Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Le modèle Fibril préformé Alpha-Synuclein est utilisé par les laboratoires du monde entier pour étudier les synucleinopathies. Bien que le modèle ait été utilisé avec succès par de nombreux laboratoires, certains groupes ont connu des incohérences générant des fibrilles et produisant une pathologie alpha-synucléine cohérente. Nous espérons que ce protocole, qui détaille la génération de fibrilles à partir de monomères alpha-synucléine et l’utilisation de fibrilles pré-formés in vivo, peut répondre aux questions que les chercheurs ont sur l’utilisation du modèle.

Le modèle Fibril préformé Alpha-Synuclein récapitule les caractéristiques clés de la maladie de Parkinson, telles que la pathologie alpha-synucléine et la neurodégénérescence. Et il a été démontré qu’il conduit à des déficiences motrices modestes dans certains modèles animaux. La formation d’inclusions contenant de l’alpha-synucléine phosphorylatée et un cours prolongé vers la neurodégénérescence offre aux chercheurs différentes étapes tout au long de la progression de la synucléinopathie, pour étudier et cibler des interventions thérapeutiques potentielles.

Démontrant la préparation d’aiguilles en verre personnalisées, est notre technicien de laboratoire, Christopher Kemp. Pour commencer cette procédure, décongeler les monomères alpha-synucléine sur la glace. Re-suspened les monomères décongelés en feuilletant doucement sur le tube.

Et centrifugeuse à 15 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de micro centrifugeuse propre de 1,5 mL et enregistrez la quantité transférée. Diluer les monomères avec 1x dPBS à une concentration finale de 5 mg par mL.

Brièvement vortex à mélanger, et brièvement centrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Ensuite, utilisez un film adhésif pour fixer le couvercle du tube de micro centrifugeuse fermé. Placez le tube dans un thermo-mélangeur orbital avec un couvercle pendant sept jours à 37 degrés Celsius tout en secouant à 1000 rpm.

Au bout de sept jours, le contenu du tube doit apparaître trouble. Tout d’abord, en revuis tout l’équipement de protection individuelle nécessaire, y compris des gants, un manteau de laboratoire et un écran facial. Puis, dans un capot de culture cellulaire, fixez une sonde de 3,2 mm de diamètre au convertisseur.

Réglez l’amplitude des sonicateurs à 30% et pulsez à une seconde sur et une seconde hors tension et le temps à une minute. Décongeler les fibrilles à température ambiante, et tout en restant dans le capot de la culture, diluer les fibrilles avec dPBS stérile. Ensuite, humidifiez un tissu de laboratoire avec 70% d’éthanol et utilisez-le pour essuyer la sonde du sonicateur pour le nettoyer.

Submergez la pointe de la sonde dans de l’eau doublement distillée et pulsez 10 fois pour nettoyer davantage la sonde. Après cela, essuyez la sonde à sec avec un tissu de laboratoire. Placez la pointe de sonde nettoyée dans le tube de fibrilles diluées et placez la pointe au fond du tube.

Sonicate les fibrilles diluées en utilisant les paramètres précédemment définis tout en déplaçant la sonde de haut en bas au cours de chaque impulsion pour s’assurer que tous les fibrilles dans le liquide sont sonicated. Après la sonication, centrifugeuse brièvement pendant une seconde à 2000 g pour recueillir tout le liquide des côtés du tube. Submergez la pointe de la sonde en 1% SDS et pulsez 10 fois pour nettoyer la sonde.

Ensuite, retirez la pointe du SDS et submergez-la dans de l’eau distillée double et pulsez 10 fois. Essuyez la sonde avec un tissu de laboratoire amorti avec 70% d’éthanol et essuyez-la à sec avec un tissu de laboratoire sec. Détachez la sonde du convertisseur et rangez-la.

Après cela, essuyez toutes les surfaces du capot avec 1% de SDS suivi de 70% d’éthanol. Pour commencer, placez un tube capillaire en verre siliconisé dans un tire-aiguille en verre. Allumez l’élément chauffant et laissez les poids attachés étirer le tube capillaire en verre chauffé.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le tube capillaire en verre tiré au point le plus mince au milieu et retirer l’aiguille en verre du tire-aiguille en verre. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper une longueur de tube d’enveloppement de rétrécissement à environ 40 mm. Faites glisser l’enveloppe de rétrécissement sur l’aiguille métallique d’une seringue biseauté de 10 microlitres.

Utilisez une flamme nue pour chauffer et coller l’enveloppe de rétrécissement à l’aiguille, tout en s’assurant de faire pivoter l’aiguille pour appliquer la chaleur uniformément. Faites glisser soigneusement l’extrémité plus grande de l’aiguille en verre tiré sur l’aiguille métallique de la seringue. Après cela, couper une longueur de tube d’enveloppement rétréci à environ 40 mm et le glisser soigneusement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille métallique de la seringue.

Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe de rétrécissement pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal. Pour fixer davantage l’aiguille et prévenir les fuites potentielles, coupez une longueur supplémentaire de tube d’enveloppement rétréci à environ 40 mm et glissez-la soigneusement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille métallique de la seringue. Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe de rétrécissement pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper l’aiguille en verre de sorte que la pointe est d’environ 8 mm de long. Pour tester l’aiguille, remplissez une seringue de 1 mL d’une aiguille de calibre 26 attachée avec de l’eau distillée. Retirez le piston métallique de la seringue en verre personnalisée et insérez l’aiguille de la seringue remplie d’eau dans la base de la seringue personnalisée.

Inspecter l’interface de l’aiguille en verre et de l’aiguille métallique pour décexer les fuites et confirmer un écoulement régulier de l’eau. Ensuite, remplissez un tube de micro centrifugeuse d’eau distillée. Utilisez la seringue d’aiguille en verre personnalisée pour puiser dans l’eau distillée.

Inspectez l’aiguille pour confirmer que du liquide est pris dans la seringue et qu’il n’y a pas de bulles. S’il y a des bulles, ou si l’eau n’est pas aspirée dans l’aiguille, couper l’aiguille peut aider à alléger la pression. Après cela, conservez soigneusement la seringue avec les aiguilles de verre attachées, dans les boîtes de seringue jusqu’à ce que nécessaire pour les chirurgies.

L’examen par microscopie électronique de transmission confirme la présence de longs fibrilles. En comparaison, les monomères alpha-synucléine sont visibles par l’orge et n’ont pas de forme discernable. La confirmation analoïde des fibrilles est alors confirmée à l’aide d’un essai de Thioflavin T.

Un essai représentatif montre que le dPBS et les monomères de souris produisent un signal inférieur dans les unités flouresent relatives par rapport aux PFFs de souris. Le monomère humain d’alpha-synucléine produit un signal semblable au monomère de souris. Alors que les PFF humains produisent également un signal plus élevé que les monomères.

Pour asses la présence de fibrilles pelitibles, un test de sédimentation est effectué. Dans les échantillons de souris et de PFF humains, l’infraction supernée devrait avoir plus de protéines dans la pastille que le supernatant. En revanche, la majorité de la protéine de la souris et des monomères humains est présente dans le supernatant avec peu de présent dans la pastille.

Les PFF de souris et d’humains sont sonicated pour produire des PFFs des longueurs appropriées pour ensemencer des inclusions d’alpha synucléine. Un examen complet d’environ 500 fibrilles révèle que la longueur moyenne des fibrilles de souris est d’environ 44 nanomètres. Avec 86,6% des PFF mesurant 60 nanomètres ou moins.

Les PFF humains, cependant, ont une longueur moyenne d’environ 55,9 nanomètres avec 69,6% des PFF mesurant 60 nanomètres ou moins. L’examen in vivo de l’efficacité de PFF est confirmé utilisant l’immunohistochimie. Les inclusions formées dans le nigra de substantia, partagent des propriétés semblables aux corps de Lewy en ce qu’elles contiennent la synucléine alpha phosphorylatée, contiennent des structures aminloyed, et tachent avec le thioflavine S, et sont résistantes à la digestion de Proteinase K.

La sonication peut exposer la sonication individuelle aux fibrilles préformées aérosolisées. En tant que tel, des vêtements de sécurité appropriés doivent être portés et la sonication effectuée dans une hotte pour minimiser le risque d’exposition.