Préparation et caractérisation des nanoliposomes pour le piégeage des protéines globulaires hydrophiles bioactives

La préparation des nanocapsules liposomales par une technique d’extrusion sera exécutée étape par étape dans le piégeage de la tarine 48 kilodaltons globular dans la protéine hydrophilique purifiée de colocasia esculenta sera démontrée. Toutes les procédures de caractérisation des nanocapsules incluent la microscopie électronique à balayage et la diffusion dynamique de la lumière sera également suivie. Les procédures de capsulation peuvent faire face à certains défis, du choix des lipides à la réalisation d’une encapsulation à haut rendement, en gardant l’activité biologique des molécules piégées.

Protocole qui sera décrit peut surmonter certaines de ces difficultés. Pesez les composants liposome à l’aide d’un équilibre analytique. Dissoudre les composants lipidiques dans le chloroforme à l’aide d’un flacon volumétrique qui s’insère dans un évaporateur rotatif pour éviter la perte de matériel.

Remuer le mélange à 150 rPM pendant 15 minutes. Retirer le chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif. Ajustez la bouche de flacon volumétrique à la position standard pour une meilleure efficacité, tout en étant en contact avec l’eau du bain chauffant.

Définissez les paramètres selon le protocole décrit. Après environ 25 minutes, retirer le flacon et jeter le solvant évaporé de façon appropriée. Un film mince et opaque est formé et peut être facilement visualisé.

Hydratez le film lipidique dans une solution de sulfate d’ammonium contenant de la tarine à un milligramme par millilitre. Remuer le mélange pendant 40 minutes et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Puis, sonicate la suspension pendant une minute à 25 degrés Celsius, température ambiante.

Pour réduire la taille des vésicules et éviter l’agrégation, placez la membrane en polycarbonate entre deux supports de filtre pré-humides et placez-la dans le support. Insérez une seringue vide dans l’appareil, remplissez l’autre d’un millilitre de la suspension liposomale et insérez-la de l’autre côté. Effectuez une extrusion de 12 cycle à travers une membrane pore polycarbonate de 2 micromètres.

Poussez l’échantillon d’une seringue à l’autre lentement. À la fin, la suspension liposomique doit devenir claire pendant le processus d’excursion, en raison de la réduction de taille. Environ 2 millilitres de l’échantillon peuvent être perdus au cours de cette étape.

Séparez les liposomes par ultracentrifugation. Tout d’abord, peser l’échantillon dans le tube de titane et équilibrer les tubes. Vérifiez le volume minimum à remplir et, si nécessaire, ajustez le volume avec du sulfate d’ammonium.

Adapter les tubes de titane dans le seau à balançoire. Ouvrez la porte de la centrifugeuse et placez le rotor à l’intérieur. Fermez la porte de la centrifugeuse, pressez le vide et attendez que le vide atteigne de 200 à moins de 20 microns.

Ajustez les paramètres de l’écran de l’ultracentrifugeuse. Appuyez sur rappeler, vérifier les conditions, et commencer la course. Après 90 minutes, relâchez le vide en cliquant sur le bouton vide et ouvrez la porte de la centrifugeuse.

Retirez le rotor de l’intérieur. Maintenir l’échantillon d’ultracentrifugeuse sur la glace, puis séparer le supernatant de la pastille, en retournant le tube à l’envers, en centrifugeuse jetable de 59 mil pour séparer le supernatant de la pastille. Conservez le supernatant contenant la protéine non nncapsulée à quatre degrés Celsius.

Ceci sera utilisé pour déterminer l’efficacité de l’encapsulation. La pastille est présentée comme une gelée translucide. Suspendre la solution saline tamponnée HEPES de granulés et de chaleur.

S’il vous plaît vérifier le protocole pour plus d’informations. Déterminer l’efficacité de l’encapsulation par le protocole de Peterson, afin d’éviter les interférences lipidiques dans la quantification des protéines. Les échantillons doivent être analysés en triplicate.

Dans un tube de microfuge, diluer le supernatant lipsomal ou BSA à un milligramme par millilitre avec de l’eau à un volume final d’un millilitre. Ajouter doc et incuber pendant 10 minutes. Ajouter 1 millilitre de 72% de TCA et bien mélanger.

Centrifugeuse à 3000 g pendant 15 minutes à température ambiante. Jetez soigneusement le supernatant en évitant le tube vers le bas, en le posant sur un papier absorbant et en le laissant sécher. Suspendre la pastille dans un millilitre d’eau.

Bien mélanger pour s’assurer que la pastille est dissoute. Ensuite, transférez l’échantillon dans des tubes à essai. Ajouter un millilitre de reagent A, mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Ajouter 5 millilitres de reagent B, mélanger et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Déterminez l’absorption à 750 nanomètres et calculez l’efficacité de l’encapsulation. La taille moyenne et la répartition de la taille sont déterminées par la diffusion dynamique de la lumière.

Transférer les nanoparticules liposomiques dans une cuvette de dimensionnement jetable. Adapter la cuvette à l’intérieur de l’équipement. Définissez les paramètres de l’équipement.

Pour déterminer la stabilité, conservez les liposomes à quatre degrés Celsius et vérifiez régulièrement la répartition de la taille et la taille. La caractérisation liposome par balayage microscope électronique est effectuée selon Murta et Ramasamy en triplicate. Fixer le couvercle en verre glisse dans le fond d’une boîte de Pétri avec une bande.

Enrober les feuillets de couverture de Poly-L-lysine. Placez un papier filtre humide à l’intérieur de la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité et incuber pendant une heure. Rincer à l’eau distillée.

Ajouter une goutte de l’échantillon et laisser sécher pendant une heure, à température ambiante. Pour fixer les échantillons, couvrez-les de glutaraldehyde, préparé en tampon phosphaté. Placer les papiers filtre mouillés à l’intérieur de la boîte de Pétri.

Il est important de sceller la boîte de Pétri. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 48 heures. Rincer le couvercle glisse trois fois pendant cinq minutes chacun, avec le même tampon de phosphate.

Déshydratez les échantillons comme suit en lavant dans une solution croissante de concentration d’éthanol de 35% à l’éthanol absolu. Sécher chimiquement les échantillons avec de l’hexaméthyldisilazane pendant 10 minutes. L’hexaméthyldisilazane doit être soigneusement manipulé à l’intérieur d’une hotte de fumée.

Les échantillons doivent être autorisés à sécher toute la nuit à l’intérieur d’un desiccateur ou à l’intérieur du capot de fumée à température ambiante. Monter les échantillons séchés sur un talon, avec un ruban adhésif conductrice au carbone. Pulvériser les talons avec de l’or.

Enregistrez des images SEM à l’aide d’un microscope électronique à balayage, SEM, en mode vide bas et basse tension, 20 kilovolts. La figure 1 décrit la préparation nano liposome. Les phospholipides, la dope, la cheville et les chems, les principaux constituants liposome, ont d’abord été dissous sous forme de chloroforme pour obtenir le film lipidique.

Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans un tampon salin, contenant la protéine hydrophilique, la tarine, à piéger, et l’incubation doit être préformée pendant la nuit. Ensuite, la sonication et l’extrusion sont appliquées pour générer de petites vésicules peuilamellar. L’étape d’ultracentrifugation sépare la préparation liposomale des lipides libres, et la protéine non nncapsulée.

Alors que le supernatant est utilisé pour la détermination de l’efficacité de piégeage. Les nanoliposomes produits selon la méthodologie susmentionnée présentent une répartition de la taille allant de 51 à 396 nanomètres, et une taille moyenne de 155 nanomètres. La préparation est homogène, puisque l’indice de dispersion politique est de 168.

Une efficacité élevée de piégeage de 83% est atteinte si les liposomes sont extrudés par une membrane de taille pore de 2 micromètres. Des caractéristiques nanoliposome morphologiques ont été évaluées par microscopie électronique de balayage. Les liposomes devraient enfin être traités de la même manière que les cellules vivantes, afin d’obtenir des images de meilleure qualité.

Les procédures de fixation et de séchage sont importantes pour assurer la visualisation de vésicules intactes plus petites qui supportent plus de 20 kilovolts dans des conditions de vide. Les figures 2A et 2B affichent des vésicules liposomales rondes de l’échelle de 121 nanomètres, analysées à 20 kilovolts. Alors que les figures 2C et 2D affichent des échantillons mal préparés.

Les échantillons maltraités ne permettaient que l’observation de vésicules plus grandes ou endommagées, qui ne peuvent résister aux conditions de vide et ou de tension. Protocole décrit, ici, a permis la production de vésicules reproductibles affichant une forme ronde, petite surface, et la taille moyenne d’environ 150 nanomètres. La méthode peut être utilisée pour piéger des molécules complexes et de grande taille, comme une protéine tétramérique, présentant un correcteur hydrophilique.

L’auto-piégeage déficient est supérieur à 80% et le taux de fuite est très faible, inférieur à 1,5%Lorsque les nanocapsules sont stockées à quatre degrés Celsius. Nous espérons que cette vidéo vous aidera dans l’encapsulation de grosses molécules, telles que le teri.