Name: In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez une approche de génétique directe pour identifier des gènes neuroprotecteurs chez Drosophila melanogaster. Ce protocole combine tests d'escalade, histologie et séquençage ADN pour étudier les mécanismes de neurodégénérescence.

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Nous sommes particulièrement reconnaissants au Dr Barry Ganetzky, dans qui est le laboratoire de l'écran génétique a été effectué, permettant l'identification et la caractérisation de l'enfant comme un gène neuroprotecteur. Nous remercions le Dr Steven Robinow d'avoir gentiment fourni la collection de mouches mutagénaires ENU utilisées dans l'écran génétique présenté dans cet article. Nous remercions les membres du laboratoire Ganetzky, les Drs Grace Boekhoff-Falk et David Wassarman pour les discussions utiles pendant toute la durée de ce projet, Ling Ling Ho et Bob Kreber pour l'assistance technique, le Dr Aki Ikeda pour l'utilisation de son installation de microtome à la L'Université du Wisconsin et le Dr Kim Lackey et le Centre d'analyse optique de l'Université de l'Alabama.

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Les écrans génétiques avancés dans Drosophila ont été une approche efficace pour identifier les gènes impliqués dans différents processus biologiques, y compris la neuroprotection dépendante de l'âge5,23,24, 25. En utilisant cette stratégie, nous avons réussi à identifier brat comme un nouveau gène neuroprotecteur17.
Une étap...

Les neurones sont pour la plupart post-mitotiques et incapables de diviser1,2. Chez la plupart des animaux, des mécanismes neuroprotecteurs existent pour maintenir ces cellules tout au long de la vie de l'organisme, en particulier à la vieillesse lorsque les neurones sont les plus vulnérables aux dommages. Les gènes sous-jacents à ces mécanismes peuvent être identifiés chez les mutants présentant une neurodégénérescence, un indicateur phénotypique de la perte de neuroprotection, à l'aide d'un protocole génétique avancé. Les écrans génétiques avancés utilisant des mutagènes chimiques tels que le méthane sulfonate éthylique (EMS) ou le N-éthyl-N-nitrosourea (ENU) sont particulièrement utiles en raison des mutations ponctuelles aléatoires qu'ils induisent, résultant en une approche intrinsèquement impartiale qui a mis en lumière de nombreuses fonctions génétiques dans les organismes modèles eucaryotes3,4,5 (en revanche, la mutagénèse des rayons X crée des ruptures d'ADN et peut entraîner un réarrangement plutôt que des mutations ponctuelles6).
La mouche commune des fruits Drosophila melanogaster est un sujet idéal pour ces écrans en raison de sa haute qualité, séquence du génome bien annoté, sa longue histoire en tant qu'organisme modèle avec des outils génétiques très développés, et surtout, son partagé histoire évolutive avec les humains7,8. Un facteur limitant dans l'applicabilité de ce protocole est la létalité précoce causée par les gènes mutés, ce qui empêcherait les tests à l'âge de9ans . Cependant, pour les mutations non létales, un test d'escalade, qui tire parti de la géotaxie négative, est une méthode simple, bien que vaste, de quantifier le fonctionnement moteur altéré10. Pour montrer une réactivité locomotrice suffisante, les mouches dépendent des fonctions neuronales pour déterminer la direction, sentir sa position et coordonner le mouvement. L'incapacité des mouches à grimper suffisamment en réponse à des stimuli peut donc indiquer des anomalies neurologiques11. Une fois qu'un phénotype d'escalade défectueux particulier est identifié, d'autres essais utilisant un écran secondaire tel que l'analyse histologique du tissu cérébral, peuvent être employés pour identifier la neurodégénérescence dans les mouches grimpantes-défectueuses. La cartographie génétique ultérieure peut ensuite être utilisée pour révéler la région génomique sur le chromosome porteur du gène neuroprotecteur défectueux d'intérêt. Pour réduire la région chromosomique d'intérêt, la cartographie méiotique utilisant des lignées de mouches mutantes portant des gènes marqueurs dominants avec des emplacements connus sur le chromosome peut être effectuée. Les gènes marqueurs servent de point de référence pour la mutation car la fréquence de la recombinaison entre deux loci fournit une distance mesurable qui peut être utilisée pour cartographier l'emplacement approximatif d'un gène. Enfin, le franchissement des lignes mutantes avec des lignes portant des déficiences équilibrées sur la région chromosomique méiotatiquement cartographiée d'intérêt crée un test de complémentaration dans lequel le gène d'intérêt peut être vérifié si son phénotype connu est exprimé5. Les séquences de nucléotides polymorphes dans le gène identifié, ce qui pourrait entraîner une modification des séquences d'acides aminés, peuvent être évaluées en séquençant le gène et en le comparant à la séquence du génome de Drosophila. La caractérisation ultérieure du gène d'intérêt peut inclure l'essai d'allèles mutants supplémentaires, des expériences de sauvetage de mutation et l'examen de phénotypes additionnels.

<table><tbody><tr><td><fort>Équipement majeur</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte pour histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>L’objectif préféré pour l’imagerie est 20x</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie Appareil</td><td></td> photo microscope Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Thermocycleur Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essai de poussée et de montée des mouches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg ; Flacon de drosophile,</td><td>VWR</td><td>étroit 75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg ; Ruban d’étiquetage de laboratoire à usage général</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Tapis</td><td></td><td></td><td></td>de souris standard</tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Modèle Motic</td><td></td><td>SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 station d’anesthésie (sarbacane, clapet de pied, tapis anti-mouches ultime)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td> Réservoir de CO2</td></tr><tr><td>Brosses à pointe fine</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubateur</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp ;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila ligne utilisée pour la cartographie de recombinaison</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Génotype : wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp ;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>La lignée d’équilibrage de la drosophile utilisée pour la cartographie de la recombinaison</td></tr><tr><td>Kit de déficience pour le chromosome 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Analyse histologique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100 %)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade ; &nbsp ; Tubes de microcentrifugation haut de gamme : 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agent nettoyant Histochoice 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade ; &nbsp ; Richard-Allan Scientific&commerce ; Thermo</td><td>Scientific&négoce ; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysine lames de microscope, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade ; &nbsp ; Lunettes de couverture : Rectangles</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Dimensions : 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Minuterie traçable</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-diapositives</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>modèle n° 26025</td></tr><tr><td>Plateau et supports de diapositives</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Rack pour contenir 20 diapositives</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade ; &nbsp ; Pince à usage général extra-longue</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade ;</td><td>Kimberly-Clark et le commerce ; Professionnel&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs puritains de 6 pouces</td><td>Hardwood Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg ; Lames de rasoir</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware ou récipients en verre pour liquides d’histologie</td><td></td><td></td><td>16 + 1 pour l’eau courante</td></tr><tr><td>Lames de microtome à revêtement à profil élevé</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade ; &nbsp ; Seau à glace rond avec couvercle, 4 L</td><td>Corning&trade ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bécher</td><td></td><td></td><td>Ou autre récipient pour eau glacée et cassettes</td></tr><tr><td>Bain de tissu</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyse moléculaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg ; SV Gel et PCR Système de nettoyage</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq ADN polymérase</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu ; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&trade ; &nbsp ; SYBR&commerce ; Safe&trade ; Coloration de gel d’ADN&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Invitrogen&trade ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&commerce ; Agarose</td><td>&nbsp ; Invitrogen&trade ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN de 1 Ko Plus</td><td>&nbsp ; Invitrogen&trade ;</td><td></td><td></td></tr><tr>Logiciel <td></td><td></td><td>ApE-A Plasmid Editor</td><td>Disponible en téléchargement gratuit</td></tr> <tr><td>Statistical analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R progiciel<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Further analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*] ; wg[Sp-1]/CyO ; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Centre de stock de drosophile de Bloomington</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

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In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Il y a beaucoup à comprendre au sujet de l'commencement et de la progression des maladies neurodegenerative, y compris les gènes sous-jacents responsables. Le dépistage génétique à l'aide de mutagènes chimiques est une stratégie utile pour cartographier les phénotypes mutants aux gènes de Drosophila et d'autres organismes modèles qui partagent des voies cellulaires conservées avec les humains. Si le gène muté d'intérêt n'est pas mortel dans les premiers stades de développement des mouches, un test d'escalade peut être effectué pour dépister les indicateurs phénotypiques de la diminution du fonctionnement du cerveau, tels que de faibles taux d'escalade. Par la suite, l'analyse histologique secondaire du tissu cérébral peut être exécutée afin de vérifier la fonction neuroprotective du gène en marquant des phénotypes de neurodégénérescence. Les stratégies de cartographie génique comprennent la cartographie méiotique et la carence qui s'appuient sur ces mêmes essais peuvent être suivies d'un séquençage de l'ADN pour identifier les changements possibles des nucléotides dans le gène d'intérêt.

Dans cet aerticle, nous présentons les étapes utilisées pour identifier la tumeur du cerveau gène (brat) comme jouant un rôle dans le maintien de l'intégrité neuronale (par exemple, la neuroprotection) chez les mouches adultes17; une méthodologie qui peut être utilisée pour identifier les gènes impliqués dans la neuroprotection. Nous avons utilisé une approche génétique avancée (la stratégie est décrite dans la figure 1A</stro...

Nous présentons un protocole utilisant une approche génétique avancée au dépiste pour des mutants présentant la neurodégénérescence dans le melanogaster de Drosophila. Il intègre un test d'escalade, l'analyse histologique, la cartographie des gènes et le séquençage de l'ADN pour finalement identifier de nouveaux gènes liés au processus de neuroprotection.

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There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

L’objectif principal de ce protocole est d’utiliser la puissance de la génétique avancée pour identifier les gènes qui, lorsqu’ils sont dysregulated conduire à la neurodégénérescence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une approche impartiale et directe pour l’identification des gènes neuroprotecteurs qui pourrait être plus difficile à effectuer dans les modèles mammifères. Cette technique peut être utilisée pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans le processus de neurodégénérescence qui est associé à de nombreuses maladies telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.En plus d’identifier les gènes neuroprotecteurs, l’approche génétique avancée peut être utilisée pour découvrir des gènes impliqués dans d’autres processus biologiques tels que la fonction neuronale et la transmission. Pour commencer, recueillir des mouches homozygotes à partir de lignées appartenant à la collection mutagenisée de mutants Drosophila de l’ENU cartographiées au deuxième chromosome. Retournez les mouches âgées de 10 à 12 jours dans une chambre d’essai sans anesthésie une ligne à la fois et laissez-leur récupérer pendant cinq minutes.Avec le côté de marque de ligne de cinq centimètres vers le bas, appuyez de force sur la chambre trois fois sur un tapis de souris placé sur une surface solide de sorte que toutes les mouches commencent l’essai au fond. Observez la locomotion des mouches sur une période de 10 secondes. Enregistrez le nombre de mouches qui atteignent ou passent la ligne de cinq centimètres dans ce temps ainsi que le nombre total de mouches testées.Attendez une minute avant de commencer un deuxième essai. Répétez un minimum de trois répétitions d’essai par ligne. Après avoir anesthésié les mouches sur un tampon de dioxyde de carbone, couper les têtes volantes avec une lame chirurgicale et utiliser un pinceau pour les placer doucement dans un millilitre de fixatif Carnoy dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Ensuite, conservez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, assurez-vous que les têtes sont coulées dans la solution fixative. Sous un capot de fumée, utilisez une pipette P1000 pour remplacer la solution fixative par un millilitre de 70 % d’éthanol et maintenir les échantillons à quatre degrés Celsius pour une analyse future.À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les têtes fixes dans des cassettes de microbiopsie et fermer les cassettes. Envoyez les cassettes à une installation d’histologie pour traitement ou placez-les dans une machine automatisée de traitement des tissus si elles sont disponibles sur place. Exécutez le programme pour déshydrater, dégager et infiltrer les têtes avec de la paraffine.Ensuite, transférez les cassettes dans une station d’intégration de paraffine avec de la paraffine chauffée à 60 degrés Celsius et placez des moules de base en métal qui s’adaptent aux cassettes sur la station chauffée. Utilisez des forceps fins pour orienter les têtes de telle sorte qu’ils font face au dessus dans le moule de base. Une bonne orientation de la tête est essentielle pour l’analyse histologique.Après durcissement, couper chaque bloc de paraffine pour minimiser la surface qui sera sectionnée. Couper cinq sections de micromètres de chaque bloc sur le microtome. Ensuite, placez les rubans de paraffine sectionné dans un bain d’eau chauffée à 35 degrés Celsius pendant un maximum de cinq minutes.Immergez une glissade recouverte de polylysine dans le bain d’eau chauffée et utilisez un applicateur en bois pour placer les rubans sectionnés sur la toboggan. Laissez sécher l’air pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, utilisez un chauffe-glissière pour chauffer les toboggans pendant 15 minutes à 63 degrés Celsius.Sous un capot de fumée, placez les glissières sur un support de coloration de glissière et placez le support dans HistoChoice pendant cinq minutes deux fois suivi de plusieurs traitements d’éthanol et de bain d’eau distillée selon le manuscrit. Transférer la grille dans un récipient rempli de Harris Hematoxylin pendant deux à cinq minutes pour tacher. Ensuite, sortez le support de la solution Hématoxyline et placez-le sous l’eau courante du robinet pendant 10 minutes avant les étapes suivantes de coloration.Après coloration, à l’aide de forceps, sortez les diapositives de la solution HistoChoice ou Xylene. Égouttez une fine couche de milieu de montage permanent sur l’échantillon et placez doucement un coverslip sur le dessus. Évitez la formation de bulles.Une fois le milieu de montage durci, placez la lame sous un microscope léger pour obtenir des images de sections cérébrales représentatives à environ midbrain. Tout d’abord, préparer un aliment contenant du flacon pour générer des mouches femelles hétérozygotes. Après anesthésie au dioxyde de carbone, utilisez un pinceau pour transférer cinq mâles de la lignée mutante et 10 femelles vierges du lobe coincé sternopleural et épingler au-dessus de la ligne Curly O dans le flacon pour faire une croix.Placez le flacon à 25 degrés Celsius. Après 10 à 12 jours, recueillir au moins 15 descendance féminine vierge portant le chromosome muté et le chromosome marqueur. Croisez-les à cinq mâles à partir d’une ligne équilibrée qui porte un autre marqueur dominant visible Curly O sur scutoïde ou équivalent.Après 10 à 12 jours, recueillir la descendance masculine hétérozygote portant soit scutoïde ou Curly O et le chromosome potentiellement recombiné de la croix. Individuellement les accoupler à des femelles vierges du stock portant le chromosome muté. Dix à 12 jours plus tard, recueillir la descendance de la dernière croix dans de nouveaux aliments contenant des flacons et vieillir les mouches à 29 degrés Celsius à 10 à 14 jours.Effectuez l’histologie sur des têtes de mouche et répétez pour la progéniture de chaque croix individuelle. Avec cette information, effectuer la cartographie des carences sur la région rétrécie du chromosome pour affiner l’emplacement de la mutation récessive. Chaque ligne de carence a une suppression de la région différente des chromosomes leur permettant d’être utilisés pour les tests de complémentarité.Ensuite, croisez les lignes de la trousse d’insuffisance de Drosophila pour le deuxième chromosome et recherchez la non-complémentarisation du phénotype de l’intérêt. Pour obtenir une référence pour l’analyse des séquences d’ADN, téléchargez un fichier format FASTA contenant la séquence de consensus génomique du gène BRAT de FlyBase ou utilisez un fichier contenant des résultats pour la séquence BRAT d’un contrôle génétique de fond, par exemple la lignée Drosophila mutagenisée à l’origine. Ouvrez les fichiers de séquençage dans l’éditeur A Plasmid.Allez modifier et cliquez sur Aligner les séquences. À l’aide de la souris de l’ordinateur, sélectionnez toutes les séquences à comparer. Dans le menu drop, indiquez la séquence de référence pour cet alignement.Inspecter la région séquencée à la recherche de changements de nucléotide par rapport à la séquence de référence. Si vous le souhaitez, enregistrez l’alignement sur un ordinateur au format RTF en cliquant sur Texte puis Enregistrez. Effectuez l’expérience de sauvetage en recueillant la progéniture F1 de chaque croix.Sélectionnez soigneusement les équilibreurs marqués. Vieillir les mouches sur le milieu alimentaire Drosophila à 29 degrés Celsius et effectuer une analyse histologique sur le cerveau à la recherche de neurodégénérescence comme précédemment. Pour effectuer l’analyse dépendante de l’âge de la neurodégénérescence chez 867 mutants, l’âge des mouches à cinq, 15 et 25 jours et effectuer une analyse histologique ultérieure.Ce protocole présente une approche génétique avant de l’écran à travers une collection de mouches chimiquement mutagenisées à l’aide d’un essai d’escalade. Parmi les 235 lignées homozygotes, environ 37 % des lignées testées présentaient un taux de réussite en hausse inférieur à 50 % lorsqu’elles étaient testées à l’âge de 10 à 12 jours. L’écran histologique suivant sur 51 des lignes présentant le taux de passage d’escalade le plus bas a indiqué que 29 de ces lignes ont montré l’aspect visible des trous dans le neuropil de cerveau s’étendant de doux à grave indicatif de neurodégénérescence.Le phénotype de neurodégénérescence chez 867 mouches est récessif parce que le cerveau des mouches hétérozygotes 867 qui ont été dépassées à une souche de type sauvage étaient comparables à ceux des témoins. La ligne de carence Df24116 ne complète pas le phénotype mutant 867 basé sur l’essai d’escalade. La vérification histologique montre que la ligne de carence Df24116 ne complète pas le phénotype de neurodégénérescence 867 alors que Df9296 le fait.L’examen du phénotype cérébral de 867 mutants croisés à des lignées de carence supplémentaires a confirmé que la mutation est contenue dans la région du génome qui comprend le gène BRAT. Il est important de se rappeler au cours de cette procédure de travailler aussi rigoureusement et précisément que possible que ce protocole combine plusieurs étapes qui, si elles sont exécutées de manière incorrecte peut affecter l’identification des mutants avec la neurodégénérescence dans les gènes candidats. Selon les gènes identifiés, l’analyse ultérieure peut inclure l’essai d’ovules supplémentaires du gène de l’intérêt ou des interactions avec les gènes qui jouent un rôle dans les voies connues de neurodégénérescence.Pendant la procédure d’histologie, n’oubliez pas de manipuler la solution fixative du Carnoy avec prudence car elle contient du chloroforme. Portez des gants et utilisez-les avec une ventilation adéquate idéalement sous le capot de fumée. De même, effectuer toutes les taches histologiques sous le capot de fumée.

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