Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Puisque cette méthode analyse les cellules à partir de la solution, elle peut être utilisée pour étudier les cellules dans un environnement proche de l’origine. Ceci inclut l’analyse des échantillons de cellules dérivés du patient. Cette technique nécessite peu ou pas de préparation d’échantillons de cellules.

Par conséquent, nous pouvons analyser les cellules individuelles en ligne dans des conditions ambiantes, ce qui nous permet d’explorer l’hétérogénéité cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour étudier les biopsies liquides à partir d’une variété d’états de la maladie différents, car elle peut analyser différents types de cellules directement isolées des échantillons de patients. Pour convertir le tube en verre à alésage unique en une sonde conique avec une pointe pointue, placez d’abord un tube de verre à alésage unique dans les pinces d’un support vertical de pipette, en centreant le verre par rapport à la bobine de chauffage et serrez pour fixer le tube en place.

La bobine chauffante est composée d’un fil de résistance au chrome nickel de calibre 18 en bobines autour d’une tige métallique 2,5 fois. Réglez le tube de verre avec le programme de température 19,5. Réglez le piston solénoïde à quatre.

Déclenchez le solenoïde pour tirer le tube de verre. Cette étape crée deux sondes fusionnées à la pointe. Utilisez des chandails pour couper environ un millimètre de l’extrémité de chaque sonde, créant un orifice d’environ 10 microns de diamètre à l’extrémité de la sonde.

Pour plier la sonde en verre pour faciliter le couplage à l’ICMP, une seule sonde SCMS mis en place. Réglez d’abord une sonde en verre tiré dans la microforge. Placez le dessus à environ trois millimètres au-dessus du fil de chauffage au platine.

Ensuite, tournez le feu sur le fil de platine à 30% de la température maximale. Pliez la sonde à environ 45 degrés de la position d’origine. Placez le microinjecteur de microscope inversé dans deux systèmes de manipulation cellulaire sur une table motorisée pour un couplage facile avec le spectromètre de masse.

Pour installer le dispositif de sélection des cellules en verre, insérez la sonde de sélection des cellules de verre à l’intérieur du support métallique du microinjecteur en plaçant la longue glissière dans le support capillaire et en serrant la vis pour fixer la sonde en place. Placez les extrémités de la sonde inclinées parallèlement à la plaque chauffante. Fixez le support métallique du micro-injecteur dans le système de manipulation cellulaire.

Placez ensuite la pointe de la sonde près du milieu de la lumière inversée du microscope. Fixez la glissière en verre contenant la sonde unique dans la pince du bras du système de manipulation cellulaire. Connectez le solvant fournissant capillaire à un syndicat de conductrice en plaçant le capillaire dans le manchon de la ferrule en plastique et en serrant le raccord du doigt.

Reliez l’autre côté de l’union conductrice à un capillaire relié à une seringue contenant le solvant d’échantillonnage en plaçant le capillaire dans la manche et en serrant le raccord. Utilisez de l’acétylonitrile avec de l’acide formique de 0,1 % comme solvant d’échantillonnage dans ces expériences. Fixez la seringue dans la pompe à seringues sur le spectromètre de masse.

Placez l’ionisation nanoélecrospray ou l’émetteur nano ESI d’environ un millimètre à l’orifice du tube de transfert d’ion étendu. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour contrôler les mouvements spacial de la sonde unique et positionner l’émetteur nano ESI centralement devant le tube de transfert d’ion étendu. Pipette les cellules de la flacon de culture cellulaire dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres.

Faites tourner les cellules à 400 fois G à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et jetez le surnatant. Resuspendez les cellules en quatre millilitres de milieu RPMI contenant le composé médicamenteux à la concentration de traitement désirée. Personnalisez les paramètres expérimentaux du spectromètre de masse.

Sous le titre de mode d’analyse du logiciel d’instrument, sélectionnez définir l’analyse. Utilisez une résolution de 60 000 m au-dessus de Z 400, un microscan de 100 millisecondes maximum de temps d’injection et un contrôle automatique des gains. Sous la pompe à seringues, sélectionnez le débit de 150 nanolitres par minute.

Sélectionnez la source NSI et appliquez une tension d’environ 4,5 kilovolts. Allumez le microscope inversé à 40 fois le grossissement sélectionné pour la plaque supérieure et la lentille inférieure. Connectez-le au port USB d’un ordinateur portable pour capturer des flux vidéo en direct.

Allumez la plaque chauffante et réglez-la à 37 degrés Celsius. Sur l’ordinateur, rendez-vous à l’onglet acquérir des données et sélectionnez en continu dans le temps acquis. Pour préparer l’échantillon aux fins d’analyse, pipette deux à trois de l’échantillon dans le couvercle d’une petite boîte de Pétri.

Placez l’échantillon au centre de la lumière à partir du microscope inversé au-dessus de la plaque chauffante. Préparez la sonde de sélection de cellules en verre pour analyse. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la sonde afin que son sommet soit concentré sous la microcope inversée dans le même plan que les cellules.

Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la pointe de la sonde de sélection cellulaire vers une cellule ciblée pour analyse. Ce processus est surveillé à l’aide du microscope inversé. Tournez doucement la poignée du microinjecteur pour ajuster la position de l’huile minérale à l’intérieur du tube.

Une aspiration douce est fournie par le microinjecteur pour fixer la cellule ciblée à la pointe de la sonde de sélection cellulaire. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la cellule à la pointe de la sonde de sélection cellulaire à la pointe de la sonde unique à l’aide d’un microscope numérique axé sur la pointe de la sonde unique pour surveiller ce processus. Les cellules K-562 non traitées sont utilisées pour établir la méthode expérimentale.

Dans une expérience typique du SCMS, des changements évidents de spectres de masse peuvent être observés à partir du transfert d’une cellule lors de la détection du contenu cellulaire et après avoir terminé la mesure. Trois pics cellulaires communs de lipide comprenant PC 34:4, PC 36:4, et PC 38:5 sont surveillés pour s’assurer que la cellule est transférée avec succès et contenu cellulaire sont détectés. L’identité de nombreux PC de l’aire de répartition de masse de 750 à 850 est confirmée à l’aide du MSMS sur des échantillons de lysate cellulaire non traités.

À l’aide de la sonde unique MS de l’ICMP, gemcitabine, taxol et OSW1 ont été détectés après incubation avec des cellules K-562. Ces résultats suggèrent que cette méthode puisse être employée pour étudier des lipides, des drogues, et des métabolites intracellulaires au niveau de cellule simple des cellules dans la solution dans un environnement presque indigène. N’oubliez pas de placer en toute sécurité la sonde de sélection des cellules de verre dans le support universel de pipette afin que l’aspiration puisse être correctement appliquée.

Cette méthode peut également être appliquée aux échantillons dérivés du patient pour distinguer les différences entre les métabolites cellulaires d’une variété de types de cellules, ce qui nous permet d’acquérir une meilleure compréhension de ces états de la maladie. Après avoir mis au point cette méthode, nous pourrions potentiellement mettre en œuvre la quantification des composés médicamenteuse au niveau d’une seule cellule. Lorsque vous travaillez avec des cellules, il est important d’avoir un équipement de protection individuelle approprié, y compris un manteau de laboratoire et des gants.

Des lunettes supplémentaires peuvent être utilisées lorsque vous travaillez avec du verre.