In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As
July 17th, 2019
Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.
Ce protocole offre une plate-forme étiquetée biotine pour l’étude des interactions protéine-acide nucléique qui s’avère robuste, fiable, efficace et abordable. Le même lot d’acides nucléiques étiquetés biotine peut être utilisé sur une longue période de temps, en maintenant la reproductibilité des expériences. Enfin, tous les analyses étiquetées biotine décrites ici peuvent être effectuées en une journée et ne nécessitent pas d’équipement spécial.
Lina Yu, une postdograde de notre laboratoire, démontrera la procédure. Préparez les constructions MEIOB et MOV10 et transformez-les en bactéries appropriées. Pour extraire meiob, pelleter les cellules par centrifugation et les résuspendre en 20 millilitres de phosphate glacé de Dulbecco saline tamponnée, ou DPBS, tampon.
Sonicate la suspension bactérienne sur la glace. Ensuite, centrifugeuse le lysate à 12 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, et transférer le supernatant dans un tube frais. Pré-laver les perles de glutathion-sepharose, et les incuber avec le lysate à quatre degrés Celsius pendant deux heures.
Centrifuger le mélange à 750 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute pour pelleter les perles. Rincer les perles avec 10 millilitres de PBS glacé huit fois. Ensuite, ajouter un millilitre de tampon d’élitution, incuber les perles à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, et évaporer les perles par centrifugation.
Répétez l’élitution six fois et rassemblez les six fractions. Transférer les protéines évasées dans un filtre centrifuge, et concentrer par centrifugation à 7500 fois g pour un volume final de 100 à 200 microlitres. Pour extraire MOV10, exprimer la protéine dans les cellules HEK293T et pelleter les cellules selon les instructions manuscrites.
Resuspendez la pastille en trois millilitres de tampon de lyse cellulaire avec un cocktail inhibiteur complet de protéase sans EDTA, et incubez pendant 30 minutes sur la glace. Puis, centrifugeuse le lysate à quatre degrés Celsius. Préparez des perles magnétiques anti-FLAG en les lavant deux fois avec le tampon K150.
Après le lavage, resuspendez les perles dans un millilitre de tampon K150 glacé et incubez-les pendant deux minutes à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Recueillir les perles sur un aimant, et enlever le surnatant. Ajouter les perles à la cellule lysate, et incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures.
Lavez les perles avec K150 tampon selon les instructions manuscrites, et resuspendez les perles dans 300 microlitres de tampon flag elution. Placez les perles sur un aimant, recueillez le supernatant avec les protéines MOV10 et déterminez la concentration en protéines. Préparez les oligonucléotides d’ARN en diluant chaque oligo à 20 micromolaires et en les annelant pour former des duplex d’ARN selon les instructions manuscrites.
Pour l’essai de changement électrophoretic meiob de mobilité, ou EMSA, mélangez les reagents selon les directions manuscrites. Ajouter de l’eau pour un volume de réaction final de 20 microlitres. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes, puis ajouter 5x tampon d’arrêt.
Pour l’analyse de l’activité helicase MOV10, mélanger les reagents selon les instructions manuscrites et ajouter de l’eau pour un volume de réaction final de 20 microlitres. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, 30 minutes et 60 minutes, puis ajouter un tampon d’arrêt de 5 x pour arrêter la réaction. Ensuite, préparez un gel polyacrylamide 20% indigène, et chargez 20 à 25 microlitres de chaque échantillon dans chaque puits.
Faire fonctionner le gel à 100 volts sur un bain de glace jusqu’à ce que le marqueur bleu bromophénol ait migré vers le dernier quart du gel. L’acrylamide est nocif et toxique. Il est important de le manipuler avec l’équipement approprié de protection individuelle.
Démonter les plaques de gel et couper le gel en enlevant les puits de chargement et les voies inutilisées. Placez le gel dans un tampon TBE de 0,5 x. Couper le papier filtre et la membrane de nylon à la taille du gel, pré-mouiller le papier et la membrane, et assembler la pile pour le transfert.
Transférer les échantillons du gel à la membrane dans un appareil électrophoretic semi-sec à 90 milliamperes pendant 20 minutes. Ensuite, reliez les échantillons en irradiant la membrane à 120 millijoules par centimètre au carré pendant 45 à 60 secondes. Pour la détection de la chimioluminescence, commencez par ajouter 20 millilitres de tampon de blocage à la membrane et l’incuber pendant 15 à 30 minutes tout en secouant doucement.
Retirez soigneusement le tampon de blocage et remplacez-le par un tampon conjugué/bloquant. Incuber la membrane à nouveau pendant 15 minutes. Laver la membrane quatre fois en secouant pendant cinq minutes par lavage.
Ajouter ensuite 30 millilitres de tampon d’équilibrage du substrat à la membrane et l’incuber pendant cinq minutes tout en secouant de 20 à 25 rpm. Couvrir toute la surface de la membrane avec la solution de travail du substrat, et incuber pendant cinq minutes. Après l’incubation, numériser la membrane dans un système d’imagerie chimioluminescente pendant une à trois secondes.
La purification des protéines MEIOB A, C et E peut être vérifiée avec la coloration bleue coomassie et l’analyse des taches occidentales. Les flèches rouges indiquent les positions des protéines MEIOB purifiées. Les interactions entre le MEIOB et l’ADN à brin unique peuvent être visualisées à l’aide de l’EMSA.
La liaison et le clivage dépendants de la concentration sont observés. Comme prévu, seul le MEIOB-A de type sauvage interagit avec l’ADN alors que les mutants MEIOB-E et MEIOB-C ne le font pas. Des interactions entre meiob et ARN mono-échoué peuvent également être observées.
Le MEIOB de type sauvage montre une activité de liaison et d’exonucléase dépendante de la concentration sur l’ARN uni brin. Cependant, la comparaison quantitative montre que MEIOB lie l’ADN avec une efficacité plus élevée que l’ARN. La purification de MOV10 a été vérifiée avec la coloration bleue de Coomassie, et l’activité de la protéine d’helicase a été mesurée sur un duplex d’ARN avec un surplomb de cinq-prime.
À mesure que le temps de réaction augmente, MOV10 déroule progressivement l’ARN à double brin. Pour réduire le coût de l’analyse, la détection de la chimioluminescence peut être effectuée soit avec une double dilution des réadiants du kit de détection, soit avec des réaccents self-made. Le protocole décrit ici a utilisé avec succès des acides nucléiques biotine-étiquetés comme substrats pour des essais biochimiques in vitro tels que EMSA et pour des réactions enzymatiques dans lesquelles la biotine n’a pas été couramment employée.
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Aperçu
Ce protocole offre une plateforme marquée à la biotine pour l'étude des interactions protéine-acide nucléique qui s'avère robuste, fiable, efficace et abordable. Le même lot d'acides nucléiques marqués à la biotine peut être utilisé sur une longue période, maintenant la reproductibilité des expériences.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Interactions protéine-acide nucléique
Contexte
- Les marqueurs de biotine sont largement utilisés dans les dosages biochimiques.
- Les interactions protéine-acide nucléique sont cruciales pour divers processus biologiques.
- Les protocoles fiables améliorent la reproductibilité des expériences.
- Les méthodes efficaces économisent du temps et des ressources dans la recherche.
Objectif de l'étude
- Fournir des protocoles pour des dosages biochimiques in vitro.
- Faciliter l'étude des interactions protéine-acide nucléique.
- Assurer l'utilisabilité à long terme des acides nucléiques marqués à la biotine.
Méthodes utilisées
- Préparation des constructeurs MEIOB et MOV10.
- Transformation dans des bactéries appropriées.
- Centrifugation pour extraire MEIOB.
- Remise en suspension dans de la solution tampon phosphate de Dulbecco (DPBS) glacée.
Résultats principaux
- Les protocoles peuvent être réalisés en une journée.
- Aucun équipement spécial n'est requis pour les dosages.
- Reproductibilité maintenue dans le temps avec le même lot d'acides nucléiques.
- Démonstration de la procédure par un chercheur postdoctoral.
Conclusions
- Les dosages marqués à la biotine sont efficaces pour étudier les interactions protéine-acide nucléique.
- Les protocoles sont accessibles et pratiques pour les chercheurs.
- L'utilisation à long terme d'acides nucléiques marqués à la biotine améliore la fiabilité expérimentale.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Biotin-labeled nucleic acid assays provide a cost-effective, reproducible alternative to radioactive labeling for studying protein-nucleic acid interactions in early discovery. The method supports target validation and mechanistic de-risking by enabling quantitative assessment of DNA binding, RNA unwinding, and nuclease activity without specialized equipment. This enhances predictive confidence in lead identification and preclinical triage by reducing reliance on hazardous isotopes while maintaining assay consistency across batches.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms DNA-binding activity of proteins like MEIOB through biotin-labeled EMSA, supporting target hypothesis interrogation.
- Operational Value: Enables functional validation of nucleic acid-processing enzymes such as MOV10 helicase and MEIOB exonuclease using standardized biotin substrates.
- Scientific Value: Facilitates comparative analysis of binding efficiency between DNA and RNA substrates to prioritize targets with stronger mechanistic relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a robust platform for preparing validated biotin-labeled nucleic acids that maintain reproducibility over extended storage periods.
- Operational Value: Allows assay execution within a single day using standard laboratory equipment, increasing throughput and reducing setup complexity.
- Scientific Value: Supports chemiluminescent detection with flexible reagent dilution, enabling cost-effective screening without compromising signal detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates direct functional readouts (binding, unwinding, cleavage) that align with phenotypic outcomes in meiotic recombination and RNA metabolism pathways.
- Operational Value: Enables continuity from recombinant protein purification to activity assessment in a streamlined workflow suitable for preclinical target validation.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming target mechanism through orthogonal, label-independent biochemical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The biotin-labeled assay platform integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, supporting mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of protein-nucleic acid interactions through quantitative EMSA and activity assays, clarifying target function and pathway involvement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and compound effect evaluation in secondary screening.
- Analytics: Generates time- and concentration-dependent data (binding, unwinding, cleavage) that support statistical comparison across conditions and mutants.
- Translational Research: Connects in vitro enzymatic activity to biological relevance in nucleic acid metabolism, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, long-term stable reagent batch that reduces variability and supports cross-project standardization in discovery biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by replacing radioactive labels with safe, detectable biotin tags while preserving assay sensitivity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces batch-to-batch variability through stable, long-term storage of biotin-labeled nucleic acids.
- Strategic Value: Lowers operational cost and safety burden by eliminating need for 32P handling, shielding, and waste disposal.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions through reliable, mechanism-based target de-risking prior to investment in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression and purification from bacterial and mammalian systems.
- Depends on standard electrophoresis and blotting apparatus for EMSA and chemiluminescent detection.
- Necessitates optimization of binding and reaction conditions (time, temperature, concentration) for each target-nucleic acid pair.
- Involves careful handling of acrylamide gels with appropriate PPE due to toxicity.
- Assumes access to chemiluminescent imaging systems; alternative detection methods may require validation.
