Name: Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour lanalyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez une plateforme intégrée de spectrométrie de masse à cellule unique couplée à un système de manipulation cellulaire pour analyser des cellules en suspension. Cette méthode permet l'étude de l'hétérogénéité cellulaire et la détection de métabolites intracellulaires, de lipides et de médicaments avec une préparation minimale des échantillons.

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Les auteurs remercient Naga Rama Kothapalli pour son travail dans le développement de la préparation de l'échantillon pour les deux cellules de suspension et les expériences de lysate cellulaire. De plus, les auteurs remercient les NIH (R01GM116116 et R21CA204706) pour leur financement.

1. Fabrication de sonde de sélection de cellules en verre
<ol><li>Convertir les tubes en verre à un seul alésage en une sonde effilée avec une pointe pointue.<ol>
<li>Placez un tube de verre à un seul perçant (ID : 0,3 mm, OD : 1,1 mm) dans les pinces d'un porte-pipette vertical, en centreant le verre par rapport à la bobine chauffante et serrez pour fixer le tube en place. La bobine chauffante est composée d'un fil de résistance au nickel-chrome de calibre 18 (60 mm de longueur) enroulé autour d'une tige métallique (diamètre de 3,90 mm) 2,5 fois.</li>
		<li>Définir le tube en verre avec le programme de température 19,5 (unité du fabricant). Ce paramètre peut être modifié pour un instrument particulier.</li>
		<li>Définir le piston solénoïde à 4 (unité du fabricant). Ce paramètre peut être modifié pour un instrument particulier.</li>
		<li>Déclencher le solénoïde pour tirer le tube de verre. Cette étape crée deux sondes fusionnées à la pointe.</li>
		<li>Utilisez une pince à épiler pour couper 1 mm de l'extrémité de chaque sonde, créant un orifice de 10 m de diamètre à l'extrémité de la sonde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pliez la sonde en verre pour un couplage facile à la configuration ICMP/single-probe SCMS.<ol>
<li>Placer une sonde en verre tirée dans la microforge, en plaçant la pointe à 3 mm au-dessus du fil chauffant de platine.</li>
		<li>Tourner la chaleur sur le fil de platine à 30% de la température maximale.</li>
		<li>Pliez la sonde à 45 degrés de la position d'origine (Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Assemblage intégré de la plate-forme de manipulation cellulaire
<ol><li>Placez le microscope inversé, le micro-injecteur et deux systèmes de manipulation cellulaire sur une table motorisée pour un couplage facile avec le spectromètre de masse.<ol>
<li>Modifier l'un des systèmes de manipulation cellulaire pour accueillir une sonde unique en remplaçant l'extrémité par une pince à bras.</li>
		<li>Utilisez une seringue en plastique avec une aiguille pour remplir le micro-injecteur d'huile minérale. Évitez les bulles dans le tube car cela affectera l'aspiration.</li>
		<li>Remplacer l'insert de scène du microscope inversé par la plaque chauffée. Fixer la plaque chauffée à 37 oC avant l'analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurez le dispositif de sélection des cellules en verre.<ol>
<li>Insérez la sonde de sélection des cellules en verre à l'intérieur du support métallique du micro-injecteur en plaçant le côté long (non plié) dans le support capillaire et en resserrant la vis pour fixer la sonde en place. Placez l'angle de la pointe de la sonde parallèle à la plaque chauffée. CAUTION: La sonde en verre est très forte et fragile, et il se brise facilement. Protégez vos yeux et soyez très prudent lors de l'insertion de la sonde dans le micro-injecteur.</li>
		<li>Fixez le support métallique du micro-injecteur dans le système de manipulation cellulaire. Placez l'extrémité de la sonde près du milieu de la lumière du microscope inversée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Créer un tube de transfert d'ion étendu pour l'inlet de spectromètre de masse
<ol><li>Utilisez un coupeur en métal pour couper un morceau de tube en acier inoxydable (OD: 0.0625 (1/16) dans, ID: 0.021 po) '250 mm de longueur.</li>
	<li>Mesurez 135 mm à partir de l'extrémité et placez un métal sauvage de sorte que 135 mm seront exposés à l'atmosphère et 115 mm seront à l'intérieur du spectromètre de masse. Fixer le sauvage à l'aide de deux clés pour le serrer.</li>
</ol>4. Coupler l'ICMP avec une configuration à sonde unique
<ol><li>Fixer la glissière en verre contenant la sonde unique dans la pince à bras du système de manipulation cellulaire. REMARQUE : Les sondes simples sont fabriquées selon un protocole48 déjà publié avec deux changements mineurs dans la présente étude : l'émetteur nano-ESI est plus long pour un couplage facile au spectromètre de masse, et les sondes simples sont collées au verre côté droit pour éviter d'interférer avec le mouvement spatial du dispositif de sélection des cellules de verre (figure 2).</li>
	<li>Connectez le capillaire solvant à une union conductrice en plaçant le capillaire dans la manche (1/16 x 0,005 po) de la ferrule en plastique et en resserrant le doigt de l'ajustement.<ol>
<li>Connectez l'autre côté de l'union conductrice à un capillaire (ID : 40 m, OD : 150 m), qui est relié à une seringue contenant le solvant d'échantillonnage, en plaçant le capillaire dans la manche (1/32 x 0,007 po) et en resserrant le raccord. Utilisez l'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique comme solvant d'échantillonnage dans ces expériences. REMARQUE : Le solvant d'échantillonnage est flexible, mais il devrait principalement contenir de l'acétonitrile (ou de l'acétonitrile avec de l'acide formique pour une meilleure ionisation) pour une lyse cellulaire à microéchelle rapide.</li>
		<li>Fixez la seringue dans la pompe à seringues du spectromètre de masse.</li>
		<li>Placez le cordon de tension d'ionisation sur un fil de cuivre attaché à l'union conductrice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez l'émetteur nano-ESI 1 mm à l'orifice du tube de transfert d'ion étendu.<ol>
<li>Utilisez le système de manipulation cellulaire pour contrôler les mouvements spatiaux de la sonde unique et positionner l'émetteur nano-ESI au centre devant le tube de transfert d'ion étendu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Préparation suspendue de l'échantillon cellulaire
<ol><li>La veille de l'analyse (18-24 h), ensemencez les cellules pour les tester dans un flacon de culture cellulaire (T25). Les cellules de leucémie myéloïde humaine de K562 sont employées comme modèles dans cette étude.<ol>
<li>Chaleur 1x phosphate tamponné saline (PBS) et Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyen complété par 10% de sérum bovin fœtal synthétique (FBS) et 1% pénicilline-streptomycine à 37 oC pendant 30 min.</li>
		<li>Graine 1 x 106 cellules dans un volume total de 10 ml en combinant les cellules avec le milieu chaud. En général, utilisez une pipette de 10 ml pour placer 8 ml de milieu RPMI dans un flacon de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette de 2 ml pour mettre 2 ml de cellules K562 confluentes le milieu pour 1 x 106 cellules.</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 jusqu'à l'analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les cellules pour l'analyse.<ol>
<li>Cellules de pipette de la culture cellulaire flasque dans un tube de centrifugeuse de 15 ml.</li>
		<li>Faites tourner les cellules à 400 x g et 37 oC pendant 5 min et jetez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 4 ml de milieu RPMI contenant le composé médicamenteux à la concentration de traitement désirée. REMARQUE: Pour l'analyse des cellules témoins, resuspendre les cellules dans 4 ml de milieu RPMI et passer à l'étape 6.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant la durée du traitement à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 400 x g et 37 oC pendant 5 min. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de PBS, et la centrifugeuse à 400 x g et 37 oC pendant 5 min. Après la rotation, jetez le supernatant. Répétez cette étape 3 fois pour minimiser la détection de la drogue à partir d'éléments extracellulaires.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 4 ml de PBS pour analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Effectuer des mesures SCMS à l'aide de la configuration ICMP/single-probe
<ol><li>Personnalisez les paramètres du spectromètre de masse pour l'expérience.<ol>
<li>Sous le titre du mode Scan du logiciel d'instrument, sélectionnez Définir L'analyse. Utilisez une résolution de 60 000 m/m à m/z 400, 1 microscan, 100 ms de temps d'injection maximum et un contrôle automatique du gain (AGC). Une plage de masse (m/z) de 100-1000 a été utilisée pour les expériences. Les paramètres peuvent être modifiés en fonction du modèle d'instrument.</li>
		<li>Sous Syringe Pump, sélectionnez un débit de 150 nL/min. Le débit doit être optimisé pour chaque expérience.</li>
		<li>Sélectionnez NSI Source et appliquez une tension de 4,5 kV. Ce paramètre doit également être optimisé pour chaque expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allumez le microscope inversé (avec un grossissement de 40x sélectionné pour la plaque supérieure et l'objectif inférieur) et connectez-le au port USB d'un ordinateur portable pour capturer les flux vidéo en direct. Allumer la plaque chauffée et la mettre à 37 oC.</li>
	<li>Sur l'ordinateur, allez à l'onglet Acquire Data, et sélectionnez en continu sous Acquire Time.</li>
	<li>Préparer l'échantillon pour l'analyse.<ol>
<li>Pipette 2-3 ml d'échantillon dans le couvercle d'un petit plat Petri (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Placer l'échantillon au centre de la lumière à partir du microscope inversé sur le dessus de la plaque chauffée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la sonde de sélection de cellules en verre pour l'analyse. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la sonde de sorte que sa pointe est concentrée sous le microscope inversé dans le même plan que les cellules.</li>
	<li>Sélectionnez une cellule individuelle pour l'analyse.<ol>
<li>Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la pointe de la sonde de sélection cellulaire vers une cellule ciblée. Ce processus est surveillé à l'aide du microscope inversé. REMARQUE : Si la pointe de la sonde de sélection cellulaire ne peut pas être focalisée dans le même plan que les cellules, il est possible que la partie pliée de la sonde ne soit pas correctement inclinée. Ajuster la position de la sonde de sélection cellulaire jusqu'à ce que les deux bouts de sonde peuvent être concentrés avec les cellules sous le microscope.</li>
		<li>Tournez doucement la poignée du micro-injecteur pour ajuster la position de l'huile minérale à l'intérieur du tube. Une aspiration douce est fournie par le micro-injecteur pour fixer la cellule ciblée à l'extrémité de la sonde de sélection cellulaire. REMARQUE : Si la cellule ne peut pas être capturée par la sonde de sélection cellulaire par la force d'aspiration, vérifiez la sonde de sélection cellulaire pour s'assurer qu'elle est entièrement insérée dans le support capillaire. De plus, inspectez les niveaux d'huile minérale dans le micro-injecteur et le tube, et expulsez l'air s'il y en a.</li>
		<li>Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la cellule à l'extrémité de la sonde de sélection cellulaire à l'extrémité de la sonde unique, à l'aide d'un microscope numérique axé sur la pointe à une seule sonde pour surveiller ce processus. En se touchant, une petite gouttelette d'acétonitrile à la pointe d'une seule sonde induit une lyse rapide de la cellule, puis le lysate cellulaire est immédiatement ionisé pour l'analyse en ligne de la SP. REMARQUE : Étant donné que la cellule sélectionnée est fixée à la pointe de la sonde de sélection cellulaire par une aspiration douce, cette cellule peut être potentiellement détachée lors de son transfert à l'extrémité de la sonde unique. Par conséquent, si les signaux ioniques des lipides cellulaires typiques (voir les résultats représentatifs ci-dessous) ne sont pas observés dans les 5 s, il est possible que la cellule soit devenue non attachée, et la sélection d'une cellule différente est nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La plate-forme intégrée de manipulation et d'analyse cellulaire est conçue pour élargir la polyvalence de la méthode MS à sonde unique, permettant une analyse rapide en ligne des cellules non adhérentes dans un environnement quasi indigène. Un avantage majeur de la technique est que la préparation minimale de l'échantillon est nécessaire, de sorte que les cellules sont analysées dans des conditions qui imitent leur état standard. En particulier, les cellules individuelles d'intérêt peuvent être identifiées visuellement et sélectionnées, minimisant l'influence de l'effet de matrice sur l'efficacité de l'ionisation de la SP tout en maintenant les cellules dans leur environnement naturel, de sorte que les résultats sont plus représentatifs des cellules indigènes statut (Figure S3). Cette technique peut être potentiellement utilisée pour étudier les cellules des patients suspendues dans les biofluides dans de futures études. Un autre avantage de cette technique est la sélection flexible du solvant d'échantillonnage. Il est important d'inclure l'acétonitrile comme solvant d'échantillonnage principal afin que la lyse micro-échelle puisse se produire rapidement. Potentiellement, des normes internes (p. ex., des composés médicamenteux isotopiques) peuvent être ajoutées au solvant d'échantillonnage pour la quantification de molécules d'intérêt (p. ex., des molécules médicamenteuses) à partir de cellules individuelles, y compris celles-ci peuvent jouer un rôle clé dans la révolution personnalisation des traitements médicamenteux à l'avenir54.
Bien que ce système intégré puisse être utilisé commodément pour analyser de larges gammes de cellules, une limitation de la méthode est que ni la sonde à sonde unique ni la sonde de sélection cellulaire n'est disponible dans le commerce; dicter la nécessité d'optimiser de nombreux paramètres (p. ex. débit, tension, longueur entre l'émetteur nano-ESI et les tubes de transfert d'ions, etc.) avant chaque expérience. De plus, en raison de la petitesse de la sonde à sonde unique et de la sonde de sélection cellulaire, la perturbation de l'environnement (p. ex., le débit d'air) peut entraîner des difficultés à établir une jonction entre les deux sondes. Une solution à court terme est la flexion de la sonde de sélection cellulaire près de l'extrémité pour minimiser la longueur de l'effilage. Les travaux futurs comprennent la construction d'un logement pour enfermer les parties critiques de la configuration afin de minimiser les effets environnementaux. En raison de la quantité limitée de contenu cellulaire et du court temps d'acquisition (2-3 s) d'une cellule, l'analyse de la SP/MS ne peut être effectuée que pour des espèces relativement abondantes. D'autres facteurs influençant la sensibilité de détection incluent l'efficacité d'ionisation supprimée due à l'introduction de la matrice avec la perte potentielle d'ions par le tube prolongé de transfert d'ion.

La biologie humaine, en particulier la biologie des maladies, est de plus en plus comprise comme le résultat d'activités au niveau des cellules individuelles, mais les méthodes analytiques traditionnelles, telles que la spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LCMS), sont généralement utilisées pour analyser échantillons préparés à partir de populations de cellules, alors que l'information moléculaire acquise ne peut pas représenter avec précision les processus chimiques au niveau des cellules individuelles. Ces méthodes standard et traditionnelles sont incapables de discerner les effets de l'hétérogénéité cellulaire sur une mesure analytique, et le processus de destruction et de mélange des cellules pour préparer le lysate conduit potentiellement à l'altération ou à la perte de la cellule composants1,2. Ces limitations des méthodes traditionnelles sont particulièrement importantes dans l'analyse des cellules des patients, dans laquelle les échantillons obtenus peuvent contenir un mélange complexe de nombreux types de cellules différentes. Pour surmonter ces carences, des méthodes d'analyse moléculaire à cellule unique, y compris des méthodes de spectrométrie de masse à cellule unique (SCMS), sont de plus en plus développées et appliquées à la bioanalyse, en particulier des métabolites cellulaires et du faible poids moléculaire. biomolécules3,4.
Les premières techniques SCMS développées utilisaient des techniques sous vide pour effectuer les analyses dans des conditions non ambiantes2,5,6,7,8,9, 10,11. Les techniques de SCMS non ambiantes sont capables d'analyser les lipides cellulaires et les métabolites, mais nécessitent un prétraitement de l'échantillon dans des conditions artificielles, et ne sont donc pas adaptés à l'analyse en temps réel. Le processus de préparation de l'échantillon pour l'analyse non ambiante comprend l'ajout de composants de matrice, et cette préparation peut modifier les composants cellulaires de leur environnement naturel12. Par conséquent, les techniques de spectrométrie de masse ambiante (SP), qui ne nécessitent pas de vide pour l'environnement d'échantillonnage, sont utilisées pour analyser les cellules dans un environnement proche de la autochtone. Ne pas avoir un environnement sous vide permet la polyvalence dans la conception expérimentale; des caméras peuvent être ajoutées pour surveiller le processus cellulaire et des techniques d'ionisation plus douces peuvent être combinées avec des techniques de séparation pour recevoir de meilleures informations de chaque expérience à celluleunique 4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
La méthode SCMS à sonde unique est une technique ambiante qui analyse les lignées de cellules cancéreuses vivantes et mammifères dans un environnement quasi-indigène21,43,44,45,46. En outre, le dispositif à sonde unique a été utilisé pour d'autres applications de spectrométrie de masse, y compris l'analyse des molécules extracellulaires dans les sphéroïdes multicellulaires et l'imagerie de la SP des tissus47,48,49 ,50,51,52. Cependant, puisque l'immobilisation cellulaire sur les substrats est nécessaire pour cette méthode, les cellules de suspension ne peuvent pas être directement analysées à l'aide de cette technique3,53. Par conséquent, le système SCMS à sonde unique ne pouvait pas être directement utilisé pour échantillonner les cellules individuelles non adhérentes, telles que les lignées cellulaires non adhérentes ou les cellules de suspension isolées du sang d'un patient ou d'autres fluides corporels54. Dans ce travail, une plate-forme intégrée de manipulation cellulaire (ICMP) est couplée à la technique SCMS à sonde unique pour analyser en ligne les cellules de suspension en ligne en direct avec une préparation minimale de l'échantillon (figure 1)46. L'ICMP se compose d'un microscope inversé pour surveiller la sélection des cellules, d'une sonde de sélection de cellules en verre, d'un micro-injecteur pour capturer des cellules flottantes individuelles, d'une plaque chauffée pour maintenir la température cellulaire, de deux systèmes de manipulation cellulaire pour contrôler mouvements de la sonde de sélection de cellules en verre et d'une sonde unique, et d'un microscope numérique pour observer le transfert cellulaire de l'extrémité de la sonde de sélection cellulaire à l'extrémité à sonde unique. La fabrication de la sonde unique est détaillée dans les publications précédentes et ne sera pas abordée ici21,48. Le système ICMP/single-probe est couplé à un spectromètre de masse à haute résolution. Cette configuration intégrée permet l'échantillonnage de cellules uniques identifiées à partir d'échantillons biologiques complexes avec des effets minimes à partir de molécules matricielles.

<table><tbody><tr><td>Acétontrile</td><td>Millipore Co.</td><td>AX0145-1</td><td>Solvant d’échantillonnage</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>6221</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>Fil de cuivre</td><td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td><td>Doux mort, rond, calibre 20, 25 pieds</td><td>Configuration d’union conductrice</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope numérique</td><td>Shenzhen D& Cie F</td><td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>Analyse Micropipette jetable, 1-5 & micro ; L</td><td>Rochester Scientific</td><td>5065</td><td>Fabrication de sonde de sélection de cellules</td></tr><tr><td>Tube en quartz à double alésage, 1.120"x0.005"x12"</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Fabrication d’une sonde unique</td></tr><tr><td>Résine époxy</td><td>Devcon</td><td>Numéro de pièce 20945</td><td>Fabrication d’une sonde unique</td></tr><tr><td>Système de manipulation de cellules Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>Transferman NK517800397-U.R.</td><td>Icmp</td></tr><tr><td>Écrou externe</td><td>VALCO*CHEMINERT</td><td>EN1</td><td>Fabrication de tubes de transfert d’ions</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388-500ML</td><td>Solvant d’échantillonnage</td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue, ID : 40 &micro ; m, OD : 100 et micro ; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP040105</td><td>Fabrication à sonde unique, configuration d’union conductrice</td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue, ID : 50 & micro ; m, OD : 150 & micro ; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150015</td><td>Installation d’union conductrice</td></tr><tr><td>HyClone Sérum fœtal bovin synthétique (FBS)</td><td>Fischer Sci SH3006603</td><td></td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microfiltre en ligne</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>M-520</td><td>Configuration d’union conductrice</td></tr><tr><td>Extracteur laser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modèle P-2000</td><td>Fabrication d’une sonde unique</td></tr><tr><td>Lampe UV LED</td><td>Foshan Liang Ya Équipement dentaire</td><td>LY-C240</td><td>Fabrication d’une sonde</td></tr><tr><td>unique Spectromètre de masse LTQ Orbitrap Thermo</td><td>Scientific</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td>Analyse</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige, Co.</td><td>MF-9</td><td>Fabrication de sonde de sélection de cellules</td></tr><tr><td>Microunion</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>M-539</td><td>Tube PEEK à union conductrice</td></tr><tr><td>, 1/32x0.005x 5ft</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>1576</td><td>Tube PEEK à configuration d’union conductrice</td></tr><tr><td>, 1/32x0.007x 5ft</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>1577</td><td>Installation d’union conductrice</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 35x10 mm</td><td>VWR</td><td>25382-334</td><td>Préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Fil de platine</td><td>Narishige, Co.</td><td>Modèle PT-A</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>Nikon</td><td>PSM-2120</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>RPMI, 1X avec Corning glutagro</td><td>Corning</td><td>10-104-CV</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes à alésage unique</td><td>Boralex</td><td>5065</td><td>Fabrication de sondes de sélection de cellules</td></tr><tr><td>Embouts en acier inoxydable, pour 1/16" OD</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>VHP-200-01x Fabrication de</td><td>tubes de transfert d’ions</td></tr><tr><td>Tubes en acier inoxydable, 1/32x 205 & micro ; m x30 cm</td><td>IDEX Santé & Science LLC</td><td>U-1128</td><td>Seringue de fabrication de tube de transfert d’ions</td></tr><tr><td>, 250 & micro ; L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Seringue d’échantillonnage</td></tr><tr><td>Fiole T25</td><td>CellStar</td><td>690160</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL bride d’interface de source ionique</td><td>New Objective</td><td>PB5500</td><td></td></tr><tr><td>Analyse ThermoPlate</td><td>TokaiHit</td><td>55R30N</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Coupe-tube, pour 1/16" acier inoxydable</td><td>SUPELCO</td><td>58692-U</td><td>Fabrication de tubes de transfert d’ions</td></tr><tr><td>Microscope de photographie numérique USB</td><td>dx.com</td><td>SO2 25 ~ 500X</td><td>Analyse</td></tr><tr><td>Résine à durcissement UV</td><td>Prime Dental</td><td>N° d’article 006.030</td><td>Fabrication d’une sonde unique</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 720</td><td>Fabrication de sonde de sélection de cellules</td></tr><tr><td>Boîtier de tension</td><td>PicoChip</td><td>PCH-A00120</td><td>Interface ICMP/MS</td></tr><tr><td>Coupe-fil</td><td>Pince d’extrémité Craftsman</td><td>4 1/2 in</td><td>Configuration de l’union conductrice</td></tr></tbody></table>

plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

La spectrométrie de masse à cellule unique (SCMS) permet la détection sensible et l'analyse précise de larges gammes d'espèces cellulaires au niveau des cellules individuelles. La sonde unique, un dispositif d'échantillonnage et d'ionisation à micro échelle, peut être couplée à un spectromètre de masse pour l'analyse rapide et en ligne des constituants cellulaires dans des conditions ambiantes. Auparavant, la technique SCMS à sonde unique était principalement utilisée pour mesurer les cellules immobilisées sur un substrat, limitant les types de cellules pour les études. Dans la présente étude, la technologie SCMS à sonde unique a été intégrée à un système de manipulation cellulaire, généralement utilisé pour la fécondation in vitro. Cette plate-forme intégrée de manipulation et d'analyse cellulaire s'emploie à une sonde de sélection cellulaire pour capturer les cellules flottantes individuelles identifiées et transférer les cellules à l'extrémité d'une seule sonde pour la lyse à microéchelle, suivie d'une analyse de spectrométrie de masse immédiate. Ce processus de capture et de transfert élimine les cellules de la solution environnante avant l'analyse, minimisant l'introduction de molécules matricielles dans l'analyse de spectrométrie de masse. Cette configuration intégrée est capable d'analyser sCMS des cellules ciblées de patient-isolés présentes dans des échantillons de fluides corporels (par exemple, urine, sang, salive, etc.), permettant des applications potentielles de l'analyse de SCMS à la médecine humaine et à la biologie de la maladie.

Tout d'abord, les cellules K562 non traitées sont utilisées pour établir la méthode expérimentale. Dans une expérience SCMS typique, des changements évidents des spectres de masse peuvent être observés à partir du transfert d'une cellule, lors de la détection du contenu cellulaire, et après avoir terminé la mesure (Figure S1). Trois pics de lipides cellulaires courants (phosphatidylcholine, PC), y compris pc(34:4)(m/z 754.536), PC(36:4)(m/z 782.567), et PC(38:5) (m/z 808.583), sont surveillés pour s'assurer que la cellule est transférée avec succès et cellulaire contenus sont détectés (Figure S2)21,43,46,55,56. Si les pics lipidiques ne sont pas vus dans les 5 s, le niveau d'huile minérale dans le micro-injecteur est modifié pour réduire l'aspiration tenant la cellule à l'extrémité de sonde de cellule-sélection ; la prudence doit être prise de sorte qu'aucune huile minérale ne soit poussée hors de la sonde de cellule-sélection. L'identité de nombreux PC dans la gamme de masse de m/z 750-850 sont confirmées à l'aide de la SP/MS sur des échantillons de lysate cellulaire non traité (Figure 3, Figure S2, Tableau 1)46.
Les cellules K562 sont également soumises à un traitement avec divers composés médicamenteux pour élargir la polyvalence de la méthode. Les cellules K562 sont incubées avec de la gemcitabine (1 M) et du taxol (1 M) pendant 1 h et osW-1 (100 nM, 1 M) pour 4 h et 2 h, respectivement. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS pour minimiser la détection des composés médicamenteux à partir de contenu extracellulaire. La contribution de la matrice (p. ex., ions du milieu de la culture cellulaire, pbS et solvant) aux spectres de masse du contenu cellulaire peut être éliminée par soustraction de données, en raison de leurs signaux ioniques significativement différents (figure S3). Les trois composés médicamenteux sont détectés à l'aide de la configuration ICMP/single-probe MS (Figure S4)46. Ces résultats suggèrent que cette méthode peut être employée pour étudier les lipides intracellulaires, les drogues, et les métabolites sur le niveau unicellulaire des cellules dans la solution dans un environnement presque indigène.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Figure 1. Configuration expérimentale pour les expériences de MS de cellules de suspension simple. (A) La plate-forme intégrée de manipulation cellulaire (ICMP) couplée à un spectromètre de masse. (B) Schématique pour l'analyse des cellules suspendues. (C) Vue expérimentale des cellules K562 à sélectionner à l'aide de la sonde de sélection cellulaire. Réimprimé avec la permission de Standke et coll.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Figure 2. Photos d'une sonde unique modifiée et d'une sonde de sélection cellulaire utilisée pour des expériences de SP à une seule cellule de suspension. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Figure 3. Spectre de masse zoomé à partir d'une seule cellule montrant l'espèce représentative(m/z 750-850). Les structures chimiques sont confirmées à l'aide de l'analyse MS/MS (Figure S1). Réimprimé avec la permission de Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Molécule de Drogue</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Erreur de masse (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabine et H] +
</td>
			<td>264.076 Annonces</td>
			<td>à 11h32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol et Na] +
</td>
			<td>876.318 Annonces</td>
			<td>2,74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 et Na] +
</td>
			<td>895.445 Annonces</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lipides cellulaires</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:4) - H] +
</td>
			<td>754.535 Annonces</td>
			<td>3,71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:3) - H] +
</td>
			<td>756.551 Annonces</td>
			<td>3,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:2) - H] +
</td>
			<td>758.569 Annonces</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:5) +
</td>
			<td>780.551 Annonces</td>
			<td>3,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:4) - H] +
</td>
			<td>782.568 Annonces</td>
			<td>2,17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:3) - H] +
</td>
			<td>784.585 Annonces</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:7) - H] +
</td>
			<td>804.551 Annonces</td>
			<td>4.1 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:6) - H] +
</td>
			<td>806.567 Annonces</td>
			<td>2,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:5) +
</td>
			<td>808.583 Annonces</td>
			<td>2,72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:4) - H] +
</td>
			<td>810.601 Annonces</td>
			<td>0 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(40:7) +
</td>
			<td>832,583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Composants cellulaires identifiés à l'aide de la configuration ICMP/Single-probe. La détection de tous les composés médicamenteux a été confirmée en comparant les résultats de la SP/SP avec le composé standard.

Une plate-forme intégrée de manipulation cellulaire est développée pour une utilisation en conjonction avec une configuration de spectrométrie de masse à sonde unique pour l'analyse en ligne des cellules de suspension individuelles dans des conditions ambiantes.

Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Puisque cette méthode analyse les cellules à partir de la solution, elle peut être utilisée pour étudier les cellules dans un environnement proche de l’origine. Ceci inclut l’analyse des échantillons de cellules dérivés du patient. Cette technique nécessite peu ou pas de préparation d’échantillons de cellules.Par conséquent, nous pouvons analyser les cellules individuelles en ligne dans des conditions ambiantes, ce qui nous permet d’explorer l’hétérogénéité cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour étudier les biopsies liquides à partir d’une variété d’états de la maladie différents, car elle peut analyser différents types de cellules directement isolées des échantillons de patients. Pour convertir le tube en verre à alésage unique en une sonde conique avec une pointe pointue, placez d’abord un tube de verre à alésage unique dans les pinces d’un support vertical de pipette, en centreant le verre par rapport à la bobine de chauffage et serrez pour fixer le tube en place.La bobine chauffante est composée d’un fil de résistance au chrome nickel de calibre 18 en bobines autour d’une tige métallique 2,5 fois. Réglez le tube de verre avec le programme de température 19,5. Réglez le piston solénoïde à quatre.Déclenchez le solenoïde pour tirer le tube de verre. Cette étape crée deux sondes fusionnées à la pointe. Utilisez des chandails pour couper environ un millimètre de l’extrémité de chaque sonde, créant un orifice d’environ 10 microns de diamètre à l’extrémité de la sonde.Pour plier la sonde en verre pour faciliter le couplage à l’ICMP, une seule sonde SCMS mis en place. Réglez d’abord une sonde en verre tiré dans la microforge. Placez le dessus à environ trois millimètres au-dessus du fil de chauffage au platine.Ensuite, tournez le feu sur le fil de platine à 30% de la température maximale. Pliez la sonde à environ 45 degrés de la position d’origine. Placez le microinjecteur de microscope inversé dans deux systèmes de manipulation cellulaire sur une table motorisée pour un couplage facile avec le spectromètre de masse.Pour installer le dispositif de sélection des cellules en verre, insérez la sonde de sélection des cellules de verre à l’intérieur du support métallique du microinjecteur en plaçant la longue glissière dans le support capillaire et en serrant la vis pour fixer la sonde en place. Placez les extrémités de la sonde inclinées parallèlement à la plaque chauffante. Fixez le support métallique du micro-injecteur dans le système de manipulation cellulaire.Placez ensuite la pointe de la sonde près du milieu de la lumière inversée du microscope. Fixez la glissière en verre contenant la sonde unique dans la pince du bras du système de manipulation cellulaire. Connectez le solvant fournissant capillaire à un syndicat de conductrice en plaçant le capillaire dans le manchon de la ferrule en plastique et en serrant le raccord du doigt.Reliez l’autre côté de l’union conductrice à un capillaire relié à une seringue contenant le solvant d’échantillonnage en plaçant le capillaire dans la manche et en serrant le raccord. Utilisez de l’acétylonitrile avec de l’acide formique de 0,1 % comme solvant d’échantillonnage dans ces expériences. Fixez la seringue dans la pompe à seringues sur le spectromètre de masse.Placez l’ionisation nanoélecrospray ou l’émetteur nano ESI d’environ un millimètre à l’orifice du tube de transfert d’ion étendu. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour contrôler les mouvements spacial de la sonde unique et positionner l’émetteur nano ESI centralement devant le tube de transfert d’ion étendu. Pipette les cellules de la flacon de culture cellulaire dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres.Faites tourner les cellules à 400 fois G à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et jetez le surnatant. Resuspendez les cellules en quatre millilitres de milieu RPMI contenant le composé médicamenteux à la concentration de traitement désirée. Personnalisez les paramètres expérimentaux du spectromètre de masse.Sous le titre de mode d’analyse du logiciel d’instrument, sélectionnez définir l’analyse. Utilisez une résolution de 60 000 m au-dessus de Z 400, un microscan de 100 millisecondes maximum de temps d’injection et un contrôle automatique des gains. Sous la pompe à seringues, sélectionnez le débit de 150 nanolitres par minute.Sélectionnez la source NSI et appliquez une tension d’environ 4,5 kilovolts. Allumez le microscope inversé à 40 fois le grossissement sélectionné pour la plaque supérieure et la lentille inférieure. Connectez-le au port USB d’un ordinateur portable pour capturer des flux vidéo en direct.Allumez la plaque chauffante et réglez-la à 37 degrés Celsius. Sur l’ordinateur, rendez-vous à l’onglet acquérir des données et sélectionnez en continu dans le temps acquis. Pour préparer l’échantillon aux fins d’analyse, pipette deux à trois de l’échantillon dans le couvercle d’une petite boîte de Pétri.Placez l’échantillon au centre de la lumière à partir du microscope inversé au-dessus de la plaque chauffante. Préparez la sonde de sélection de cellules en verre pour analyse. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la sonde afin que son sommet soit concentré sous la microcope inversée dans le même plan que les cellules.Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la pointe de la sonde de sélection cellulaire vers une cellule ciblée pour analyse. Ce processus est surveillé à l’aide du microscope inversé. Tournez doucement la poignée du microinjecteur pour ajuster la position de l’huile minérale à l’intérieur du tube.Une aspiration douce est fournie par le microinjecteur pour fixer la cellule ciblée à la pointe de la sonde de sélection cellulaire. Utilisez le système de manipulation cellulaire pour déplacer la cellule à la pointe de la sonde de sélection cellulaire à la pointe de la sonde unique à l’aide d’un microscope numérique axé sur la pointe de la sonde unique pour surveiller ce processus. Les cellules K-562 non traitées sont utilisées pour établir la méthode expérimentale.Dans une expérience typique du SCMS, des changements évidents de spectres de masse peuvent être observés à partir du transfert d’une cellule lors de la détection du contenu cellulaire et après avoir terminé la mesure. Trois pics cellulaires communs de lipide comprenant PC 34:4, PC 36:4, et PC 38:5 sont surveillés pour s’assurer que la cellule est transférée avec succès et contenu cellulaire sont détectés. L’identité de nombreux PC de l’aire de répartition de masse de 750 à 850 est confirmée à l’aide du MSMS sur des échantillons de lysate cellulaire non traités.À l’aide de la sonde unique MS de l’ICMP, gemcitabine, taxol et OSW1 ont été détectés après incubation avec des cellules K-562. Ces résultats suggèrent que cette méthode puisse être employée pour étudier des lipides, des drogues, et des métabolites intracellulaires au niveau de cellule simple des cellules dans la solution dans un environnement presque indigène. N’oubliez pas de placer en toute sécurité la sonde de sélection des cellules de verre dans le support universel de pipette afin que l’aspiration puisse être correctement appliquée.Cette méthode peut également être appliquée aux échantillons dérivés du patient pour distinguer les différences entre les métabolites cellulaires d’une variété de types de cellules, ce qui nous permet d’acquérir une meilleure compréhension de ces états de la maladie. Après avoir mis au point cette méthode, nous pourrions potentiellement mettre en œuvre la quantification des composés médicamenteuse au niveau d’une seule cellule. Lorsque vous travaillez avec des cellules, il est important d’avoir un équipement de protection individuelle approprié, y compris un manteau de laboratoire et des gants.Des lunettes supplémentaires peuvent être utilisées lorsque vous travaillez avec du verre.

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Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour lanalyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique (Vidéo) | JoVE Journal

Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

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