Name: Cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez la préparation de cultures de tranches flottantes à partir de tissu cérébral humain adulte. Cette méthode simplifiée et économique permet des analyses biochimiques et immunohistochimiques pour étudier les mécanismes de neurodégénérescence.

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Ce travail est soutenu par FAPESP (Grant 25681-3/2017 à AS), CAPES (Bourse postdoctorale PNPD/INCT-HSM à A.F. et Bourse prédoctorale à N.D.M.) et FAEPA. G.M.A. est titulaire d'une maîtrise du FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. est titulaire d'une bourse de recherche du CNPq. Nous remercions les patients et leurs familles d'avoir fait don des tissus réséqués pour cette étude. Nous tenons à souligner le soutien des résidents, des infirmières, des techniciens et de l'équipe du CIREP, de l'hôpital clinique de l'École de médecine Ribeiro Preto, université de Sao Paulo, qui ont aidé à diverses étapes du processus.

Des tissus cérébraux adultes vivants ont été obtenus à partir de patients subissant une neurochirurgie réséctive pour le traitement de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal(figure 1A). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital des cliniques de l'école de médecine De Ribeiro Preto (17578/2015), et les patients (ou leur personne responsable légale) ont accepté et signé les conditions du consentement éclairé. La collecte du tissu a été effectuée par l'équipe de neurochirurgie du Centre de chirurgie de l'épilepsie (CIREP - Cliniques Hospital à la Preto Medical School de Ribeiro, Université de Sao Paulo, Brésil).
1. Stérilisation des matériaux
REMARQUE : Tous les matériaux et solutions doivent être stérilisés avant utilisation.
<ol><li>Stériliser tous les outils chirurgicaux et les matériaux de tranchage de vibratome (porte-couteau, disque de spécimen, plateau tampon) dans un four stérilisant sec pendant 4 h à 180 oC.</li>
	<li>Stériliser les matériaux ou l'équipement sensibles à la température par irradiation UV ou gamma.</li>
	<li>Stériliser les médias et les solutions par autoclavation ou filtration à travers des membranes de pores de 0,22 m.</li>
</ol>2. Préparation de solutions
<ol><li>Préparer 15-20 ml de solution de transport: 50% v/v Hanks' solution de sel équilibrée (HBSS) pH 7.4, 50% v/v milieu basal pour le maintien des neurones cérébraux post-natals et adultes (Tableau des matériaux), complété par 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- acide piperazineethanesulfonic (Hepes), 3 mg/mL de glucose, et 33 g/mL de gentamicine. REMARQUE : La solution de transport doit être réfrigérée et oxygénée (bubbling avec du gaz carbogen) pendant au moins 20 minutes avant la collecte de l'échantillon.</li>
	<li>Préparer 300 ml de solution de découpage (HBSS complété de 10 mM HEPES et 3 mg/ml de glucose) et le refroidir au congélateur jusqu'à la formation initiale de cristaux.</li>
	<li>Préparer 20 ml de milieu de culture: milieu basal pour le maintien des neurones cérébraux postnatals et adultes (Tableau des matériaux) complété par 1% dérivé de la L-glutamine (Tableau des matériaux), 2% supplément pour la culture neuronale (Tableau de Matériaux), 1% pénicilline/streptomycine, et 0,25 g/mL d'amphotericine B.</li>
</ol>3. Mise en place de l'appareil de tranchage
REMARQUE : Ce protocole est idéalement exécuté avec l'aide d'un collègue en raison de la logistique de la collecte d'échantillons dans la salle chirurgicale.
<ol><li>Dans un seau de glace salée, laisser reposer la solution de tranchage sous le mélange de carbogen bouillonnant (95% O2, 5% CO2) pendant au moins 20 minutes avant l'utilisation.</li>
	<li>Préparer un bloc d'agarose de 3 % (environ 2 cm x 2 cm x 2 cm) et le supercoller sur le disque du spécimen de vibratome afin de créer un soutien mécanique supplémentaire à l'échantillon de tissu pendant le découpage (Figure 1E).</li>
	<li>Définir le vibratome pour trancher : épaisseur de section de 200 m, fréquence des vibrations de 100 Hz et vitesse de tranchage entre 0,5 et 1,0 mm/s.</li>
	<li>Verrouillez le plateau tampon vibratome à la base du vibratome et ajoutez de la glace pour la conserver au réfrigérateur avant de recevoir la solution de tranchage et l'échantillon, et tout au long de la procédure de tranchage.</li>
</ol>4. Collecte d'échantillons
REMARQUE : Dans ce protocole, le tissu néocortical humain a été rassemblé dans la salle chirurgicale et transporté au laboratoire.
CAUTION : Lorsqu'il s'agit d'échantillons humains, suivez les protocoles de sécurité appropriés établis par l'établissement.
<ol><li>Configurer l'appareil de transport (Figure 1C) qui se compose de: une bouteille de gaz portable avec mélange de carbogen connecté à une soupape de pression / flux qui contrôle la sortie de gaz connecté à un tube de silicium qui relie la sortie de gaz au transport navire; un navire de transport, habituellement un tube conique de centrifugeuse de 50 ml avec couvercle perforé pour l'entrée de gaz, contenant la solution de transport; et de la glace pour le refroidissement de l'échantillon pendant le transport.</li>
	<li>Recueillir et transporter le spécimen (Figure 1B) immédiatement au laboratoire. Submerse le spécimen dans la solution de transport à froid (constamment bullé avec le mélange de carbogen).</li>
</ol>5. Découpage
<ol><li>Transférer le spécimen dans un plat Petri (100 mm x 20 mm) contenant une solution de découpage et, avec de fines outils chirurgicaux, enlever soigneusement autant que possible les méninges restantes dans l'échantillon (Figure 1D).</li>
	<li>Choisissez la meilleure orientation de spécimen pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières de la conception expérimentale, et avec une lame de scalpel no 24, taillez une surface plane pour être la base collée au disque de spécimen.</li>
	<li>À l'aide d'une cuillère en plastique jetable et de pinceaux délicats, recueillir le fragment du plat Petri et sécher la solution excédentaire à l'aide de papier filtre (sec par capillarité et éviter de toucher le fragment de tissu avec du papier).</li>
	<li>À l'aide de superglue, attachez le tissu au disque du spécimen de vibratome jusqu'à ce qu'il soit fermement adhéré au disque et en contact avec le bloc d'agarose (Figure 1E).</li>
	<li>Placez le disque de spécimen de vibratome (avec le tissu correctement attaché) dans le plateau tampon de vibratome rempli de solution de tranchement qui doit bouillonner pendant tout le processus.</li>
	<li>Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée.</li>
	<li>La solution de tranchage doit couvrir à la fois le spécimen et la lame, puis commencer à trancher (Figure 1F).</li>
	<li>Couper le spécimen en tranches de 200 m. REMARQUE : Bien que certains vibratomes coupent automatiquement les spécimens, l'observation rapprochée et les ajustements mineurs de la vitesse de découpe pendant le processus peuvent aider à produire de meilleures tranches. Jeter les tranches irrégulières initiales.</li>
	<li>Transférer les tranches du bac tampon dans un plat Petri avec une solution de découpe et couper les bords lâches et l'excès de mater blanc à une proportion d'environ 70% cortex /30% de matière blanche.</li>
</ol>6. La culture
REMARQUE : Effectuez cette étape dans une armoire à flux laminaire sous un environnement stérile.
<ol><li>Ajouter 600 l de culture moyenne par puits (dans une assiette de 24 puits) et couver pendant au moins 20 min à 36 oC et 5 % de CO2 avant de placage les tranches.</li>
	<li>Déposer une tranche par puits à l'aide d'un pinceau (Figure 1G).</li>
	<li>S'il y a des puits inutilisés dans l'assiette, remplissez-les de 400 l d'eau stérile.</li>
	<li>Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2. REMARQUE : Le premier remplacement moyen doit être effectué entre 8 et 16 h après le placage selon la taille de la tranche.</li>
	<li>Supplément 10 mL du milieu de culture précédemment préparé avec le facteur neurotrophique dérivé de cerveau de 50 ng/mL (BDNF). REMARQUE : Au cours des 8 à 16 premiers heures, les tranches sont incubées dans 600 l l de milieu pour éviter la privation et l'acidification des nutriments, puisque la consommation moyenne dans cette phase est accélérée. À partir de l'étape suivante, le volume du puits moyen est ajusté à 400 L.</li>
	<li>Retirez 333 L du milieu conditionné de chaque puits et ajoutez 133 l de milieu frais complété par le BDNF.</li>
	<li>Répétez le processus de remplacement moyen toutes les 24 h en remplaçant un tiers du milieu conditionné par un milieu frais complété par le BDNF.</li>
</ol>7. Évaluer la santé, la morphologie et la fonction en tranches cultivées
REMARQUE: Pour induire la mort cellulaire aux fins de l'illustration dans les résultats représentatifs, certaines tranches ont été soumises à un traitement de 24 heures avec l'inducteur de stress oxydatif H2O2. Les étapes 7.1.2 et 7.1.3 décrivent l'utilisation de H2O2 pour induire la mort cellulaire.
<ol><li>Viabilité cellulaire REMARQUE : Une méthode simple et simple pour évaluer le neurotoxique/neuroprotection dans les cultures contestées de tranche est le 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) analyse 36 , qui mesure le pourcentage des cellules actives métaboliques36, qui mesure le pourcentage de cellules actives métaboliques dans des conditions normales par rapport aux échantillons traités.<ol>
<li>Dans l'armoire à débit laminaire, remplacer un tiers du milieu par un milieu frais.</li>
		<li>À partir d'une solution de stock H2O2 de 30 %, ajoutez un volume de H2O2 par puits pour atteindre la concentration finale prévue (30 mM ou 300 mM). REMARQUE: H2O2 a été ajouté après le changement quotidien du milieu pour garantir l'approvisionnement approprié en nutriments frais avant le défi.</li>
		<li>Incuber la plaque pendant 24 h à 36 oC, 5 % de CO2. REMARQUE : Après le traitement H2O2 (ou d'autres stimulants toxiques d'intérêt), les étapes suivantes décrivent la détermination de la viabilité cellulaire par l'assay de MTT.</li>
		<li>Ajouter 40 OL de solution MTT à une concentration finale de 0,5 mg/ml à chaque puits dans la plaque.</li>
		<li>Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2 pour 3 h.</li>
		<li>Laver les tranches avec de la saline tamponnée en phosphate (PBS) et transférer dans un microtube.</li>
		<li>Retirez soigneusement toute solution restante par pipetting.</li>
		<li>Peser les microtubes contenant les tranches pour déterminer la masse de chaque tranche (c'est la clé pour normaliser les lectures d'absorption obtenues). REMARQUE : Si nécessaire, les échantillons peuvent être congelés (-20 oC) à ce stade pour un traitement ultérieur.</li>
		<li>Homogériser les tranches de 200 oL d'isopropanol/HCl à l'aide d'un pilon motorisé.</li>
		<li>Centrifugeuse à température ambiante (RT) pendant 2 min à 2600 x g.</li>
		<li>Recueillir le supernatant et mesurer l'absorption à 540 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dépolarisation neuronale induite par KCl REMARQUE : La phosphorylation de la kinase de protéine activée par mitogène (MAPK) signalant la protéine en cascade ERK, suivie du ballonnement occidental, peut être employée pour la quantification de la réponse neuronale à la dépolarisation KCl-induite37.<ol>
<li>À l'armoire de débit, remplacer le milieu de culture par 300 L de HBSS précédemment réquilibé à 36 oC.</li>
		<li>Remplacez le HBSS par 300 L de HBSS frais préalablement récalcitrés à 36 oC.</li>
		<li>Incuber la plaque à 36 oC, 5 % de CO2 pendant 15 min.</li>
		<li>Remplacer le HBSS par le HBSS frais ou avec une solution de dépolarisation KCl de 80 mL (à 36 oC) et couver à 36 oC, 5 % de CO2 pendant 15 min.</li>
		<li>Transférer les tranches de la plaque dans les microtubes. À cette étape, les tranches peuvent être stockées à -20 oC pour un traitement ultérieur.</li>
		<li>Préparer des extraits de tissus dans 150 l'analyse radioimmunoprécipitation (RIPA) tampon (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% surfactant nonionic; 0,1% de sulfate dodécyl de sodium; pH 7,5). Extraits de centrifugeuse à 4 oC pendant 10 min à 16000 x g,recueillir supernatant, et déterminer la concentration totale de protéines en utilisant la méthode Bradford.</li>
		<li>Chargez 30 g de protéines totales sur une électrophoresde au polyacrylamide de sulfate de sulfate de 12 % (SDS-PAGE).</li>
		<li>Après l'électrophoresis, transférer la teneur en gel dans une membrane de nitrocellulose.</li>
		<li>Après avoir bloqué la membrane avec 5% de lait sec non gras dans le SCT plus 0,1% de tween, incuber avec la souris anti-pERK (1:1,000) pendant 16 h à 4 oC. Après le lavage, incuber pendant 2 h à RT avec lapin anti-ERK1/2 (1:1,000).</li>
		<li>Incuber avec l'anticorps secondaire HRP-conjugué approprié à RT pendant 1 h.</li>
		<li>Révélez avec le substrat HRP préféré.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation morphologique REMARQUE : En plus de la survie cellulaire et des évaluations fonctionnelles, il est important d'analyser la morphologie des tissus. Sachez que la résection de la tranche cultivée est une étape importante pour produire autant de matériaux de haute qualité que possible pour l'analyse morphologique.<ol>
<li>Fixation, cryoprotection et résection des tranches<ol>
<li>Transférer les tranches des puits avec un milieu de culture dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant du PBS.</li>
			<li>Retirez le PBS et ajoutez 1 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 %. Il est important que les tranches restent à plat avant d'ajouter PFA. Incuber toute la nuit à 4 oC.</li>
			<li>Retirez soigneusement la solution PFA et ajoutez 1 ml de solution de saccharose à 30 %. Incuber pendant 48 h à 4 oC.</li>
			<li>Fixer le microtome de congélation à -40 oC.</li>
			<li>Préparer une base de saccharose sur le stade du microtome où les tranches doivent être placées (Figure 2A). Laisser congeler complètement et couper soigneusement une partie du saccharose congelé pour produire une surface plane sur laquelle la tranche sera placée.</li>
			<li>Placer chaque tranche sur un film plastique étiré et utiliser un pinceau pour aplatir le tissu.</li>
			<li>Transférer la tranche étirée sur la base de saccharose congelée en un seul mouvement. REMARQUE : Il n'est pas possible de déplacer la tranche une fois qu'elle est au-dessus de la base congelée de saccharose. Effectuez cette étape de transfert avec soin.</li>
			<li>Laisser reposer la tranche de 5 à 10 min pour bien la congélation.</li>
			<li>Couper la tranche en sections de 30 m.</li>
			<li>Transférer les sections de 30 m dans un plat Petri contenant du PBS.</li>
			<li>Passez au protocole d'histologie plus adéquat à la conception expérimentale. REMARQUE : Les sections de 30 m peuvent être facilement utilisées pour l'immunohistochimie flottante, montées sur des glissières de microscopie pour une histologie plus poussée ou stockées dans une solution antigel à -20 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry REMARQUE : Les protocoles standard d'immunohistochimie et d'immunofluorescence varient d'un laboratoire à l'autre. Pour une version détaillée du protocole utilisé ici, consultez Horta et coll.38. Les anticorps primaires utilisés pour les immunostainings présentés à la figure 2 comprennent les noyaux neuronaux (NeuN), le marqueur de neurones matures en bonne santé, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), le marqueur des astorcytes, l'adaptateur ionisé de liaison de calcium (Iba-1) et les microglies marqueur.<ol>
<li>Incuber les tranches dans la solution de blocage (par exemple, 2% sérum d'âne normal en PBS) pendant 40 min.</li>
			<li>Incuber toute la nuit avec l'anticorps primaire sous une légère agitation à 4 oC.</li>
			<li>Après lavage avec PBS, incuber pendant 120 min avec l'anticorps secondaire biotinylated sous l'agitation douce à RT.</li>
			<li>Après le lavage avec PBS, incuber à RT pendant 120 min avec avidin-peroxidase conjugué (Tableau des matériaux).</li>
			<li>Révélez-le avec du DAB à 0,04 % d'ammonium de nickel.</li>
			<li>Montez les sections tachées sur des lames de microscopie recouvertes de gélatine et laissez-les sécher à l'air. Déshydrater dans l'éthanol, diaphaniser en xylène, finir avec le milieu de montage (Table of Materials), couvrir d'un bordereau et de l'image.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole pour la production de cultures de tranches flottantes et à court terme est une méthode alternative pour la culture de tranches néocorticales humaines adultes. Un tel protocole pour les cultures de tranches peut être propice aux études sur (mais pas limité à) l'optogénétique1,44,45, l'électrophysiologie2,3,4,5<sup...

L'utilisation d'échantillons humains dans la recherche est sans équivoque une excellente option pour étudier les pathologies du cerveau humain, et les techniques modernes ont ouvert de nouvelles voies pour l'expérimentation robuste et éthique en utilisant des tissus dérivés du patient. Des méthodes comme les cultures organotypic/slice préparées à partir du cerveau humain adulte ont été de plus en plus employées dans des paradigmes tels que l'optogénétique1, l'électrophysiologie2,3,4,5, plasticité 6,7,8,9, neurotoxicité/neuroprotection10,11,12,13, thérapie cellulaire14, dépistage des médicaments15,16,17, génétique et l'édition génétique12,18,19,20, entre autres, comme une stratégie pour mieux comprendre les maladies neurologiques à l'âge adulte.
La compréhension des mécanismes sous-jacents aux pathologies cérébrales humaines dépend de stratégies expérimentales qui nécessitent un grand nombre de sujets. Inversement, dans le cas des cultures de tranches, bien que l'accès aux échantillons humains soit encore difficile, la possibilité de générer jusqu'à 50 tranches à partir d'un seul échantillon cortical contourne partiellement l'exigence de recruter plusieurs volontaires en augmentant le nombre de répliques et d'essais effectués par tissu recueilli21.
Plusieurs protocoles pour les cultures organotypic/slice de cerveau ont été décrits, s'étendant des projets classiques d'oculo22,23 au tube de rouleau24,25,26, membranes semi-perméables interface27,28,29,30, et les tranches flottantes31,32. Selon les particularités d'un design expérimental, chaque technique a ses propres avantages et inconvénients. À court terme, les cultures de tranches flottantes libres du cerveau humain adulte est dans certains cas avantageuse par rapport à la méthode utilisée par Stoppini et coll.27, si l'on considère le fait que, bien que la survie cellulaire à long terme in vitro soit habituellement une préoccupation majeure lors de l'évaluation une méthode de culture, dans beaucoup d'expériences seulement de courtes périodes de temps dans la culture sont nécessaires12,31,32,33,34,35. Dans ces conditions, l'utilisation de cultures flottantes présente l'avantage d'être plus simple et plus rentable, ainsi que plus exactement ressemblant à l'état des tissus humains d'origine que les tranches maintenues en culture sur 2-3 semaines.
Malgré le potentiel des cultures de tranche à la neuroscience, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, particulièrement des sujets humains. Cet article décrit un protocole pour employer le tissu de cerveau recueilli des donateurs humains vivants soumis à la chirurgie résective de cerveau pour préparer des cultures de tranche flottantes. Les procédures de maintien et d'exécution des tests biochimiques et de biologie cellulaire à l'aide de ces cultures sont détaillées. Ce protocole s'est avéré utile pour analyser la viabilité et la fonction neuronale dans les investigations sur les mécanismes des neuropathologies liées à l'âge adulte.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-Acrylamide, solution à 30 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3449&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-ERK 2 (lapin)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-154</td><td>Dilution 1:1 000 in BSA 2,5 %</td></tr><tr><td>Anticorps anti-pERK (souris)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-7383</td><td>Dilution 1:1 000 dans BSA 2,5 %</td></tr> <tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x Réactif de colorant</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Utilisé dans le tampon RIPA</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sels équilibrés de Hank</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2)</td><td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>IgG de souris, AB entier lié à la HRP (anti-souris)</td><td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>Utilisé dans le tampon RIPA</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre (Molico)</td><td>Nestl&eacute ;</td><td></td><td>Utilisé pour le blocage membranaire</td></tr><tr><td>Tampon PBS pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline/Streptomicine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Prime Western Blot Detection Reagent</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG, HRP Linked whole Ab (anti-rabbit)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td><td>Utilisé dans le tampon RIPA</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>GE</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de tétrazolium de bleu de thiazolyle (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T-1378</td><td>Utilisé dans le tampon RIPA</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Utilisé dans le tampon RIPA</td></tr><tr><td>Eau ultrapure</td><td>Millipore</td><td></td><td>Eau stérile, dérivée du système de purification d’eau MiliQ</td></tr><tr><td>Equipment and Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Flat Bottom with Lid</td></tr><tr><td>Amersham Potran Premium (membrane nitrocellulosique)&nbsp ;</td><td>GE</td><td>29047575</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Mixture White</td><td>Martins</td><td></td><td>95 % O2, 5 % CO2 CO2</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>CO-24</td><td>Incubation de tranches 5 % CO2, 36&ordm ; C</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires Microtubes</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>Microtube de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Pilon motorisé</td><td>Kimble Chase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuillère</td><td></td><td></td> en plastique <td>Taille d’une cuillère à dessert</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Bic</td><td></td><td>Chrome Platinum, utilisée pour trancher avec vibratome</td></tr><tr><td>Lame</td> <td>de scalpelBecton Dickinson (BD)</td><td>Numéro 24</td><td>Utilisé pour le tranchage des tissus ; superglue recommandée de même taille ou plus petite</td></tr><tr><td>(Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>Composition : Etilcianoacrilato ; acide 2-propénoïque ; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol ; homopolymère</td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Nom du matériau/ de l’équipement pour l’immunohistochimie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-NeuN (souris)</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td>MAB377</td><td>Dilution 1:1 000 dans le tampon phosphate</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP (souris)</td><td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Dilution 1:1 000 dans le tampon phosphate</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IBA1 (lapin)</td><td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Dilution 1:2 000 dans le tampon phosphate</td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-souris biotinylé (H+L)</td><td>Vecteur</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gélatine Synthé</td><td>00G1002.02.AE</td><td>Utilisé pour le revêtement des lames</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>Équipé d’une platine de congélation (BFS-10MP, Physiotemp), réglée sur -40&ordm ; C</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Lapin IgG, AB entier lié à la HRP (anti-lapin)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Lames (Star Frost)</td><td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Lames enduites de gélatine</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kit (Peroxydase, Standard)</td><td>Vector</td><td>PK-4000, Kit Standard</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Synth</td><td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, ou cultures de tranche, ont été largement employés pour modéliser des aspects du système nerveux central fonctionnant in vitro. Malgré le potentiel des cultures de tranches en neurosciences, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, en particulier celles des sujets humains. L'utilisation de tissus humains adultes pour préparer les cultures de tranches est particulièrement attrayante pour améliorer la compréhension des neuropathologies humaines, car elles contiennent des propriétés uniques typiques du cerveau humain mature manquant de tranches produites à partir de rongeurs (généralement néonatales) tissu nerveux. Ce protocole décrit comment utiliser les tissus cérébraux recueillis auprès de donneurs humains vivants soumis à une chirurgie réséctive du cerveau pour préparer des cultures de tranches à court terme et flottantes. Des procédures pour maintenir et effectuer des essais biochimiques et de biologie cellulaire utilisant ces cultures sont également présentées. Les résultats représentatifs démontrent que le lamination corticale humain typique est préservé en tranches après 4 jours in vitro (DIV4), avec la présence prévue des principaux types de cellules neurales. En outre, les tranches de DIV4 subissent une mort cellulaire robuste lorsqu'elles sont confrontées à un stimulus toxique (H2O2), indiquant le potentiel de ce modèle pour servir de plate-forme dans les tests de mort cellulaire. Cette méthode, une alternative plus simple et rentable au protocole largement utilisé utilisant des inserts membranaires, est principalement recommandée pour exécuter des essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge. Enfin, bien que le protocole soit consacré à l'utilisation de tissus corticaux prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal, on fait valoir que les tissus prélevés dans d'autres régions ou conditions cérébrales devraient également être comme sources pour produire des cultures de tranches flottantes similaires.

Un aspect critique pour évaluer la qualité et la santé des tranches cultivées est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales, des neurones, et des cellules gliales prévus. L'architecture typique du lamination corticale humain a été observée dans une tranche à DIV4, révélée par l'immunolabeling neuronal (Figure 2D). De plus, on a également observé la présence prévue de microglies et d'astroglia(figure 2B,C).</str...

Un protocole pour préparer les cultures de tranches flottantes à partir du cerveau humain adulte est présenté. Le protocole est une variante de la méthode de culture de tranches largement utilisée à l'aide d'inserts membranaires. Il est simple, rentable et recommandé pour les essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge.

Cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Nous présentons un protocole pour préparer des cultures de tranches flottantes à partir de tissus cérébraux prélevés sur des donneurs humains vivants soumis à la chirurgie cérébrale réséctive. Cette culture est agréable à effectuer des analyses biochimiques et cellulaires de biologie ou de l’immunohistochimie. On s’attend à ce qu’il contribue à l’élucidation du mécanisme sous-jacent à la neurodégénérescence dans les maladies cérébrales associées.Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une alternative plus simple et rentable au protocole classique de culture des tranches à l’aide d’inserts membranaires. Bien que le protocole global ne soit pas complexe, certaines étapes telles que l’enlèvement des méninges, le collage du tissu au disque de spécimen vibratome, et la résection pour l’immunohistochimie sont mieux comprises une fois démontrées visuellement. Niele Mendes et Glaucia Almedia, qui sont des étudiants diplômés, et Giovanna Nogueira, une autre étudiante diplômée, contribueront à démontrer la procédure.Pour commencer cette procédure, ajouter du sel à un seau de glace. Transférer la solution de tranchage dans ce seau et laisser reposer sous le mélange de carb

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Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Nous décrivons une méthode pour préparer organotypiques coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Tranches de cerveau sont fixées sur les membranes poreuses et milieux de culture est autorisée à former une interface. Cette méthode préserve l'architecture brute de l'hippocampe pour 2 semaines de culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

Ce protocole décrit une analyse organotypique optimisé pour le cerveau postnatal et à haute résolution imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le flux rostrale migrateurs.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Cette vidéo montre une technique de préparation de cultures de tranches flottantes à partir du cerveau humain adulte. De fines tranches sont générées à partir d’une section de cerveau à l’aide d’un vibratome. Ces tranches sont ensuite suspendues dans un milieu de culture complété par des facteurs de croissance pour maintenir la viabilité des tissus.

Préparation de cultures en tranches flottantes à partir d’un cerveau humain adulte

La vidéo montre la génération et la maintenance de cultures de tranches organotypiques à partir de tissus de glioblastome. Le tissu isolé est noyé dans une matrice d’agarose, et des lames minces sont obtenues à l’aide d’un vibratome. Ces sections sont ensuite placées sur des inserts de membrane perméable à l’intérieur d’une microplaque et cultivées dans un milieu de maintenance de culture en tranches pour une maintenance à long terme.

Génération et maintien de cultures de tranches à partir de tissus de glioblastome humain

Dans cet article, nous montrons une méthode de préparation de tranches cérébrales aiguës à température physiologique, en utilisant une solution physiologique conventionnelle sans modifications spéciales pour la coupe (comme l’ajout de saccharose) et sans perfusion intracardique de l’animal avant la préparation de la tranche.

Slice It Hot: aiguë cerveau adulte trancher dans physiologique Température

Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.

Trancher les cultures organotypiques d&#39;études de neurogenèse postnatale

Hippocampe organotypiques (CSST) représentent un modèle in vitro qui simule la situation in vivo très bien. Nous décrivons ici une base vibratome amélioré tranchage protocole pour obtenir des tranches de haute qualité devant servir à évaluer le potentiel neuroprotecteur de substances nouvelles ou le comportement biologique des cellules tumorales.

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.

Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

Ce protocole décrit la préparation des tranches horizontales de cortex hippocampal-entorhinal (HEC) des souris présentant l’activité spontanée d’ondulation d’onde forte. Les tranches sont incubées dans une chambre de rétention d’interface simplifiée et les enregistrements sont effectués dans des conditions submergées avec un fluide céphalo-rachidien artificiel à écoulement rapide pour favoriser l’oxygénation des tissus et l’émergence spontanée de l’activité au niveau du réseau.

Le cerveau aigu de souris tranche pour étudier l’activité spontanée de réseau hippocampal

Ce protocole décrit des cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte combinées à la transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes, qui présentent une nouvelle méthodologie pour tester davantage les thérapies à base de cellules souches pour les troubles neurodégénératifs humains.

Cultures organotypiques du cortex humain adulte comme modèle ex vivo pour la transplantation et la validation de cellules souches humaines

Découvrez la préparation de cultures de tranches flottantes à partir de tissu cérébral humain adulte. Cette méthode simplifiée et économique permet des analyses biochimiques et immunohistochimiques pour étudier les mécanismes de neurodégénérescence.

Cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte

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