour évaluer les caractéristiques et les phénotypes des macrophages recrutés par monocyte et dérivés des monocytes.