Name: Développement de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) Populations dans les cultures de petits grains par léthylique Methanesulfonate Mutagenesis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez le développement de populations TILLING robustes par mutagenèse EMS dans les céréales à petits grains. Cette méthode permet la découverte de gènes et la génomique fonctionnelle avec des équipements de base.

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Ce travail a été soutenu par l'USDA National Institute of Food and Agriculture, le projet Hatch 1016879 et le Maryland Agricultural Experiment Station par l'intermédiaire de la subvention MAES no 2956952.

1. Préparation de la courbe de dosage pour la mutagénèse efficace
<ol><li>Faire tremper 100 graines avec le génotype d'intérêt dans six flacons de verre de 250 ml (100 dans chaque flacon) contenant 50 ml d'eau distillée. Agiter à 100 tr/min pendant 8 h à température ambiante (RT) pour l'imbibition par les graines.</li>
	<li>Dans une hotte de fumée, préparez 50 mL de 0,4 %, 0,6 %, 0,8 %, 1,0 % et 1,2 % (w/v) solution de méthane d'éthyle (EMS) en dissolvant 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 et 0,498 mL de SME dans de l'eau distillée, respectivement. REMARQUE : Le SME est liquide à RT avec une densité de 1,206 g/mL. CAUTION : Utilisez l'équipement de protection individuelle (EPI) approprié tout en manipulant le SME.</li>
	<li>Décant l'eau de cinq flacons et ajouter 50 ml de solution EMS dans chaque flacon contenant des graines imbibées de sorte qu'il y ait six traitements différents avec 0,0 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 %, 1,0 % et 1,2 % de solution EMS. Agiter les flacons pendant 16 h à 75 tr/min et RT.</li>
	<li>Décant la solution EMS et collectez les graines traitées séparément pour chaque traitement à l'aide d'un chiffon à fromage. Inactiver la solution EMS utilisée en ajoutant un volume de solution inactivante EMS (0,1 M NaOH, 20% w/v Na2S2O3) pour 24 h. Traiter également les flacons contaminés et les pointes de pipette avec la solution inactivante EMS pendant 24 h.</li>
	<li>Laver les graines traitées au SME sous l'eau courante du robinet pendant 2 h. Transplanter chaque graine individuellement dans des dresseurs de racines contenant du sol de mise en pot.</li>
	<li>Cultivez des plantes à 20 à 25 oC sous une période de lumière de 16 h.</li>
	<li>Enregistrez des données sur la survie des plantes après 15 jours de transplantation. Utilisez l'équation suivante pour calculer le taux de survie pour chaque traitement : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq1.jpg"> REMARQUE : Si le taux de germination est inférieur à 100 % dans les contrôles, des taux de survie précis dans tous les traitements devraient être calculés après avoir soustrait le nombre de graines qui n'ont pas germé dans les contrôles. Un taux de survie de 40% à 60% est souhaitable pour une mutagénèse efficace. Il peut être nécessaire d'effectuer une deuxième série d'optimisation de dosage avec une concentration modifiée en fonction de la survie des graines traitées jusqu'à atteindre le taux de létalité souhaitable de 40%-60%.</li>
</ol>2. Mutagénèse et maintien de la population mutante
<ol><li>Faire tremper le lot final d'au moins 3 000 graines en répartissant également (600 graines chacune) dans cinq flacons de 1 000 ml contenant 300 ml d'eau distillée. Secouez pendant 8 h à 100 tr/min sous RT pour l'imbibition. REMARQUE : La taille finale de la population désirable dépendra de la fréquence de mutation et du niveau de ploidy du génotype, mais il est conseillé d'utiliser au moins 3 000 graines pour les héxaploïdes, 4 000 graines pour les tétraploïdes et plus de 7 000 graines pour les diploïdes.</li>
	<li>Dans une hotte de fumée, préparer 1 500 ml de la solution optimisée de concentration EMS dans de l'eau distillée.</li>
	<li>Décant l'eau des flacons et ajoutez 300 ml de la concentration optimale de la solution EMS dans chaque flacon contenant 600 graines imbibées. Agiter les flacons pendant 16 h à 75 tr/min et RT.</li>
	<li>Décant le SME et collectez les graines traitées dans du tissu à fromage. Inactivez la solution EMS et les conteneurs de traitement avec la solution inactivante EMS comme cela a été fait à l'étape 1.4.</li>
	<li>Laver les graines traitées au SME sous l'eau courante du robinet pendant 2 h. Transplanter chaque graine M1 traitée par le SME individuellement dans des dresseurs de racines.</li>
	<li>Cultivez des plantes M1 (dérivées de graines M0) à 20'25 oC sous une période de lumière de 16 h. REMARQUE : Il peut être nécessaire de vernaliser les semis à l'étape des deux feuilles pendant 6 semaines à 4 oC, si le génotype d'intérêt a une habitude de croissance de type hivernal.</li>
	<li>Laisser les plantes M1 s'autopolliniser et récolter les graines M2 séparément pour chaque plante fertile M1. REMARQUE : Pour éviter les risques de croisement séviscissant, recouvrez les pointes des plantes M1 de sacs de pollinisation avant l'anthèse.</li>
	<li>Plantez une seule graine M2 de chaque plante M1 pour éviter la redondance génétique.</li>
	<li>Recueillir les tissus des plantes M2 à l'étape à deux feuilles dans 1,1 ml de 96 microtubes de puits. Recueillir environ 80 mm de tissu foliaire de chaque plante et enregistrer l'iD de chaque échantillon dans un plan de collecte de tissus.</li>
	<li>Faire sécher le tissu foliaire à l'aide d'un lyophilisateur et le conserver à -80 oC.</li>
	<li>Maintenir les plants de M2 à 20 x 25 oC sous une période de lumière de 16 h.</li>
	<li>Enregistrez des données sur les phénotypes mutants des plantes M2 à intervalles réguliers. Les phénotypes attendus sont les albinos, la chlorine, la pousse herbeuse, variée, partiellement fertile, stérile, etc.</li>
	<li>Laisser les plantes M2 s'autofertiliser et mûrir. Récoltez et sauvez séparément les graines M3 des plantes M2 (Figure 1). REMARQUE : Les graines de M sont employées pour valider le phénotype dans des études de génétique inverse. Par conséquent, M doit être soigneusement catalogué et stocké dans des conditions fraîches et sèches. Alternativement, si la graine doit être augmentée dans le champ, des rangées de têtes peuvent être plantées pour chaque plante De, et les graines m de chaque ligne peuvent être récoltées et sauvées séparément en tant que ressource de population de TILLING.</li>
</ol>3. Cel-1 test pour la caractérisation génétique des mutants
<ol><li>Extraire l'ADN du tissu foliaire de M2 à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN végétal avec un système de purification de l'ADN (voir Tableau des matériaux) suivant les recommandations du fabricant.</li>
	<li>Quantifier l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre et normaliser les concentrations d'ADN à 25 ng/L avec de l'eau sans nauséail dans 96 blocs de puits. REMARQUE : Il est important de vérifier la qualité de l'ADN en l'exécutant sur un gel, car l'ADN de mauvaise qualité (ADN enduit) peut entraîner de faux négatifs dans des échantillons mis en commun.</li>
	<li>Créez des pools d'ADN 4x en combinant l'ADN de quatre blocs de puits 96 dans une seule plaque, tout en conservant l'identité de la ligne et de la colonne de chaque échantillon. Ajoutez 50 L d'ADN de chaque échantillon individuel dans la plaque de billard afin que chaque plaque de billard contienne un total de 200 L d'ADN provenant de quatre blocs de puits différents de 96.</li>
	<li>Cataloguez l'identité de l'ADN mis en commun dans le format de Pool Plate-Row-Column (p. ex., Piscine 1 A1 - Box1A1 - Box2A1 - Box3A1 et Box4A1).</li>
	<li>Concevoir des amorces spécifiques au génome [A1] pour le gène d'intérêt à l'aide de la page Genome Specific Primers (GSP) (lt;https://probes.pw.usda.gov/GSP-gt; avec des paramètres par défaut pour les espèces polyploïdes. Pour les diploïdes, utilisez Primer 3 'lt;http://primer3.ut.ee/'gt; pour la conception d'amorces en utilisant les paramètres par défaut. Concevoir plusieurs amorces, si nécessaire, pour couvrir toute la région de codage du gène d'intérêt. REMARQUE: Le dernier assemblage IWGSC peut être utilisé pour obtenir des séquences pour le gène d'intérêt pour le blé à l'aide de l'outil URGI BLAST 'lt;https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST.gt;. La longueur optimale de l'amplicon est de l'ordre de 800 à 1 500 pb. Le tableau 1 montre des exemples d'amorces pour les gènes cireuses dans le blé hexaploïde.</li>
	<li>Exécutez un PCR pour les amorces spécifiques aux gènes sur l'ADN mis en commun comme suit :<ol>
<li>Ajouter 5 'L de tampon PCR, 2 'L (chacun) de 4 amorces avant et inversées, 0,1 'L de polymérase d'ADN (voir tableau des matériaux),5 'L de modèle d'ADN mis en commun, puis augmenter le volume à 25 'L en utilisant de l'eau sans nucléane.</li>
		<li>Utilisez un profil de toucher vers le bas pour exécuter la réaction PCR sur un cycleur thermique comme suit : 95 oC pour 1 min, sept cycles de 95 oC pour 1 min, 67 oC à 60 oC pour 1 min avec des baisses de température de 1 oC par cycle et 72 oC pour 2 min , suivi de 30 cycles de 95 oC pour 1 min, de 60 oC pour 1 min, de 72 oC pour 2 min, et d'une extension finale à 72 oC pour 7 min. REMARQUE : Le profil CI-dessus PCR fonctionne sur le modèle d'ADN de blé pour la plupart des amorces conçues à l'aide des paramètres par défaut de l'amorce 3. En cas d'amplification non spécifique, le profil PCR doit être strict avant de passer aux étapes suivantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Générer des hétéroduplexes entre l'ADN dépareillé en incubant des produits PCR dans le cycle thermique en utilisant le profil suivant : 95 oC pendant 2 min, cinq cycles de 95 oC pour 1 s, 95 oC à 85 oC pour 1 min avec des baisses de température de 2 oC par cycle, et 60 cycles de 85 à 25 oC avec diminutions de 1 oC par cycle.</li>
	<li>Ajoutez 2,5 l d'endonucalage Cel-1 maison aux produits PCR hétéroduplexés et incubez 45 min à 45 oC. Terminez la réaction Cel-1 en ajoutant 2,5 L de 0,5 M EDTA (pH 8,0). REMARQUE : L'endouclence Cel-1 peut être extraite des tiges fraîches de céleri utilisant le protocole exécuté par Till et autres19 Il est très important de tester l'activité et la quantité optimale de Cel-1 endonuclease, qui peut être testée utilisant des mutants précédemment caractérisés ou un kit de détection de mutation disponible dans le commerce.</li>
	<li>Exécuter les produits traités Cel-1 sur un gel d'agarose de 3,0% à 100 V pendant 2,5 h. Les puits contenant des bandes clivées plus petites et uniques, en plus des bandes non clivées pleine longueur, contiendront l'échantillon d'ADN mutant.</li>
	<li>Piscines mutantes denconvolute.<ol>
<li>Suivez les étapes 3.6, 3.7, 3.8 et 3.9 pour les échantillons d'ADN M2 individuels constituant les pools mutants identifiés à l'étape 3.9.</li>
		<li>Pour déterminer la zygosité des mutants, exécutez deux PCR (comme décrit à l'étape 3.6) pour l'ADN M2 individuel, dans lequel la première réaction contient 2,5 L d'ADN M2 et 2,5 L d'ADN de type sauvage et la deuxième réaction ne contient que 5 L d'ADN M2. Si la mutation est hétérozygote, une bande clivée supplémentaire sera présente dans les deux réactions. D'autre part, d'autres bandes clivées ne seront trouvées que dans la première réaction si le mutant est homozygote.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour identifier la nature de la mutation, séquencez les produits PCR des mutants confirmés à l'aide d'une plate-forme de séquençage Sanger suivant les instructions du fabricant.</li>
</ol>4. Calcul de la fréquence des mutations
REMARQUE : La fréquence de mutation d'une population de TILLING se rapporte à la distance physique moyenne dans laquelle une mutation se produit dans les individus de cette population. Par exemple, une fréquence de mutation de 1/35 kb dans une population de TILLING signifie qu'un individu moyen de cette population possède 1 mutation par 35 kb dans le génome.
<ol><li>Pour déterminer la fréquence de mutation d'une population de TILLING, calculez le nombre total de bases examinées.</li>
	<li>Pour calculer le nombre total de bases examinées, multipliez la taille du produit PCR par le nombre total d'individus examinés.</li>
	<li>Divisez le nombre total de bases examinées par le nombre de mutations uniques observées à l'aide de l'équation suivante, ce qui donnera à la région physique possédant 1 mutation dans la population donnée de TILLING : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59743/59743eq2.jpg"> REMARQUE : Pour tenir compte de la limitation de la résolution de 50 pb aux deux extrémités basée sur une plate-forme à base de gel d'agarose, soustrayez 100 pb de la taille du produit dans le calcul.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

TILLING est un outil de génétique inversée très précieux pour la validation des gènes, en particulier pour les petits grains où les approches basées sur la transformation ont de sérieux goulots d'étranglement11. Le développement d'une population mutagénaire avec une fréquence de mutation élevée est l'une des étapes critiques dans la conduite des études de génomique fonctionnelle. L'étape la plus importante dans le développement d'une population robuste de TILLING est de déterminer la concentration...

Les mutations ponctuelles dans les génomes peuvent servir à de nombreux fins utiles pour les chercheurs. Selon leur nature et leur emplacement, ces mutations peuvent être utilisées pour attribuer des fonctions à des gènes ou même des domaines distincts de protéines d'intérêt. D'autre part, comme source de nouvelles variations génétiques, des mutations utiles peuvent être sélectionnées pour les caractères souhaités à l'aide d'écrans de phénotypage et davantage utilisées dans l'amélioration des cultures. TILLING est un puissant outil de génétique inverse qui comprend la mutagénèse chimique et la détection de la variation de séquence dans le gène cible. D'abord développé dans Arabidopsis1 et Drosophilia melanogaster2, les populations DE TILLING ont été développées et utilisées dans de nombreuses cultures de petits grains telles que le blé à pain hexaploïde (Triticum aestivum)3, orge (Hordeum vulgare)4, blé dur tétraploïde (T. dicoccoides durum)5, blé diploïde (T. monococcum)6 et l'ancêtre du génome "D" du blé Aegilops tauschii7 . Ces ressources ont été utilisées pour valider les rôles des gènes dans la régulation de la tolérance au stress abiotique et biotique8, la régulation du temps de floraison9, et le développement de variétés de cultures nutritionnellement supérieure5.
TILLING, avec l'utilisation d'agents mutagènes alkylants tels que le méthane sulfonate d'éthyle (EMS), l'azide de sodium, N-méthyl-N-nitrosourea (MNU), et le méthanesulfonate de méthyle (MMS), a des avantages sur d'autres outils de génétique inverse pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la mutagénèse peut être menée sur pratiquement n'importe quelle espèce ou variété de plante10 et est indépendante du goulot d'étranglement de transformation, qui est particulièrement difficile dans le cas des petits grains11. Deuxièmement, en plus de générer des mutations knock-out qui peuvent être obtenues par d'autres approches de validation des gènes, une gamme de mutations de mauvais sens et d'épissage peut être induite, ce qui peut discerner les fonctions des domaines individuels des protéines d'intérêt12. En outre, TILLING génère une collection immortelle de mutations dans tout le génome; ainsi, une seule population peut être utilisée pour la validation fonctionnelle de plusieurs gènes. En revanche, d'autres outils de génétique inversée génèrent des ressources spécifiques uniquement au gène à l'étude13. Les mutations utiles identifiées par TILLING peuvent être déployées à des fins de reproduction et ne sont pas soumises à la réglementation, contrairement à l'édition génétique, dont la classification non transgénique est encore incertaine dans de nombreux pays. Cela devient particulièrement pertinent pour les petits grains qui sont négociés à l'échelle internationale14.
TILLING est une stratégie de validation génétique simple et efficace qui nécessite le développement de populations mutagénaires pour étudier les gènes d'intérêt. Le développement d'une population mutagénaire efficace est essentiel pour déterminer l'efficacité d'une étude de validation génétique basée sur TILLING. Une population de TILLING avec une faible fréquence globale de mutation indique qu'une population peu large doit être examinée pour les mutations désirées, tandis qu'une concentration de mutagène élevée conduit à une mortalité élevée dans la population et un nombre insuffisant de mutagénaires. Une fois qu'une bonne population est développée, il existe de multiples façons de détecter les mutations dans les gènes d'intérêt, et le choix de la plate-forme dépend de l'échelle expérimentale et la disponibilité des ressources. Le séquençage du génome entier et le séquençage de l'exome ont été utilisés pour caractériser toutes les mutations dans les populations de TILLING chez les plantes ayant de petits génomes15,16. Le séquençage de l'exome de deux populations de TILLING a été effectué dans le pain et le blé dur et est disponible au public pour identifier les mutations souhaitables et commander des lignes mutantes d'intérêt17. Il s'agit d'une grande ressource publique en termes de disponibilité de mutations souhaitables; cependant, dans les études de validation de gène, la ligne sauvage-type devrait posséder le gène d'intérêt de candidat. Malheureusement, il est encore prohibitif de séquencer l'exome de toute la population de TILLING pour la validation inversée basée sur la génétique de quelques gènes candidats dans un autre contexte. Le séquençage d'amplicon et les essais à base de Cel-1 ont été utilisés pour détecter les mutations dans les populations ciblées dans le blé, et les essais cel-1 sont plus simples, ne nécessitant aucune connaissance computationnelle, et sont particulièrement appropriés pour la validation d'un petit nombre de gènes avec des matériel de laboratoire6,18.
Dans le présent article, décrits sont des méthodes pour le développement d'une bonne population DE TILLING, y compris la préparation de la courbe de dosage, la mutagénèse et le maintien de la population mutante, et le dépistage de la population mutante en utilisant le PCR-basé Cel-1 test . Ce protocole a déjà été mis en œuvre avec succès dans le développement et l'utilisation des populations mutagénaires de Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, orge, Aegilops tauchii7, et plusieurs autres. On y trouve des détails explicites de ces méthodes ainsi que des conseils utiles qui aideront les chercheurs à développer des populations de TILLING, en utilisant le SME comme mutagène dans n'importe quelle petite usine céréalière de choix.

<table><tbody><tr><td>96 puits 1,1 ml microtubes dans des microracks</td><td>National Scientific</td><td>TN0946-08R</td><td>Pour la collecte de tissus foliaires</td></tr><tr><td>Agarose I biotechnology grade</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td><td>Qiagen</td><td>941558</td><td>Kit pour l’extraction de l’ADN</td></tr><tr><td>Endonucléase Cel-1</td><td>Extrait comme décrit par Till et al 2006</td><td></td><td>Endonucléase spécifique simple brin</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanesulfonate d’éthyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-0880-25G</td><td>EMS, Mutagène chimique</td></tr><tr><td>Système de congélation Freeze Dry/Shell</td><td>Labconco</td><td></td><td>Pour la lyophilisation du tissu foliaire Kingfisher</td></tr><tr><td>Système de purification Flex</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>5400610</td><td>Robot d’extraction d’ADN à haut débit</td></tr><tr><td>My Taq DNA Polymérase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td></td></tr><tr><td>Eau libre de nucléases</td><td>Sigma aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie gel NuGenius</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbit Environ-shaker</td><td>Ligne</td><td></td><td></td>de laboratoire</tr><tr><td>SPECTROstar Nano</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>Nano goutte pour la quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td></td></tr></tbody></table>

développement de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (tilling) populations dans les cultures de petits grains par l'éthylique methanesulfonate mutagenesis

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Cibler les lésions locales induites dans les génomes (TILLING) est un puissant outil de génétique inverse qui comprend la mutagénèse chimique et la détection de la variation de séquence dans les gènes cibles. TILLING est un outil de génomique fonctionnel très précieux pour la validation des gènes, en particulier dans les petits grains où les approches basées sur la transformation ont de sérieuses limites. Le développement d'une population mutagénaire robuste est essentiel pour déterminer l'efficacité d'une étude de validation génétique basée sur TILLING. Une population de TILLING avec une faible fréquence globale de mutation indique qu'une population peu grande doit être examinée pour trouver les mutations désirées, tandis qu'une concentration de mutagène élevée conduit à une mortalité élevée dans la population, conduisant à une insuffisance nombre d'individus mutagérisés. Une fois qu'une population efficace est développée, il existe de multiples façons de détecter les mutations dans un gène d'intérêt, et le choix de la plate-forme dépend de l'échelle expérimentale et la disponibilité des ressources. L'approche à base de gel Cel-1 et de gel d'agarose pour l'identification des mutants est pratique, reproductible et une plate-forme moins gourmande en ressources. Il est avantageux en ce qu'il est simple, ne nécessitant aucune connaissance de calcul, et il est particulièrement approprié pour la validation d'un petit nombre de gènes avec l'équipement de laboratoire de base. Dans le présent article, décrits sont les méthodes pour le développement d'une bonne population DE TILLING, y compris la préparation de la courbe de dosage, la mutagénèse et le maintien de la population mutante, et le dépistage de la population mutante en utilisant le PCR-basé Cel-1 test .

La figure 2 montre la courbe de dosage du cultivar de blé de pain hexaploïde Jagger, du blé diploïde Triticum monococcum6, et d'un donneur de génome de blé Aegilops tauschii7. Les doses de SME pour les taux de survie souhaités de 50% étaient d'environ 0,25%, 0,6% et 0,7% pour T. monococcum, Ae. tauschii, et T. aestivum, respectivement. La tolérance plus élevée au SME ...

Il est décrit comme un protocole pour le développement d'une population de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) dans les petites cultures céréalières avec l'utilisation de l'éthyl methanesulfonate (EMS) comme mutagène. Un protocole de détection des mutations utilise l'analyse Cel-1.

Développement de lésions locales induites par le ciblage dans les génomes (TILLING) Populations dans les cultures de petits grains par l'éthylique Methanesulfonate Mutagenesis

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Ce protocole détaille le développement de populations tilling robustes avec une fréquence de mutation élevée par mutagenèse ems dans les petites cultures céréalières. Les populations de TILLING peuvent être utilisées pour la génomique fonctionnelle, ainsi que pour la découverte de gènes spatiaux génétiques avancés dans les petites cultures céréalières. Les populations tilling développées à l’aide de cette technique ont des fréquences de mutation élevées, et ce protocole peut être appliqué à n’importe quel génotype.La détection de mutation basée sur l’analyse Cel-1 peut être effectuée à l’aide d’équipements de laboratoire de base. L’étape la plus importante consiste à déterminer la concentration optimale de SME. Par conséquent, une courbe de dosage de SME devrait être faite spécifiquement pour la population individuelle.Pour commencer, tremper 100 graines avec le génotype d’intérêt dans chacun des six flacons de verre de 250 millilitres, contenant 50 millilitres d’eau distillée. Agiter à 100 RPM pendant huit heures à température ambiante pour l’imbibition. Ensuite, dans une hotte de fumée, préparer 50 millilitres de solutions ems de cinq concentrations différentes en mélangeant le liquide EMS et l’eau distillée.Après l’imbibition, décanter l’eau de cinq flacons. Ajouter 50 millilitres de solution EMS dans chacun des cinq flacons contenant des graines imbibées. Agiter les flacons pendant 16 heures à 75 rPM et à température ambiante.Maintenant, décanter la solution EMS dans une bouteille de déchets vides et verser les graines traitées sur du tissu à fromage placé sur une bouteille de déchets vides à recueillir séparément pour chaque traitement. Utilisez de l’eau supplémentaire pour aider à verser les graines. En outre, pulvériser plusieurs millilitres de solution d’inactivation ems sur le mur des flacons contaminés.Et plongez les pointes de pipette usé dans la solution pendant 24 heures. Inactive la solution EMS utilisée en ajoutant un volume de solution d’inactivation ems à traiter pendant 24 heures. À l’aide d’une cravate de torsion, maintenez les graines traitées par le SME à l’intérieur de la toile à fromage et lavez-les sous l’eau courante du robinet pendant deux heures.Après le lavage, transplantez chaque graine individuellement dans des dresseurs de racines contenant du sol en pot. Cultivez des plantes à 20 à 25 degrés Celsius pendant une période de lumière de 16 heures. Après 15 jours de transplantation, vérifiez les plantes et comptez le nombre de graines qui n’ont pas germé.Enregistrer les données sur la survie des plantes. Si le taux de survie n’est pas dans les 40 à 60% effectuer une deuxième ronde d’optimisation posologique avec une concentration modifiée jusqu’à atteindre le taux de létalité souhaité de 40 à 60%Après l’expérience de mutagenèse, recueillir le tissu folilaire des plantes M2 dans une boîte de collecte de tissus 96 puits. Les tissus sont prélevés sur les plantes M2 qui ont été cultivées à partir de plantes M1 auto-autonomes.Une plante M2 est montrée à partir de chaque plante M1. Extraire l’ADN à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN végétaux avec un système de purification de l’ADN suivant les recommandations du fabricant. Ensuite, chargez deux microlitres de l’extrait d’ADN dans des plaques LV avec 16 fentes.Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à des longueurs d’onde de 260 et 280 nanomètres. Diluer la concentration d’ADN à 25 nanogrammes par microlitre avec de l’eau sans nucléase. Créez quatre fois les piscines d’ADN de 200 microlitres en combinant l’ADN de chaque puits dans les quatre blocs de puits 96 dans une plaque de piscine tout en conservant l’identité de la rangée et de la colonne de chaque échantillon.Ensuite, préparez un tube de mélange principal PCR pour les amorces spécifiques aux gènes en ajoutant dans chaque tampon PCR tube, amorce avant et inverse, et polymése d’ADN selon le manuscrit. Aliquot le maître mélanger dans les puits d’une plaque 96 bien PCR. Ensuite, ajoutez le modèle d’ADN mis en commun.Chargez les tubes PCR dans un cycleur thermique et utilisez un profil de toucher des roues pour exécuter la réaction PCR sur le cycleur thermique. Pour générer des hétéroduplexes entre les AND dépareillés, incubez les produits PCR dans le cycleur thermique dans un autre programme. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’endonuclease cel-1 maison à chacun des produits PCR hétéroduplexés.Incuber pendant 45 minutes à 45 degrés Celsius. Après cela, mettre fin à la réaction Cel-1 en ajoutant 2,5 microlitres de 0,5 molaire EDTA au pH huit. Chargez 30,5 microlitres de chaque produit traité Cel-1 mélangés à cinq microlitres de teinture sur un gel d’agarose de 3 % et courez à 100 volts pendant deux heures et demie.Pour déconvoluter les pools mutants, déterminer la zygosité des mutants en exécutant deux réactions PCR pour l’ADN M2 individuel dans lequel la première réaction contient 2,5 microlitres d’ADN M2 et 2,5 microlitres d’ADN de type sauvage et la deuxième réaction ne contient que cinq microlitres d’ADN M2. Ce protocole montre la mutagenisation des petites cultures céréalières et la caractérisation du mutant. La courbe posologique indique des doses optimales de SME pour les taux de survie souhaités de 50 % pour trois espèces différentes de blé.La présence de phénotypes facilement identifiables dans la population de M2 confirme l’efficacité de la mutagenèse dans les petites populations céréalières. Voici quatre exemples des phénotypes mutants dans les populations de M2 TILLING, d’un mutant albinos dans une population d’orge M2, d’un mutant chlorina dans une population d’orge M2, d’un mutant panaché avec décoloration rose dans une population d’Aegilops tauschii M2, et d’un mutant à faible labour dans une population de Triticum monococcum M2. Une identification mutante à l’aide de Cel-1 sur les plates-formes de gel agarose montre un pool mutant potentiel identifié sur 12 piscines mutantes par des bandes fendées uniques.La déconvolution des piscines mutantes a déterminé la zygosity de la mutation et a aidé à suivre la mutation vers le bas aux échantillons individuels. La piscine A4 avait des mutations hétérozygotes, indiquées par des bandes fendées dans les échantillons d’ADN de type sauvage box 4 et box 4. La piscine H5 contenait des mutations homozygotes, car des bandes fendées uniques n’étaient présentes que dans l’échantillon d’ADN de type sauvage de type H5 de la boîte 5 H5.L’étape la plus importante consiste à déterminer la concentration optimale de SME pour atteindre un taux de létalité de 40 à 60 %. Une fois qu’une population tilling avec une fréquence de mutation élevée a été développée, elle peut être utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de n’importe quel gène d’intérêt. En outre, la population peut être une source de variation génétique utile pour l’amélioration des cultures.Tilling a été largement utilisé pour des études génomiques fonctionnelles dans les plantes modèles et cultivées. L’éventail des mutations obtenues peut être missents, knockouts, silent, ou même misspliced formes. Ems est un mutagen.Par conséquent, utilisez l’équipement de protection individuelle approprié pendant la manipulation du SME. Décontaminer les restes de solutions et les pointes de pipette usés.

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