Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

L’immunohistochimie fluorescente multiplexe identifie plusieurs types de cellules et leurs emplacements dans le tissu incorporé formalin-fixe intact de paraffine, permettant non seulement pour l’identification cellulaire mais également l’analyse spatiale de cellule à cellule. Le principal avantage de cette technique manuelle est l’utilisation d’anticorps multiples d’une même espèce sans réactivité croisée. Cette technique permet une vue approfondie des interactions des cellules immunitaires et cancéreuses dans le microenvironnement tumoral.

Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, prévoyez environ trois à quatre jours de coloration et gardez une trace complète de chaque étape pendant le processus. Une méthode plus faible du processus de coloration et de conception multiplexe est essentielle pour diminuer les pièges communs et prévus. Commencez par déparaffiner et réhydrater les diapositives.

Placez-les dans le four d’hybridation avec côté tissu vers le haut et faites-les cuire à 60 degrés Celsius pendant une heure. Sortez les glissières du four et laissez-les refroidir de cinq à dix minutes dans une grille à glissière verticale. Ensuite, utilisez un jeu de colorant de diapositives pour traiter les diapositives trois fois avec du xylène et une fois avec 100% d’éthanol, 95% d’éthanol, et 70% d’éthanol pendant 10 minutes chacun.

Lavez la grille des glissières avec de l’eau déionisée, puis fixez les glissières en les arrosant de formaline tamponnée neutre pendant 30 minutes. Laver les toboggans avec de l’eau pendant deux minutes et procéder à la récupération des antigènes. Placez la grille des glissières dans une boîte résistante à la chaleur remplie de tampon de récupération antigène pH 6.0 ou pH 9.0.

Couvrez la boîte d’une pellicule plastique et fixez-la avec un élastique. Placez la boîte dans un four à micro-ondes équipé d’onduleurs sur le bord de la plaque rotative et chauffez les glissières pendant 45 secondes à 100% de puissance suivie de 15 minutes à 20% de puissance. Laisser refroidir les glissières de 15 à 20 minutes après le micro-ondes.

Pendant ce temps, préparer des solutions de travail d’anticorps et de fluorophores. Préparer le diluant primaire d’anticorps en dissolvant 0,5 gramme de granules d’albumen de sérum bovin dans 50 millilitres de TBST ou 1X PBS. Diluer chaque solution de travail d’anticorps primaires à une concentration optimisée précédemment déterminée.

Diluer chaque fluorophore dans le fluorophore diluant à une concentration de un à 100. Le dernier jour de coloration, préparez la solution de travail DAPI en ajoutant trois gouttes de DAPI à un millilitre de TBST. Une fois les glissières refroidies, retirez-les du four à micro-ondes et enlevez la pellicule plastique.

Lavez-les avec de l’eau déionisée pendant deux minutes, suivi d’un lavage de deux minutes avec tbst. Après le lavage, séchez la lame autour du tissu avec une tâche délicate essuyer et tracer autour de l’extérieur du tissu avec un stylo barrière hydrophobe, en prenant soin de ne pas toucher le tissu ou le laisser sécher. Placez chaque glissière dans la chambre humidificateur et ajoutez environ quatre gouttes de solution de blocage au tissu.

Ensuite, incuber les glissières pendant 10 minutes à température ambiante et procéder à l’application primaire d’anticorps. Retirez la solution de blocage de chaque diapositive en tapant sur le côté de la glissière sur une pile de serviettes en papier et utilisez un chiffon de tâche délicat pour enlever la solution restante. Remettre la glissière dans la chambre humidifiée, ajouter environ 200 microlitres de l’anticorps primaire de travail et incuber pendant une heure.

Après l’incubation, laver les glissières trois fois en les insumant dans tbst pendant deux minutes par lavage. Tamponnez le TCT restant de chaque glissière et appliquez environ trois à quatre gouttes d’anticorps secondaire. Incuber les glissières dans la chambre humidifiée pendant 10 minutes.

Lavez à nouveau les glissières avec tbst et appliquez environ 100 microlitres de la solution de travail de fluorophore. Remettre les glissières dans la chambre humidifiée et incuber pendant 10 minutes. Répétez le lavage TBST, puis micro-ondes les diapositives selon les instructions manuscrites pour enlever les anticorps.

Une chose importante à retenir au cours de ce processus de coloration de plusieurs jours est de s’arrêter après l’étape de micro-ondes et de laisser les diapositives dans le tampon de récupération antigène pendant la nuit, assurant l’intégrité des tissus et des taches. Retirez la dernière application d’anticorps avec la solution de récupération de l’antigène et lavez les glissières avec de l’eau déionisée suivie du TBST pendant deux minutes par lavage. Répétez les étapes de coloration pour le reste des paires d’anticorps flurophore, puis procéder à l’application DAPI.

Appliquez environ 150 microlitres de solution DAPI de travail sur chaque glissière et incubez-les dans la chambre humidifiée pendant 10 minutes. Après l’incubation, laver les glissières avec le TBST pendant environ 30 secondes et monter les feuillets de couverture. Une fois que le support de montage a séché, appliquez le vernis clair d’ongle aux quatre coins du glissement de couverture pour le fixer.

Pour analyser le monoplex, imagez les diapositives sur le microscope avec une exposition de 250 millisecondes à l’aide de DAPI pour se concentrer. Évaluez chaque diapositive monoplexe en examinant l’intensité de fluorescence du marqueur taché et comparez cette intensité avec l’arrière-plan. Utilisez la position de diapositive dans le multiplexe final si l’intensité du marqueur taché est au moins cinq fois plus élevée que l’arrière-plan.

Lors de la coloration du multiplex, choisissez l’ordre approprié pour chaque anticorps et attribuez chaque fluorophore à un anticorps. Procéder à la coloration du multiplex comme décrit précédemment et préparer une diapositive vierge qui reçoit diluant anticorps, fluorophore diluant, et TBST au lieu de l’anticorps primaire, fluorophore, ou DAPI. Lorsque vous êtes prêt à l’image du multiplex sur le microscope, réglez l’exposition à 250 millisecondes pour tous les canaux et capturez chaque image à l’aide de DAPI pour se concentrer.

Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse pour évaluer chaque multiplex par fausse couleur fluorescente et par vue pathologique, ce qui confirmera la spécificité de chaque marqueur. Pour assurer le succès de l’analyse multiplexe, un essai monoplexe doit être effectué pour déterminer l’ordre de chaque anticorps. Par exemple, lorsque Foxp3 est en troisième position du tableau, la coloration et la colocalisation spécifiques et robustes avec CD3 sont démontrées.

En revanche, lorsque Foxp3 est à la première position, la coloration non spécifique de Foxp3 se produit. Des zones granulées et effuse de rouge sont présentes sur la majeure partie de la glissière, et l’intensité fluorescente de ces zones est faible. Une autre étape importante dans ce test est la contre-détention DEPI, qui est la base de l’identification cellulaire et une analyse plus approfondie.

Un contraste clair peut être vu entre les images avec le travail et le non-travail DAPI. Pour l’analyse multiplexe, les belles images composites ne reflètent pas toujours une tache précise. Tandis que CD3 est visualisé et montre la coloration spécifique, la vue lumineuse de pathologie de CD163 prouve que l’anticorps est non spécifique.

Une image multiplexe optimale démontre une coloration spécifique dans une image composite, et la spécificité CD3 et CD163 est confirmée avec la pathologie brightfield view. Après cette procédure, des calculs d’auto-phénotypage et d’analyse spatiale peuvent être effectués pour analyser davantage les interactions cellule à cellule. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le modelage spatial des cellules et des tissus intacts, ce qui nous permet de mieux comprendre le microenvironnement immunitaire tumoral.