Name: Optimisation, conception et éviter les pièges dans limmunohistochimie fluorescente du multiplex manuel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Apprenez l'immunohistochimie fluorescente multiplex manuelle pour identifier plusieurs types cellulaires dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Cette méthode permet l'analyse spatiale des interactions cellulaires dans le microenvironnement tumoral.

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Les auteurs tient à remercier Ed Stack, précédemment de Perkin Elmer, pour son aide à la configuration et l'optimisation de la coloration multiplexe d'origine. Les auteurs souhaitent également remercier Kristen Schmidt d'Akoya Biosciences pour les conseils à l'aide du logiciel d'analyse. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par les National Cancer Institutes of Health sous le numéro de prix P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA2414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Jeffery A. Colby Colon Cancer et Tom Liu Memorial Research Funds ont fourni un soutien supplémentaire.

Tous les travaux ont été approuvés par le comité d'examen interne de l'Université du Michigan.
1. Optimiser les anticorps primaires et la préparation des diapositives
<ol><li>Déterminer la concentration idéale d'anticorps pour le multiplexe à l'aide d'IHC conventionnel.<ol>
<li>Testez les anticorps pour le multiplexe par immunohistochimie conventionnelle manuelle (IHC)13.</li>
<li>Utilisez des tissus spécifiques qui ont un type de cellules abondante pour chaque anticorps testé comme l'utilisation de tissu amygdale pour l'essai d'anticorps CD3.</li>
<li>Utilisez la concentration de référence pour le CSI recommandée par l'entreprise, puis complétez le CSI avec des concentrations d'anticorps aux concentrations recommandées ainsi que des concentrations supérieures et inférieures à la concentration recommandée.</li>
</ol>
</li>
<li>Préparer le tissu incrusté de paraffine fixe de formaline sur des lames.<ol>
<li>À l'aide d'un microtome, couper des blocs de tissu FFPE à une épaisseur comprise entre 4 et 6 m et appliquer sur les lames chargées. REMARQUE : L'utilisation d'eau distillée assure le bon montage et l'adhérence des tissus dans tout le multiplexe.</li>
<li>Placer les lames à plat, côté tissu vers le haut, et laisser sécher à 37 oC pendant la nuit.</li>
<li>Rangez les diapositives dans une boîte à glissière loin de la température extrême jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à terminer le multiplexe.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. Méthode de coloration générale
<ol><li>Préparation de solutions de lavage et de récupération d'antigènes<ol>
<li>Préparer la solution de lavage de 0,1 % de TBST en mélangeant 9 L d'eau déionisée, 1 L de tris salin tamponné (TBS) et 10 ml de polysorbate 20.</li>
<li>Préparer les deux solutions de récupération d'antigènes (pH 6 et pH 9; Tableau des matériaux) en diluant à 1x avec de l'eau déionisée.</li>
</ol></li>
<li>Déparaffinisation et réhydratation<ol>
<li>Cuire les lames, couchées à plat, côté tissu là vers le haut à 60 oC pendant 1 h dans un four d'hybridation1. Retirer les lames du four et laisser refroidir pendant au moins 5 à 10 min, puis placer dans un carré vertical.</li>
<li>Traiter les diapositives dans les solutions suivantes de façon séquentielle : xylène en triplicate, suivie d'un seul traitement à 100 % d'éthanol, 95 % d'éthanol, et enfin 70 % d'éthanol pendant 10 min chacune à l'aide d'un ensemble de teinture sédentaires1.</li>
<li>Laver le rack de toboggans pendant 2 min avec de l'eau déionisée par submersion dans une boîte à glissière en plastique suivie d'une fixation par submersion dans une boîte à glissière en plastique remplie de formaline tamponnée neutre pendant 30 min13. Laver les toboggans dans de l'eau déionisée pendant 2 min, puis procéder à la récupération de l'antigène.</li>
</ol></li>
<li>Récupération d'antigène<ol>
<li>Placez le rack de diapositives dans une boîte résistante à la chaleur remplie à la ligne interne (environ 300 ml) avec un tampon de récupération d'antigène pH 6 ou pH 9. REMARQUE : Le tampon de récupération d'antigène peut être pH 6 ou pH 9 qui peut devoir être optimisé par épitope. Cependant, commencez par utiliser le pH 9 pour les anticorps qui se lient aux épitopes nucléaires et le pH 6 pour tous les autres anticorps.</li>
<li>Couvrir la boîte d'une pellicule plastique et utiliser un élastique pour fixer. Placez la boîte dans le four à micro-ondes au bord de la plaque rotative (le micro-ondes doit être équipé d'une technologie d'onduleur pour un chauffage uniforme). Chauffer les toboggans pour 45 s à 100% de puissance suivie de 15 min à 20% de puissance13. REMARQUE : Le traitement par micro-ondes peut avoir besoin d'être optimisé en fonction du micro-ondes utilisé.</li>
<li>Laisser refroidir les lames pendant environ 15 à 20 min.</li>
</ol></li>
<li>Préparer des solutions de travail d'anticorps et de fluorophores pendant que les diapositives refroidissent.<ol>
<li>Préparer le diluant d'anticorps primaire en dissolvant 0,5 g de granules d'albumine de sérum bovin en 50 ml de TBST. Vous pouvez également utiliser 50 ml de saline tamponnée par phosphate 1x (PBS) pour dissoudre les granules.</li>
<li>Faire de chaque anticorps primaire une solution de travail à la concentration optimisée déterminée à la section 1, dans le diluant d'anticorps primaire. Estimez environ 200 l par diapositive.</li>
<li>Préparer la solution de travail fluorophore en diluant chaque fluorophore dans le diluant de fluorophore à une concentration de 1:100. REMARQUE : Cela peut devoir être optimisé en fonction de l'anticorps. Estimez environ 100 L par diapositive.</li>
<li>Le dernier jour de coloration, préparer le 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solution de travail en ajoutant 3 gouttes de DAPI dans 1 mL de TBST.</li>
</ol></li>
<li>Coloration de glissement (lavage et blocage)<ol>
<li>Retirer la boîte du four à micro-ondes après refroidissement et enlever la pellicule plastique, laver les diapositives avec de l'eau déionisée pendant 2 min suivie d'un lavage de 2 min dans une boîte à glissière en plastique rempli TBST13.</li>
<li>Après le séchage de chaque diapositive autour du tissu avec une tâche délicate essuyer soigneusement de ne pas laisser le tissu sécher, tracer autour de l'extérieur du tissu à l'aide d'un stylo barrière hydrophobe. Ne touchez pas le tissu avec l'essuie-glace ou le stylo délicat.</li>
<li>Placez chaque lame dans la chambre humidifiée et ajoutez la solution de blocage (environ 4 gouttes) au tissu. Incuber 10 min à température ambiante (RT).</li>
</ol></li>
<li>Coloration de glissement (application primaire d'anticorps)<ol>
<li>Prenez chaque diapositive et retirez la solution de blocage en tapant sur le côté de la glissière sur une pile de serviettes en papier et en utilisant une lingette tâche délicate pour enlever l'agent de blocage excédentaire autour du tissu.</li>
<li>Reposer la glissière dans la chambre humidifiée et ajouter environ 200 l de l'anticorps primaire de travail. Incuber dans la chambre humidifiée pendant 1 h à RT.</li>
<li>Laver avec tBST pendant 2 min par submersion en triplicate13. REMARQUE : Après chaque étape de lavage, changer le TBST aidera à assurer une image plus propre.</li>
</ol></li>
<li>Coloration de glissement (application secondaire d'anticorps)<ol>
<li>Retirez le TBST restant de chaque diapositive et appliquez environ 3 à 4 gouttes d'anticorps secondaires (mélange d'anticorps conjugués HRP secondaires de lapin et de souris). Incuber 10 min dans la chambre humidifiée de la RT13. REMARQUE : Si vous prévoyez d'utiliser un anticorps primaire qui nécessite un anticorps secondaire autre que la souris ou le lapin ou si vous choisissez d'utiliser un autre anticorps secondaire, appliquez le HRP approprié conjugué secondaire aux diapositives et incubez à RT pendant 45 min. Optimisation de temps d'incubation peut être nécessaire pour l'alternative secondaire14.</li>
<li>Après l'incubation, laver avec du TBST pendant 2 min dansletriple13 .</li>
</ol></li>
<li>Coloration de glissement (application de fluorophore)<ol>
<li>Appliquer environ 100 l de la solution de travail fluorophore et incuber dans la chambre humidifiée à RT pendant 10 min13.</li>
<li>Laver avec tBST pendant 2 min en triplicate13.</li>
</ol></li>
<li>Enlèvement des anticorps<ol>
<li>Glissades à micro-ondes (45 s à 100% puis 15 min à 20%) dans la boîte résistante à la chaleur (voir l'étape 2.3.2) pour l'enlèvement des anticorps13,14. REMARQUE: Cela complète un tour du multiplexe. C'est le seul moment où le protocole peut être mis en pause. Pour mettre en pause le protocole, laissez les diapositives immergées dans le tampon de récupération d'antigène pendant la nuit à température ambiante.</li>
</ol></li>
<li>Continuer d'autres tours de coloration. Répéter les étapes 2.5.1-2.9.1 pour le reste des paires anticorps-fluorophore. Une fois que tous les anticorps et les fluorophores ont été utilisés, passez à l'article 2.11.</li>
<li>Application et montage DAPI<ol>
<li>Après le dernier tour de coloration dans le multiplexe, retirez la dernière application d'anticorps avec la solution de récupération d'antigène pH 613. Laver à l'eau déionisée suivie de TBST pendant 2 min chaque13.</li>
<li>Appliquer environ 150 l de la solution DAPI de travail sur les toboggans et incuber dans la chambre humidifiée pendant 10 min à la RT1.</li>
<li>Laver avec du TBST pendant environ 30 s et monter des couvertures avec un moniant antifade. Appliquer le vernis clair d'ongle aux quatre coins de la couverture une fois que le support de montage a séché pour fixer le coverslip (facultatif).</li>
</ol></li>
</ol>3. Détails pour la bibliothèque, les monoplexes et le multiplexe
<ol><li>Choisissez des toboggans pour la construction d'une bibliothèque de fluorophore.<ol>
<li>Pour un multiplexe de 7 couleurs, rassemblez 7 lames de tissus riches en cellules immunitaires (c.-à-d. amygdale, rate, etc.) pour la bibliothèque. REMARQUE : Choisissez des glissières de contrôle qui seront utilisées pour une bibliothèque de fluorophore avec chaque diapositive représentant chaque fluorophore unique qui sera utilisé dans le multiplexe. Les glissières de contrôle doivent avoir un épitope abondant de choix et peuvent être le même type de tissu pour chaque fluorophore.</li>
</ol></li>
<li>Diapositives de bibliothèque de taches et d'images pour une utilisation avec des monoplexets et des multiplexes.<ol>
<li>Suivez les étapes 2.1-2.9.1 à l'aide des glissières de contrôle et des glissières de tissu de contrôle de choix. Placer un fluorophore différent sur chaque toboggan à une concentration de 1:100; une diapositive ne doit contenir que du DAPI.</li>
<li>Passez à l'article 2.11 sauf omettre la coloration DAPI et utilisez plutôt TBST et monter comme décrit.</li>
<li>Après avoir laissé sécher les diapositives pendant la nuit, l'image avec tous les canaux DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, points quantiques semi-conducteurs, et isothiocyanate de fluorescéine (FITC) fixant l'exposition à 250 ms avec la fonction de protection de saturation1. REMARQUE : Les temps d'exposition peuvent être fixés à 50 à 250 ms13.</li>
<li>Téléchargez les images de la bibliothèque sur le logiciel et utilisez-les dans l'analyse des monoplexes et des multiplexes.</li>
</ol></li>
<li>Choisissez des diapositives pour les monoplexes.<ol>
<li>Choisissez des diapositives de contrôle qui ont un épitope abondant de choix basé sur des anticorps optimisés (section 1). Pour chaque tour de coloration à faire dans le multiplexe, sélectionnez ce nombre de diapositives de contrôle pour créer des monoplexes. REMARQUE : Le but du monoplex est de déterminer la meilleure position (ordre) pour chaque anticorps à utiliser dans le multiplexe.</li>
</ol></li>
<li>Stain monoplexes.<ol>
<li>Suivez les sections 2.1-2.11 à l'aide de l'anticorps primaire dans un ordre différent (position) pour chacune des diapositives. Chaque diapositive doit avoir un seul anticorps primaire appliqué à un ordre (position) différent des autres diapositives. REMARQUE : Pour chaque diapositive où la ronde appelle aucun anticorps primaire ou fluorophore, utilisez plutôt le diluant primaire d'anticorps et le diluant de fluorophore13.</li>
</ol></li>
<li>Diapositives d'image et analyse le monoplex.<ol>
<li>À l'aide du microscope et en réglant le temps d'exposition à 250 ms pour tous les canaux de capture de chaque image en utilisant DAPI pour se concentrer. REMARQUE : Les temps d'exposition peuvent être fixés à 50 à 250 ms14.</li>
<li>À l'aide du logiciel d'analyse, évaluez chaque diapositive monoplexenne en examinant l'intensité fluorescente du marqueur taché.</li>
<li>Comparez cette intensité à l'arrière-plan. S'il est au moins 5 à 10 fois plus élevé que l'arrière-plan, la position de cette diapositive est une position optimale à utiliser dans le multiplexe final.</li>
</ol></li>
<li>Choisissez des diapositives pour le multiplexe.<ol>
<li>Choisissez les diapositives d'intérêt et ajoutez une diapositive supplémentaire à utiliser comme une diapositive vierge pour la soustraction de l'autofluorescence après la coloration et l'imagerie.</li>
</ol></li>
<li>Tachez le multiplexe.<ol>
<li>Sur la base des résultats monoplex, choisissez l'ordre approprié (positions) pour chaque anticorps basé sur l'étape 3.5.3. Affectez chaque fluorophore à un anticorps. REMARQUE: Cela peut avoir besoin d'optimisation; cependant, le plan d'employer des anticorps lumineux pour les marqueurs moins abondants1,les anticorps de co-localisation devraient être assortis avec des fluorophores aux spectres éloignés les uns des autres13,et les fluorophores avec le spectre 540 et 570 ne devraient pas être co-localisés dûment aux problèmes de chevauchement spectral1.</li>
<li>Procédez avec les sections 2.1-2.11 en veillant à ce que la glissière vierge ne reçoive pas l'anticorps primaire, le fluorophore, ou DAPI, au lieu d'utiliser le diluant d'anticorps, le diluant de fluorophore, et Le TST respectivement à sa place.</li>
</ol></li>
<li>Image multiplexe et analyser pour l'intégrité de la coloration<ol>
<li>À l'aide du microscope et en réglant le temps d'exposition à 250 ms pour tous les canaux, capturez chaque image en utilisant le DAPI pour se concentrer.</li>
<li>À l'aide du logiciel d'analyse (Table of Materials), évaluez chaque multiplexe par fausse couleur fluorescente. REMARQUE : Une image claire doit démontrer clairement chaque marqueur. Si un marqueur semble diffus et granuleux ou est inexistant, il est probable que le marqueur n'a pas fonctionné et doit être re-optimisé.</li>
<li>À l'aide du logiciel d'analyse, évaluez chaque multiplexe par vue pathologique. La vue de pathologie confirmera la spécificité de chaque marqueur. Comparez à IHC précédemment optimisé (section 1).</li>
</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les spécimens intacts de tissu de la biopsie pleine de tumeur et de la résection chirurgicale restent les outils diagnostiques et prédictifs importants pour l'analyse de la maladie aussi bien que le pronostic patient. L'immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) est une technique nouvelle qui combine les avantages de l'immunohistochimie (IHC), de l'immunofluorescence (IF) et de la cytométrie de flux. Les méthodes précédentes pour sonder les cellules in situ ont permisl'évaluation des arrange...

La visualisation d'un microenvironnement intact de tumeur (TME) est essentielle en évaluant non seulement l'infiltration cellulaire dans les malignités pleines mais les interactions de cellules à cellules aussi bien. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) a émergé comme un outil efficace pour le phénotypage multi-antigène des cellules dans l'étude du cancer et des maladies associées1,2,3,4, 5,6,7. Ceci, en combinaison avec de nouveaux logiciels et programmes conçus pour analyser de grands ensembles de données, permet l'observation des interactions complexes entre les cellules1,2,4. Le facteur limitant le taux dans l'acquisition de données est souvent la qualité du tissu taché avant l'analyse.
Les techniques précédentes utilisées pour phénotype des cellules dans le TME incluent l'immunohistochimie (IHC), l'immunofluorescence (IF) et la cytométrie de flux qui présentent toutes des limitations significatives. IHC utilise des sections de tissu incrustés de paraffine fixe de formaline (FFPE) qui sont déparaffinisées et réhydratées avant d'être tachées par le plus souvent un anticorps. L'utilisation d'un anticorps secondaire lié au raifort (HRP) et d'une réaction chimique permet la visualisation d'une seule épitope antigénique8. Bien que le CiSE soit fiable et exécuté sur le tissu FFPE qui est facile à travailler avec, les limitations au spectre de lumière visible signifie que seulement un ou deux marqueurs peuvent être distingués fiables et colocalisation des antigènes tout à fait difficile8. Une façon d'élargir les marqueurs disponibles et donc les antigènes qui peuvent être sondés sur une seule section est de passer à la fluorescence qui permet l'utilisation d'une plus large gamme du spectre visuel. Pour le tissu FI, congelé ou FFPE est transféré sur des lames et des anticorps utilisés qui sont conjugués à divers fluorophores. Bien que cela augmente le nombre d'antigènes qui peuvent être sondés, il ya plusieurs limitations importantes. Tout d'abord, parce que chaque anticorps n'a généralement qu'un seul fluorophore attaché, la luminosité n'est souvent pas assez forte pour surmonter l'autofluorescence des tissus. C'est pour cette raison, la plupart des IF est effectuée sur des tissus congelés qui est coûteux à stocker et difficile à travailler avec. Un nombre limité d'étiquettes fluorescentes sont disponibles pour une utilisation en raison du chevauchement spectral et de la réactivité des espèces croisées, en particulier lorsque des anticorps non conjugués sont utilisés. La cytométrie de flux, qui consiste en un traitement des tissus frais en une seule suspension cellulaire et l'étiquetage avec des anticorps fluorescents a été l'étalon-or de l'immunophénotypage depuis des décennies9,10. Un avantage de la cytométrie de flux est la capacité d'étiqueter plusieurs anticorps sans se soucier de la réactivité croisée des espèces, car la plupart sont conjugués. Parce que les cellules sont «visualisées» par une machine et non les yeux humains, il ya beaucoup plus de fluorophores disponibles, mais cela vient avec un coût. L'indemnisation doit être faite manuellement, ce qui peut modifier considérablement les résultats produisant des populations faussement positives et négatives. La limitation la plus significative de la cytométrie de flux est que l'architecture tissulaire et, par la suite, toutes les informations spatiales sont perdues par la nécessité d'une suspension des cellules individuelles.
L'immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) à l'aide d'un microscope fluorescent automatisé en combinaison avec un nouveau logiciel combine les avantages de la cytométrie IHC, IF et flow en permettant la coloration des tissus multi-antigènes avec amplification du signal et la conservation des relations spatiales sans avoir besoin d'une compensation. Le tissu FFPE est placé sur des glissières chargées qui, après la récupération d'antigène, subissent une série d'application d'anticorps primaires à l'antigène cible d'intérêt suivi d'un anticorps secondaire avec une étiquette chimique HRP, semblable à IHC. Après le placement de l'anticorps secondaire, une réaction spécifique HRP se traduit par un fluorophore covalently liant à l'épitopie d'intérêt11. Une fois que le tissu est étiqueté, un autre cycle de chauffage des diapositives est terminé en supprimant le complexe d'anticorps primaire et secondaire précédemment appliqué laissant seulement l'étiquette fluorescente liée à l'épitotoe de tissu11. Cela permet de réappliquer de multiples anticorps de toute espèce sans se soucier de la réactivité croisée11,12. Pour minimiser tout besoin de compensation manuelle de colorants fluorescents multiples, une collection de fluorophores avec peu de chevauchement spectral, y compris une tache de compteur nucléaire est utilisé pour compléter le mfIHC. Pour tenir compte de l'autofluorescence rencontrée avec le tissu FFPE, le logiciel soustrait l'autofluorescence de l'image finale à l'aide d'une image à partir d'une diapositive vierge qui est possible en raison de la force de la fluorescence spécifique à l'antigène après fluorophore l'amplification du signal. À l'aide de nouveaux programmes conçus pour de grands ensembles de données, les emplacements cellulaires peuvent être identifiés et analysés pour le contexte spatial1,2,4. La limitation la plus importante de cette technique est le temps d'optimisation. Une méthodologie détaillée avec des instructions pour la conception expérimentale et la coloration et la stratégie d'imagerie se trouve ici. mfIHC sera utile pour les laboratoires qui ne disposent pas actuellement d'un système de coloration automatisé optimisé qui souhaite mieux comprendre le contexte spatial des interactions cellule-cellule dans le tissu FFPE intact à l'aide de la technique manuelle.

<table><tbody><tr><td>100 % éthanol</td><td>Fisher</td><td>HC8001GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td>Fisher</td><td>HC10001GL</td><td></td></tr><tr><td>95 % d’éthanol</td><td>Fisher</td><td>HC11001GL</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS135783</td><td>inForm version 2.3.0</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Mountant ThermoFisher</td><td>P36961</td><td>ProLong</td></tr><tr><td>Diamond Blocking solution</td><td>Vector</td><td>SP-6000</td><td>Bloxall</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures</td><td>Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Lingette délicate</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Diluant fluorescent</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1A01EA</td><td>Opal Diluant TSA</td></tr><tr><td>Fluorophore 520</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1487001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore 540</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1494001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore 570</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore 650</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore 690</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorophore DAPI</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1490</td><td>3 gouttes en TBST ou PBS</td></tr><tr><td>Boîte résistante à la chaleur</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-904</td><td>Boîte à lames en plastique-vert</td></tr><tr><td>Chambre humidifiée</td><td>Ibi Scientific</td><td>AT-12</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>FisherBiotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylo barrière hydrophobe</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS140089</td><td>Mantra poste de travail de pathologie quantitative</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>Panasonic</td><td>NN-A661S</td><td>avec technologie inverter</td></tr><tr><td>Formol tamponné neutre</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>10 % neutre formol tamponné</td></tr><tr><td>pH 6 tampon de récupération d’antigène</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR600</td><td>AR6</td></tr><tr><td>pH 9 tampon de récupération d’antigène</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900</td><td>AR9</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Boîte à lames en plastique</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-906</td><td></td></tr><tr><td>Pellicule plastique</td><td>Fisher</td><td>NC9070936</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-800</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Primaire anticorps CD163</td><td>Lecia</td><td>NCL-LCD163</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticorps primaire CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticorps primaire CD8</td><td>Spring Bio</td><td>M5390</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticorps primaire FOXP3</td><td>Dako</td><td>M3515</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticorps primaire pancytokératine</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>12653</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorps primaire-L1</td><td>Cellule Signalisation</td><td>13684</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Polymère opale</td></tr><tr><td>Set de coloration de lame</td><td>Microscopie</td> électronique <td>Sciences 6254001</td><td></td></tr><tr><td>Tris saline tamponnée</td><td>Corning</td><td>46-012-CM</td><td>TBS</td></tr><tr><td>Rack de lames vertical</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>X3P1GAL</tr></tbody></table>

optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

L'évaluation de microenvironnement du tissu intact pour l'analyse de l'infiltration cellulaire et de l'organisation spatiale est essentielle pour comprendre la complexité des processus de la maladie. Les principales techniques utilisées dans le passé comprennent l'immunohistochimie (IHC) et l'immunofluorescence (IF) qui permettent la visualisation des cellules comme un instantané dans le temps en utilisant entre 1 et 4 marqueurs. Les deux techniques présentent des lacunes, notamment des difficultés à colorer des cibles mal antigéniques et des limitations liées à la réactivité inter-espèces. Le CSI est fiable et reproductible, mais la nature de la chimie et la dépendance à l'égard du spectre de la lumière visible ne permettent d'utiliser que quelques marqueurs et rendent la colocalisation difficile. L'utilisation de IF élargit les marqueurs potentiels, mais repose généralement sur le tissu congelé en raison de l'autofluorescence tissulaire étendue après fixation formaline. La cytométrie de flux, une technique qui permet l'étiquetage simultané des épitopes multiples, abroge beaucoup des insuffisances de IF et iHC, cependant, la nécessité d'examiner des cellules comme une suspension de cellules simples perd le contexte spatial des cellules rejetant le biologique important Relations. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) ponts ces technologies permettant de phénotypage cellulaire multi-épitographié dans la formaline paraffine intégrée (FFPE) tissu tout en préservant l'architecture microenvironnement globale et spatiale relation des cellules dans le tissu intact non perturbé. Les fluorophores à haute intensité fluorescente qui se lient de façon covalente à l'épitotome tissulaire permettent de multiples applications d'anticorps primaires sans se soucier de la réactivité croisée spécifique des espèces par des anticorps secondaires. Bien que cette technologie ait été prouvée pour produire des images fiables et précises pour l'étude de la maladie, le processus de création d'une stratégie utile de coloration mfIHC peut être long et exigeant en raison de l'optimisation et la conception étendues. Afin de faire des images robustes qui représentent des interactions cellulaires précises in situ et d'atténuer la période d'optimisation pour l'analyse manuelle, présentés ici sont des méthodes pour la préparation des diapositives, l'optimisation des anticorps, la conception des multiplexes ainsi que des erreurs couramment rencontrés au cours du processus de coloration.

Le processus global d'obtention d'un analyse multiplexe de 7 couleurs suit un modèle répétitif. La figure 1 décrit le processus sous une forme schématique. Une fois les lames coupées et séchées ou reçues du laboratoire et cuites au four d'hybridation à 60 oC pendant 1 h, puis procéder à la déparaffinisation et à la réhydratation, fixer les lames en formaline à nouveau suivies d'une récupération d'antigène. Chaque tour de multiplexage commence à la récupération d'antigène et se termine à l'en...

L'immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.

Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

L’immunohistochimie fluorescente multiplexe identifie plusieurs types de cellules et leurs emplacements dans le tissu incorporé formalin-fixe intact de paraffine, permettant non seulement pour l’identification cellulaire mais également l’analyse spatiale de cellule à cellule. Le principal avantage de cette technique manuelle est l’utilisation d’anticorps multiples d’une même espèce sans réactivité croisée. Cette technique permet une vue approfondie des interactions des cellules immunitaires et cancéreuses dans le microenvironnement tumoral.Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, prévoyez environ trois à quatre jours de coloration et gardez une trace complète de chaque étape pendant le processus. Une méthode plus faible du processus de coloration et de conception multiplexe est essentielle pour diminuer les pièges communs et prévus. Commencez par déparaffiner et réhydrater les diapositives.Placez-les dans le four d’hybridation avec côté tissu vers le haut et faites-les cuire à 60 degrés Celsius pendant une heure. Sortez les glissières du four et laissez-les refroidir de cinq à dix minutes dans une grille à glissière verticale. Ensuite, utilisez un jeu de colorant de diapositives pour traiter les diapositives trois fois avec du xylène et une fois avec 100% d’éthanol, 95% d’éthanol, et 70% d’éthanol pendant 10 minutes chacun.Lavez la grille des glissières avec de l’eau déionisée, puis fixez les glissières en les arrosant de formaline tamponnée neutre pendant 30 minutes. Laver les toboggans avec de l’eau pendant deux minutes et procéder à la récupération des antigènes. Placez la grille des glissières dans une boîte résistante à la chaleur remplie de tampon de récupération antigène pH 6.0 ou pH 9.0.Couvrez la boîte d’une pellicule plastique et fixez-la avec un élastique. Placez la boîte dans un four à micro-ondes équipé d’onduleurs sur le bord de la plaque rotative et chauffez les glissières pendant 45 secondes à 100% de puissance suivie de 15 minutes à 20% de puissance. Laisser refroidir les glissières de 15 à 20 minutes après le micro-ondes.Pendant ce temps, préparer des solutions de travail d’anticorps et de fluorophores. Préparer le diluant primaire d’anticorps en dissolvant 0,5 gramme de granules d’albumen de sérum bovin dans 50 millilitres de TBST ou 1X PBS. Diluer chaque solution de travail d’anticorps primaires à une concentration optimisée précédemment déterminée.Diluer chaque fluorophore dans le fluorophore diluant à une concentration de un à 100. Le dernier jour de coloration, préparez la solution de travail DAPI en ajoutant trois gouttes de DAPI à un millilitre de TBST. Une fois les glissières refroidies, retirez-les du four à micro-ondes et enlevez la pellicule plastique.Lavez-les avec de l’eau déionisée pendant deux minutes, suivi d’un lavage de deux minutes avec tbst. Après le lavage, séchez la lame autour du tissu avec une tâche délicate essuyer et tracer autour de l’extérieur du tissu avec un stylo barrière hydrophobe, en prenant soin de ne pas toucher le tissu ou le laisser sécher. Placez chaque glissière dans la chambre humidificateur et ajoutez environ quatre gouttes de solution de blocage au tissu.Ensuite, incuber les glissières pendant 10 minutes à température ambiante et procéder à l’application primaire d’anticorps. Retirez la solution de blocage de chaque diapositive en tapant sur le côté de la glissière sur une pile de serviettes en papier et utilisez un chiffon de tâche délicat pour enlever la solution restante. Remettre la glissière dans la chambre humidifiée, ajouter environ 200 microlitres de l’anticorps primaire de travail et incuber pendant une heure.Après l’incubation, laver les glissières trois fois en les insumant dans tbst pendant deux minutes par lavage. Tamponnez le TCT restant de chaque glissière et appliquez environ trois à quatre gouttes d’anticorps secondaire. Incuber les glissières dans la chambre humidifiée pendant 10 minutes.Lavez à nouveau les glissières avec tbst et appliquez environ 100 microlitres de la solution de travail de fluorophore. Remettre les glissières dans la chambre humidifiée et incuber pendant 10 minutes. Répétez le lavage TBST, puis micro-ondes les diapositives selon les instructions manuscrites pour enlever les anticorps.Une chose importante à retenir au cours de ce processus de coloration de plusieurs jours est de s’arrêter après l’étape de micro-ondes et de laisser les diapositives dans le tampon de récupération antigène pendant la nuit, assurant l’intégrité des tissus et des taches. Retirez la dernière application d’anticorps avec la solution de récupération de l’antigène et lavez les glissières avec de l’eau déionisée suivie du TBST pendant deux minutes par lavage. Répétez les étapes de coloration pour le reste des paires d’anticorps flurophore, puis procéder à l’application DAPI.Appliquez environ 150 microlitres de solution DAPI de travail sur chaque glissière et incubez-les dans la chambre humidifiée pendant 10 minutes. Après l’incubation, laver les glissières avec le TBST pendant environ 30 secondes et monter les feuillets de couverture. Une fois que le support de montage a séché, appliquez le vernis clair d’ongle aux quatre coins du glissement de couverture pour le fixer.Pour analyser le monoplex, imagez les diapositives sur le microscope avec une exposition de 250 millisecondes à l’aide de DAPI pour se concentrer. Évaluez chaque diapositive monoplexe en examinant l’intensité de fluorescence du marqueur taché et comparez cette intensité avec l’arrière-plan. Utilisez la position de diapositive dans le multiplexe final si l’intensité du marqueur taché est au moins cinq fois plus élevée que l’arrière-plan.Lors de la coloration du multiplex, choisissez l’ordre approprié pour chaque anticorps et attribuez chaque fluorophore à un anticorps. Procéder à la coloration du multiplex comme décrit précédemment et préparer une diapositive vierge qui reçoit diluant anticorps, fluorophore diluant, et TBST au lieu de l’anticorps primaire, fluorophore, ou DAPI. Lorsque vous êtes prêt à l’image du multiplex sur le microscope, réglez l’exposition à 250 millisecondes pour tous les canaux et capturez chaque image à l’aide de DAPI pour se concentrer.Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse pour évaluer chaque multiplex par fausse couleur fluorescente et par vue pathologique, ce qui confirmera la spécificité de chaque marqueur. Pour assurer le succès de l’analyse multiplexe, un essai monoplexe doit être effectué pour déterminer l’ordre de chaque anticorps. Par exemple, lorsque Foxp3 est en troisième position du tableau, la coloration et la colocalisation spécifiques et robustes avec CD3 sont démontrées.En revanche, lorsque Foxp3 est à la première position, la coloration non spécifique de Foxp3 se produit. Des zones granulées et effuse de rouge sont présentes sur la majeure partie de la glissière, et l’intensité fluorescente de ces zones est faible. Une autre étape importante dans ce test est la contre-détention DEPI, qui est la base de l’identification cellulaire et une analyse plus approfondie.Un contraste clair peut être vu entre les images avec le travail et le non-travail DAPI. Pour l’analyse multiplexe, les belles images composites ne reflètent pas toujours une tache précise. Tandis que CD3 est visualisé et montre la coloration spécifique, la vue lumineuse de pathologie de CD163 prouve que l’anticorps est non spécifique.Une image multiplexe optimale démontre une coloration spécifique dans une image composite, et la spécificité CD3 et CD163 est confirmée avec la pathologie brightfield view. Après cette procédure, des calculs d’auto-phénotypage et d’analyse spatiale peuvent être effectués pour analyser davantage les interactions cellule à cellule. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le modelage spatial des cellules et des tissus intacts, ce qui nous permet de mieux comprendre le microenvironnement immunitaire tumoral.

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